Hematologia Especial -Hematologia Clássica e Molecular e Leucemia Meiloide Crônica (1)

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LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA E FARMÁCIA
Objetivos
Simplificar a utilização da Citogenética na prática do diagnóstico das Leucemias
Descrever as principais características malignas da SMD a LMC;
Caracterizar molecularmente a LMC;
Síndromes Mieloproliferativas Crônicas
 Classificação
 FAB OMS
Leucemia Mielóide Crônica (LMC) LMC Ph+:t(9;22)(q34;q11) 
 BCR/ABL
Metaplasia Mielóide Agnogênica com Mielofibrose Mielofibrose Crônica Idiopática (MF)
(Mielofibrose Idiopática)
Policitemia Vera (PV) Policitemia Vera
Trombocitemia Essencial (TE) Trombocitemia Essencial
 Leucemia Neutrofílica
 Crônica
 Leucemia Eosinofílica
 Crônica/Síndrome
 Hipereosinofílica
Citogenética Clássica e Molecular
Aspectos visionais e terminologias 
Características
A primeira detecção de alteração cromossômica em doença neoplásica deu-se em 1960 com a descrição do cromossomo Philadelphia (Ph) observado no sangue periférico de pacientes portadores de leucemia mielóide crônica (LMC) (Nowell & Hungerford, 1960).
Diversos avanços nas técnicas de cultura, análise e a introdução de uma metodologia que permite a evidenciação de bandas nos cromossomos, possibilitando que cada par seja identificado pelo seu padrão individual, permitiram que se demonstrasse que o Ph era fruto da translocação equilibrada entre os cromossomos 9 e 22 (Rowley, 1973).
Importância
Diagnóstico: a presença de uma alteração citogenética clonal (grupo de células com a mesma anormalidade) pode ajudar a diferenciar de uma situação reacional.
Classificação: as alterações morfológicas das células leucêmicas, o perfil imunofenotípico e as aberrações citogenéticas ou genético-moleculares foram incorporadas na classificação da Organização Mundial da Saúde para as leucemias agudas de linhagem mielóide e linfóide.
Prognóstico: determinados subtipos de leucemia correlacionam-se com alterações cromossômicas mais ou menos específicas e que conferem melhor ou pior prognóstico para os pacientes. São exemplos de bom prognóstico a leucemia promielocítica aguda (LPA) com t(15;17) ou rearranjo gênico PML/RARA, a leucemia mielóide aguda com t(8;21) ou ETO/AML1 e a M4 (mielomonocítica) com eosinofilia e inversão ou translocação do cromossomo 16 ou rearranjo CBFbeta/MYH11. Inversamente, os subtipos M1 ou M2 com alterações do cromossomo 7, sejam elas deleções ou monossomias, têm prognóstico desfavorável, bem como as leucemias com componente monocítico e envolvimento do 11q23 (gene MLL).
O estudo das alterações cromossômicas das células neoplásicas é importante por auxiliar no diagnóstico, classificação, prognóstico, acompanhamento evolutivo, orientação e monitoração terapêuticas, monitoração de transplante de MO, além de permitir saber quais os oncogenes envolvidos e entender a biologia da doença.
Importância
Evolução: uma anomalia presente ao diagnóstico pode posteriormente, sofrer alterações adicionais, configurando evolução clonal com repercussão clínica representada por resistência terapêutica ou evolução para uma fase mais agressiva da moléstia.
Orientação terapêutica: certas alterações citogenéticas encontradas em determinados subtipos de leucemias podem indicar o tratamento mais adequado, por exemplo, os casos de LPA com translocação entre os cromossomos 15 e 17. Tais pacientes se beneficiam do uso do ácido transretinóico (ATRA) que leva à maturação dos blastos com conseqüente melhora da coagulopatia. Nas raras situações de LPA em que não se observa esta t(15;17) ou seu equivalente molecular, o rearranjo PML/RARA, podem estar ocorrendo translocações variantes, como t(5;17), t(11;17) ou outras que também respondem ao ATRA, exceto a t(11;17)(q23;q22).
Monitoração terapêutica: o paciente que ao diagnóstico apresenta dada anormalidade deve ter, por ocasião da remissão clínica ou hematológica, o desaparecimento daquela alteração para então ser considerado em remissão citogenética. Posteriormente, caso haja o reaparecimento da mesma anomalia, detecta-se a recaída. Caso o reaparecimento do clone original venha acrescido de outras alterações (evolução clonal), pode-se considerar doença mais agressiva ou resistente à terapêutica inicial.
