Analise de Proteínas em Alimentos

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3/7/2007
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
nos alimentos proteínas podem estar combinadas com lípidos e hidratos 
de carbono
na maioria dos alimentos conteúdo de proteína dado por N x 6.25%
procedimento mais comum para determinar proteínas:
determinação de um elemento ou grupo pertencente à proteína
elementos – C ou N
grupos – aminoácidos e ligações peptídicas
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
análise pode ser dificultada pela presença de N não proteico:
aminoácidos livres
pequenos peptídeos
ácidos nucleicos
fosfolídos
açúcares aminados
porfirinas
algumas vitaminas
alcalóides
ácido úrico
ureia
NHŸ
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
análise de proteínas importante para:
rotulagem
investigação de propriedades funcionais
determinação de actividade biológica
conteúdo proteico total
teor de uma dada proteína
teor proteico durante isolamento e purificação de proteínas
determinação de azoto não proteico
composição em aminoácidos
valor nutricional de uma proteína
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Análise de carbono
digestão mais fácil que para N
menores erros no resultado
maior quantidade relativamente a N
factor de correcção mais constante que para N
maior dificuldade em separar os C proteicos dos restantes
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Análise de azoto
mais utilizada
proteínas têm em média 16% N
transformação de azoto para proteína – 6.25
16 g N ––––– 100 g proteínas
n g N ––––– x g proteínas
erros quando teor em N ʌ 16%
tabelas com factores de conversão específicos
n x 100
x = = n x 6.25
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Análise de azoto
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Kjeldahl – determinação através do N total
mais utilizado na determinação de proteína
diversas modificações ao longo do tempo
método determina N orgânico total
proteico e não proteico
na maioria dos alimentos, N não proteico em muito pequena 
quantidade
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento
amostra triturada e homogeneizada
aquecimento da amostra com H2SO4
digestão converte N (excepto o que está em forma de 
NO3 ou NO2) em amónia
amónia está na forma de NHŸ ligado a SO‚
permanece em solução
restantes compostos orgânicos convertidos em CO2 e 
H2O
Amostra (N orgânico) + H2SO4 ↓ (NH4)2SO4
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento
adiciona-se NaOH conc.
converte sulfato de amónio em amónia gasosa
aquece-se para libertar amónia num volume conhecido 
de ácido bórico
forma borato de amónio
(NH4)2SO4 + NaOH ↓ NH3
NH3 + H3BO3 ↓ (NH4)3BO3
(NH4)3BO3 doseado com HCl
indicador usado para determinar ponto de 
viragem
(NH4)3BO3 + HCl ↓ NH4Cl + H3BO3
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento
concentração de H+ necessária para alcançar ponto de 
viragem é equivalente à concentração de N no 
alimento
usa-se um branco
subtrair N do reagente do N da amostra
cálculo:
s b
v - vx
%N = x x 14 x 100
1000 m
m – peso da amostra (g)
x – HCl (mol)
vs – vol. titulação da amostra (cm
3)
vb – vol. titulação branco (cm
3)
14 – PM azoto (g/mol)
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Kjeldahl
vantagens:
universal
muito preciso
boa reprodutibilidade
barato
micro Kjeldahl para determinar g
desvantagens:
não mede apenas proteína
diferentes factores de conversão
risco de utilização de H2SO4 conc. a temperatura elevada
risco de utilização de catalisadores
demorado (pelo menos 2 h)
menos preciso que método do biureto
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
modificações do método
adição de óxidos de metais para acelerar a digestão da 
mistura
mistura de Hg, Cu, Se
Hg mais eficaz
adição de sulfato de potássio
aumenta ponto de ebulição da mistura na digestão
acelera o processo
adição de sulfito ou tiossulfato de sódio ao hidrolisado diluído
ajuda a libertar azoto do Hg
adição de ácido bórico
recolha da amónia libertada em excesso de ácido bórico
borato de amónio formado titulado com um ácido 
padronizado
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
modificações do método
micro Kjeldahl
permite determinar g de N
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Kjeldahl
reagentes
carbonato de sódio
alaranjado de metilo 0.1%
HCl 0.1 N
NaOH 0.02 N
NaOH conc.
