Aula 5 - Analise Cromossomica

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Análise Cromossômica: CARIOTIPAGEM
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Diagnóstico de Alterações Cromossômicas
Diagnóstico clínico
Cariotipagem
Hibridização de ácidos nucléicos
- Southern blotting
- Hibridização in situ por fluorescência (FISH – fluorescence in situ hybridization)
PCR ( Reação da Polimerase em Cadeia)
Sequenciamento
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O que é a Cariótipo?
CARIÓTIPO  conjunto cromossômico típico de uma espécie quanto ao número, morfologia e organização do genoma.
Alterações possíveis
Numéricas e estruturais
Citogenômicas
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MITOSE
MEIOSE
n DE CROMOSSOMOS
GENOMA
ERROS
ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS
Formação indivíduo
Linhagem celular
não-disjunção meiótica/mitótica
NUMÉRICAS
ESTRUTURAIS
CROMOSSOMOS AUTOSSÔNICOS
CROMOSSOMOS SEXUAIS
AMBOS
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APLICAÇÕES MÉDICAS DA ANÁLISE DOS CROMOSSOMOS 
 Diagnóstico Genético Pré-implantacional (PGD) - Blastômeros 
 Diagnóstico Pré-natal (DPN) - Suspensão celular : cultura de amniócitos, vilosidade coriônica, sangue de cordão, restos ovulares
 Diagnóstico Clínico Pós-natal - Suspensão celular : cultura de linfócitos, fibroblastos de pele
O KT constitucional pode ser estudado em diferentes momentos do desenvolvimento
Alterações cromossômicas adquiridas (Leucemias, Câncer) - Suspensão celular : cultura de: medula óssea, tumores
 Mutagênese - monitoramento à exposição de agentes mutagênicos
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Estudo cromossômico
Citogenética clássica
Citogenética Molecular
Cariótipo por Bandamento G
Metáfases , Núcleos interfásicos
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t(9;22)
Hibridização de ácidos nucléicos
FISH
Leucemia Mielóide Crônica 
t(9;22)
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Citogenética Molecular
Cariotipagem espectral (SKY)
Citogenética de tumores
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Cariótipo por Bandeamento G
Método Padrão em CITOGENÉTICA
Giemsa
Adenina e Timina do DNA
 Bandas Claras
Eucromatina
Ricas em Guanina e Citosina
Mais genes ativos
G +
G -
 Bandas Escuras
Heterocromatina
Ricas em Timina e Adenina
Menos genes ativos
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Cariotipagem
Ciclo celular - Mitose
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Material a ser analisado
(sangue)
Adicionar droga que estimula a divisão celular
(no caso dos linfócitos – fitoemoglutinina)
Adicionar droga que bloqueia a divisão celular em metáfase
(colchicina)
Romper as células com uma solução hipotônica
Fixar e gotejar sobre as lâminas para o microscópio
Coloração
(Giemsa)
Cariotipagem
Microscópio
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Cariótipo por Bandeamento G
Sangue como material biológico
Coletar 3 a 5mL de sangue em tubo ou seringa usando heparina sódica como anticoagulante
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Seringa Heparinizada
(Heparina Sódica)
Tubo a Vácuo 
(Heparina Sódica)
Meio de Cultura
Preparação do material
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Meio de Cultura e Sangue
Identificados
Enriquecimento 
do Meio de Cultura
Suplemento para 
Meio de Cultura
FLUXO LAMINAR 
Preparação da Cultura
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10 a 12 gotas de sangue 
ou Camada de Linfócitos
Homogenizar 
Cuidadosamente
Estufa de Cultura 
por 72 horas
Preparação da Cultura
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80 a 100 l de colchicina
Estufa por 45 a 60 min.
Colchicinação
Bloqueia a separação dos cromossomos replicados condensados- inibição da Mitose
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Metáfase
Máximo de condensação
Zona Equatorial
Início da separação
Unidas apenas pelos centrômeros que começam a se dividir
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Após 72hs de Incubação
 Centrifugar
Após centrifugação
Retirar sobrenadante 
Adicionar 5ml Hipotônica
Estufa por 20 min
Hipotonização
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Adicionar 0,5ml de fixador 3:1
(metanol:ác. Acético)
Homogenizar cuidadosamente 
e centrifugar
Fixação inicial
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Retirar sobrenadante 
Adicionar 5 ml Fixador 3:1
Homogeneizar bem
 (agitador tubos)
Centrifugar
Fixação
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Retirar sobrenadante 
Adicionar 5 ml Fixador 
Homogeneizar bem
 (agitador tubos)
Centrifugar
Fixação
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Deixar 1 ml de suspensão
Pingar as lâminas no banho maria 
e deixar secar
ou fora do banho maria
Flambar no bico de bunsen
Preparação das lâminas
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Reagentes Banda G
Deixar agir por 10 a 15 min
Lâminas Coradas
Coloração das lâminas
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Cariotipagem
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Cariotipagem
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X
X
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Cariotipagem
Paciente do sexo masculino normal
Cariótipo: 46,XY
Metáfase
Pareamento Cromossômico
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Cariotipagem
Paciente do sexo feminino normal
Metáfase
Pareamento Cromossômico
Cariótipo: 46,XX
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Cariotipagem
Euploidia (3n triploidia)
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Cariotipagem
Trissomia do 21 ou Síndrome de Down
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Cariotipagem
Translocação Robertsoniana 
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Cariotipagem
Síndrome do XYY ou Síndrome do Duplo Y
47,XYY
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