O estudo das alterações cromossômicas das células neoplásicas é importante por auxiliar no diagnóstico, classificação, prognóstico, acompanhamento evolutivo, orientação e monitoração terapêuticas, monitoração de transplante de MO, além de permitir saber quais os oncogenes envolvidos e entender a biologia da doença.
Importância
Monitoração do transplante de medula óssea: a citogenética tem um papel de destaque, seja diagnosticando a pega do enxerto (particularmente nos casos de transplante com doador e receptor de sexos diferentes), seja constatando o desaparecimento do clone maligno original.
Entendimento molecular: graças ao estudo molecular nos locais de quebras cromossômicas foi possível descrever diversos proto-oncogenes ou oncogenes que são ativados ou desregulados pela alteração citogenética, desencadeando ou facilitando o processo neoplásico maligno.
O estudo das alterações cromossômicas das células neoplásicas é importante por auxiliar no diagnóstico, classificação, prognóstico, acompanhamento evolutivo, orientação e monitoração terapêuticas, monitoração de transplante de MO, além de permitir saber quais os oncogenes envolvidos e entender a biologia da doença.
Métodologia
O estudo é feito nas células cancerígenas já que as alterações são adquiridas e, consequentemente, os demais tecidos não afetados apresentarão cariótipo normal. Diferentemente da análise cromossômica constitucional que é feita em linfócitos do SP, na pesquisa de anormalidades em leucemias a medula é o material ideal para estudo. Alternativamente, pode-se utilizar ou o SP contendo células blásticas.
Assim, as células de leucemias agudas, por exemplo, que têm um ciclo celular curto, podem ser fácil e rapidamente estudadas, bastando interromper sua divisão celular. É o chamado método direto (sem a necessidade de cultura). Tal divisão é interrompida pela adição de colchicina, uma substância que despolimeriza a tubulina do fuso mitótico bloqueando as células em metáfase. 
Há diversas formas de preparar lâminas para análise citogenética e todas visam obter um bom espalhamento cromossômico. Em seguida estas lâminas podem ser coradas com corante convencional (Giemsa ou Leishman) ou por bandas. A coloração convencional permite apenas a contagem dos cromossomos, fornecendo idéia geral da presença de aberrações grosseiras.
. 
Metodologia
Os cromossomos são divididos pelo centrômero em braço curto (p) e braço longo (q). Quando o centrômero está no meio, é designado metacêntrico; quando tende para uma extremidade, submetacêntrico e quando próximo da extremidade, acrocêntrico. As extremidades são denominadas telômeros e há as constrições secundárias que são compostas de heterocromatina.
A descrição do cariótipo segue regras precisas estabelecidas pelo Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética (ISCN,1995). Um cariótipo normal é designado 46,XX ou 46,XY. A presença ou a ausência de um cromossomo será grafada com sinal de mais ou de menos antes do número do cromossomo, ex: 47,XX,+21 ou 45,XX,-7. A translocaçãoentre dois cromossomos é designada pela letra minúscula t seguida, entre parênteses, dos dois cromossomos envolvidos separados por ponto e vírgula e novamente entre parênteses o braço e a banda respectivamente de cada cromossomo envolvido, ex: 46,XX,t(8;21)(q22;q22). A Tabela 1 mostra outros aspectos da nomenclatura. Confira, no final deste capítulo, algumas figuras de translocações e anomalias cromossômicas.
Mais importânte nas Leucemias é saber se há Translocações
Citogenética da LMC
A LMC é doença clonal maligna de célula progenitora hematopoética caracterizada por intensa proliferação medular e periférica, esplenomegalia e anemia. Cerca de 95% dos pacientes apresentam a translocação entre os cromossomos 9 e 22, resultando no Philadelphia (Ph) nas células da MO. A análise molecular demonstra a presença do oncogene ABL no 9q34 e do BCR no 22q11. O ponto de quebra no gene ABL é variável, enquanto no BCR fica numa região de 5,8kb (M-bcr) que tem 5 exons inicialmente denominados b1 a b5 e, posteriormente, exons 12 a 16. Com a translocação, o rearranjo desses dois genes produz uma proteína quimérica de p210 kD na grande maioria dos casos, e p190 numa minoria (igual aos casos de LLA), quando a quebra no BCR ocorre numa região chamada de m-bcr, isso é, no intron entre os exons e1 e e2. Estes casos raros tendem a ter componente monocítico proeminente.
É uma substância presente no tecido tumoral, no sangue ou em outros fluidos biológicos, produzida 1º pelo tumor ou, 2º pelo paciente( à presença do tumor). 
É utilizada para diferenciar tecidos normais de neoplásicos e que possa ser caracterizada e/ou quantificada.
 especificidade (marcador específico) - a maioria detectada em diferentes tumores do mesmo tecido (marcadores associados).
Antígenos (sAg ) tumor- específicos e presentes nas células neoplásica-tumores espontâneos ou induzidos por agentes químicos ou infecções.
carcinógeno → indução de oncogenes (dormentes).
Antígenos tumor-associados : presentes tanto em células neoplásicas quanto em células normais. Diferença - quantidade ou forma apresentada . 
Marcador Tumoral
O marcador tumoral ideal
 ser altamente específico (tipo de neoplasia) e sensível (detecção da presença de um pequeno número de células neoplásicas) 
 diagnóstico precoce estudos populacionais. 
ser produzido apenas pelas células neoplásicas - facilmente detectado no sangue ou em fluidos biológicos.
 
Atualmente a maioria dos marcadores tumorais disponíveis,
Limitada capacidade de diagnóstico primário do processo neoplásico. 
Alguns possuem sensibilidade e especificidade suficientes ao acompanhamento da evolução da doença no paciente previamente diagnosticado e submetido a algum tipo de tratamento.
Marcador Tumoral
Imunologia-impotância
 IMUNOGLOBULINAS (sIg) E COMPLEMENTO: Produzidos por linfócitos- Resposta humoral específica contra infecções
 IMUNIDADE CELULAR ESPECÍFICA: Interação das células acessórias(apresentadoras de antígenos- sAg) c/ linfs. T. Protege o organismo contra infecções bacterianas, fúngicas, virais e parasitárias.
 IMUNIDADE -INFECÇÕES: Mecanismo de defesas-vulneráveis do desenvolvimento de infecções graves ,muitas vezes fatais.
Sist. Imune: combinação -fatores da própria doença de base ;
 - quimio(radio) terápicos.
 NEUTROPENIA
↓ № Absoluto de neutrófilos abaixo de 1.000/ L → infecções ;
Veloc. e № neutrófilos cai.
Marcadores
 IMUNOFENOTIPAGEM
Identificação de Ag na membrana, citoplasma ou núcleo celular ;
Ac (conjugados) : a peroxidase e a fosfatase alcalina ;
Reação Ag-Ac (complexo Anti-Ac antienzima)
 IMUNOFENÓTIPO
Ac monoclonais→ linf.B secretor Ig específica (Ac) + Plasmócito, linhagem imortal( céls.murinas) ;
Hibritona (cél. Híbrida) – imortal(cultura) secereta ↑ Ac →Ag(específico)
Diagnósticos: Sist. de Nomeclatura sAg
Sist.CD (Cluster Of Differentiation)- lista № Ag-Ac 
Marcador Bioquímico
Enzimas ou isoenzimas 
 da atividade total ou variações no padrão habitual de distribuição das suas diferentes formas processo neoplásico 
baixa especificidade -tipo de marcador
A dosagem de alguns hormônios: detecção e monitorização de determinados tumores. 
Ocorre de duas maneiras distintas: 
por produção aumentada pelo tecido endócrino, normalmente produtor ;
produção ectópica, por tecido normalmente não produtor de hormônios.
TABELA 3
ENZIMAS COMO MARCADORES TUMORAIS
Fosfatase alcalina
Osso, fígado, testículo (seminoma)
Desidrogenase láctica
Sangue (leucemia linfoblástica), fígado
Enolase neuronal específica
Pulmão (células pequenas), pâncreas
Fosfatase ácida
Próstata
PSA
Próstata
y-glutamil transferase
Fígado (metástases)
QUADRO 1
MARCADORES TUMORAIS ANTES DOS IMUNOENSAIOS
DOENÇA
MARCADOR
Neuroblastoma e Feocromocitoma
Aminas neurogênicas
Síndrome carcinóide
Metabólitos da serotonina
Coriocarcinoma
Gonadotrofina coriônica
Mieloma múltiplo
Proteína de Bence-Jones
Sarcoma osteogênico
Fosfatase alcalina
Câncer de próstata
Fosfatase ácida prostática
Câncer de pâncreas
Amilase
Marcador Bioquímico
QUADRO 2
MARCADORES AMPLAMENTE UTILIZADOS E/OU APROVADOS PELO FDA
DOENÇA
MARCADOR
Carcinoma de próstata
PSA, Fosf. ácida prostática
Carcinoma de ovário
CA-125
Carcinoma de cólon
CEA
Carcinoma hepatocelular
AFP
Tumor de células germinativa20s
BhGC, AFP, Fosf. alc. placentária
Leucemia
Transferase terminal
Carcinoma de mama
Receptor hormonal
*
Leucemia Mielóide Crônica (LMC)
Leucemias
 
 Neoplasia (hematopatias malígnas ).
Comprometem as linhagens linfóides ou mielóides , macrófagos e seus prercursores ou os mastócitos;
Blastos ou progenitores primitivos (leucêmicos) – morfologia e imunofenótipo das céls. Eritróides, monocíticos ,megacariocíticos ou mieloblastos, ou promielócitos .
Acúmulode leucóictos malignos na MO e no sangue ( insuficiências de céls. Normais) 
Anemia, neutropenia e trombocitopenia ;
Infiltração de órgãos. 
 
Características da LMC
Leucemia Mielóide Crônica
O cromossomo Ph e o gene abl-bcr
bcr-abl
abl
PROTEÍNA DE FUSÃO COM ATIVIDADE DE TIROSINO QUINASE
22
bcr
Ph (or 22q-)
9
9 q+
1
p210Bcr-Abl
p185Bcr-Abl
2-11
2-11
Cromossomo 9
c-bcr
Cromossomo 22
c-abl
2-11
Éxons
Íntrons
Pontos de ruptura do CML
Pontos de ruptura do ALL
t(9;22) translocação
Estrutura do gen bcr-abl
Adaptado de Moiraghi, 2008
Leucemia Mielóide Crônica
 Alteração molecular
Fonte: Hematology Digital Image Study Sets
Marcadores Hematológicos
Morfologia e fisiologia
Refere-se a padrões determinados pela FAB de ao menos 20% de blastos no sangue ou na medula óssea;
São entidades celulares que apresentam alterações específicas próprias das leucemias.
Todas as doenças de caracter crônico na M.O começam com as Stem cells
Diagnóstico
	Ultimamente, LMC é diagnosticada pela detecção do cromossomo Filadélfia(cromossomo Ph). Esta anormalidade cromossômica característica pode ser detectada pela citogenética, pela técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) ou pela reação em cadeia de polimerase (PCR)
Leucemia Mielóide Crônica
Fisiopatogênese
Translocação dos cromossomos 9 e 22: t(9;22)
Produto desta translocação: cromossomo Filadélfia (Ph ou Ph1)
Resulta na fusão dos genes ABL e BCR
Gera um gene híbrido
Produz, desta forma, uma proteína com elevada atividade tirosinoquinase.
Leucemia Mielóide Crônica
Incidência
 1,6 casos por 100.000 habitantes/ano
 Representa 14% de todas as leucemias
Idade mediana ao diagnóstico
 Quinta a sexta década 
Prevalência com relação ao sexo
 Sexo masculino: 1,4:1,0
Fator de risco
 Radiação Ionizante
Cromossomo Filadélfia pelo FISH
Black RJ et al. Eur. J Cancer. 1997, online
Hemograma
Os leucócitos são representados principalmente por neutrófilos (50-70%). Os eosinófilos e basófilos são igualmente numerosos. O resto dos leucócitos é representadade precursores imediatos dos granulócitos: metamielócitos, mielócitos e promielócitos sobretudo dos neutrófilos. 
Os mieloblastos são pouco numerosos (1-5%) e seu aumento pode ser um sinal da transformação aguda. Os glóbulos vermelhos: a anemia pode ser nula ou moderada, podendo ser achados eritroblastos. 
	Plaquetas: seu número é freqüentemente aumentado.
Leucemia Mielóide Crônica
 Diagnóstico Laboratorial
 Sangue Periférico
Leucocitose > 25.000/ul
Granulócitos em todas as fases de maturação
Predominam mielócitos e formas maduras
Mieloblastos e Promielócitos menos que 10%
Basofilia é comum. Eosinofilia é menos comum
Anemia normocítica normocrômica discreta
Trombocitose – 30% e Trombocitopenia – 10% 
Leucemia Mielóide Crônica
Sangue Periférico
Fonte: Hematology Digital Image Study Sets
 http//medocs.mcdavis.edu/IMD/420A/dib/myelo/index.htm
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Referencia
Leucemia Mielóide Crônica
Sangue Periférico
Fonte: Hematology Digital Image Study Sets
 http//medocs.mcdavis.edu/IMD/420A/dib/myelo/index.htm
Leucemia Mielóide Crônica
Sangue Periférico
Fonte: Hematology Digital Image Study Sets
 http//meddocs.mcdavis.edu/IMD/420A/dib/myelo/index.htm
Mielograma
A medula óssea apresenta-se rica em células (hipercelular), ela mostra hiperplasia do tecido granulopoiético.
Outros exames: a taxa de ácido úrico do sangue e sua excreção urinária são geralmente aumentadas
Citogenética e biologia molecular: Cariótipo: 95% dos casos de LMC são cromossomo Filadélfia positivo (Ph+) e 5% são Ph-; FISH: fusão do Abl e Bcr; reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR).
Leucemia Mielóide Crônica
 Diagnóstico Laboratorial
 Medula Óssea
Hiperplasia granulocítica marcada;
Número de blastos inferior a 10%;
Displasias mínimas ou ausentes;
Hiperplasia megacariocítica e hipoplasia eritróide são comuns;
Biópsia de M.O para confirmar a hiperplasia e avaliar fibrose.
Mielograma
Medcurso, 2007 online
Leucemia Mielóide Crônica
Medula óssea
Fonte: Hematology Digital Image Study Sets
 http//medocs.mcdavis.edu/IMD/420A/dib/myelo/index.htm
Leucemia Mielóide Crônica
 Diagnóstico Laboratorial
 Citoquímica
Fosfatase Alcalina dos Neutrófilos diminuída
 Bioquímica
Concentrações séricas de ácido úrico e Desidrogenase lática elevadas
Leucemia Mielóide Crônica
Leucemia Mielóide Crônica
Citomorfologia na LMC:
- Atipia 
- Fase crônica 
- Fase Blástica
Atipia celular na LMC
Neutrófilo Segmentado
Granulócito Bastão
Mielócito Hipogranúlico
Promielócito
Color Atlas of Hematology: Theml, Diem, Haferlach.
Atipia celular na LMC
Mieloblasto
Mieloblasto
Promielócito Tamanho Reduzido
Mielócito Hipogranúlico
Eosinófilo Imaturo
Eosinófilo Imaturo
Basófilo Atípico
Color Atlas of Hematology: Theml, Diem, Haferlach.
Atipia celular na LMC
Mieloblasto com atipia de núcleo
Granulócito Bastão
Granulócito Basofílico
Color Atlas of Hematology: Theml, Diem, Haferlach.
Atipia celular na LMC
Mieloblastos com cromatina característica
Megacariócito hiperlobulado
Color Atlas of Hematology: Theml, Diem, Haferlach.
Morfologia medular na LMC
Micromegacariócitos
Micromegacariócitos
Color Atlas of Hematology: Theml, Diem, Haferlach.
Características da fase crônica
Leucocitose comumente acima de 25.000/mm3;
Predomínio de formas celulares mais maduras (bastões e granulócitos) e mielócitos;
Basofilia é um achado comum. Eosinofilia é menos comum;
Anemia normocítica e normocrômica;
Trombocitose em 30% dos casos e trombocitopenia em 10% dos casos. 
Fase Crônica (SP)
www.hmds.org.uk/insets/cml_cp1.htm 
Fase Crônica (MO)
www.hmds.org.uk/insets/cml_cp2.htm 
Características da fase acelerada
Leucocitose superior a 100.00/mm3não responsiva ao tratamento;
Trombocitopenia (<100.000/mm3) ou trombocitose persistente;
Blastos e promielócitos maiores que 10% e inferiores a 20%;
Basófilos excedendo 20% no sangue periférico.
Características da fase blástica
Percentagem de blastos superior a 20% no sangue periférico ou das células nucleadas da medula óssea;
Focos de blastos intra ou extra medular;
Em 70% dos casos a linhagem blástica é mielóide, porém em 20-30% dos casos os blastos podem ter origem linfóide. A agudização para múltiplas linhagens também pode ocorrer. 
Fase Blástica (SP)
Fonte: Gorman R, Finiewicz K. In Atlas of Cancer 
Fase Blástica (Mielóide)
www.hmds.org.uk/insets/cml_bt.htm 
Fase Blástica (Megacariocítica)
www.hmds.org.uk/insets/cml_bt.htm 
Fase Blástica (Linfóide)
www.hmds.org.uk/insets/cml_bt.htm 
Vamos a prova!! 
	antes... depois... 
Jamais   
Referências
Hoffbrand A.V. ,Moss P.A.H & Pettit J.E. ; Fundamentos em Hematologia ; 5ª Edição ;Edtr ª Artmed ; 2008 .
Zago M.A. ,Falcão R.P. ,Pasquini R. ;Hematologia-Fundamentos e Prática ; 1ª Edição ;Edtr ª Atheneu ; 2004 .
Medicina Avançada ; diagnóstico e laboratório-Marcadores Tumorais Bioquímicos na prática médica ;Shirlet de Campos ; http://www.drashirleydecampos.com.br/noticias/9426 ;