ác. bórico 2%
fenolftaleína
verde de bromocresol 0.1% em álcool
HCl conc.
mistura de catalisadores
96% K2SO4, 4% CuSO4.5H2O
H2SO4 conc.
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento:
digestão da amostra
juntar num balão de microkjeldahl de 100 mL
200 mg amostra
1.5 g mistura de catalisadores
3 mL H2SO4 conc.
colocar balão no digestor
digerir 20 min
tirar balão e arrefecer até temperatura ambiente
juntar 5 mL H2O2
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
digestão da amostra
repor balão no digestor
aquecer devagar até se tornar translúcido e não haver 
resíduos carbonizados
arrefecer 15-20 min à temperatura ambiente
arrefecer em água da torneira
juntar devagar, com agitação, 40 mL H2O
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento:
destilação da amostra
amostra transferida para destilador
adicionar excesso NaOH
NH4HSO4 passa a NH3 (volátil)
colocar ~7 g NaOH num Erlenmeyer de 50 mL
juntar 11 mL H2O
agitar até dissolver NaOH
arrefecer sob água corrente
colocar ~10 mL ác. bórico num erlenmeyer
adicionar 4 gotas vermelho de metilo e 6 gotas verde 
de bromocresol
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
destilação da amostra
erlenmeyer com ác. bórico e indicadores colocado à saída 
do destilador
recolher ~⅔ do destilado no erlenmeyer
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento:
titulação da amostra
titular o destilado com solução padronizada de HCl 0.1 N
nº equivalentes de ácido consumido igual a nº 
equivalentes de amónia
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Dumas
determinação de N total, após combustão da amostra
700 – 800 ºC
medida volumétrica do N gasoso
GC com detector de condutividade térmica (TCD)
N determinado convertido em teor de proteína
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Dumas
procedimento:
amostra de massa conhecida (100-500 mg) levada a combustão na 
presença de O2
libertação de CO2, H2O e N2
CO2 e H2O removidos por absorção em colunas
teor de N medido após passagem dos gases restantes por outra 
coluna
equipada com detector de condutividade térmica
detector calibrado com EDTA ou outro composto puro com 
concentração de N conhecida
necessário converter concentração de N em teor proteico
factores de conversão variam com composição da proteína
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Dumas
vantagens:
mais rápido que Kjeldahl
< 4 min por medida; Kjeldahl 1-2 h
não requer compostos tóxicos nem catalisadores
permite automatização (até 150 amostras)
aplicável a todos os tipos de alimentos
desvantagens:
custo inicial elevado
mede N proteico e não proteico
requer amostras pequenas
difícil obter amostras representativas
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica
exigem curvas de calibração com diversas proteínas
mede-se absorção ou turbidez
amostra medida ao mesmo comprimento de onda
obtém-se concentração proteica da amostra
diferentes métodos divergem nos grupos químicos responsáveis pela 
absorção ou turbidezligações peptídicas
grupos aromáticos
grupos alcalinos
agregados proteicos
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
substâncias com 2 ou mais ligações peptídicas formam um complexo 
roxo com sais de cobre (Cu2+) em soluções alcalinas
proteína misturada com reagente do biureto
reagente contém sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio e 
potássio
após 15-30 min, mede-se absorvância a 540 nm
intensidade da cor proporcional à quantidade de proteína
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
procedimento:
5 mL reagente biureto misturado com 1 mL solução de proteína
1-10 mg proteína/mL
mistura estabiliza à temperatura ambiente 15-30 min
se não estiver transparente requer filtração ou centrifugação
absorvância lida a 540 nm contra branco do reagente
fazer curva de calibração com albumina de soro bovino (BSA)
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
vantagens:
bastante específico
não tem problemas de interferentes
simples, rápido (< 30 min) e mais barato que Kjeldahl
determina proteína
desvantagens:
requer curva de calibração
cor não é idêntica para todas as proteínas
desvios causados menores que noutros métodos colorimétricos
menos sensível que outros métodos espectrofotométricos
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowry (fenol)
combina reagente do biureto com reagente de Folin-Ciocalteau
interacção das proteínas com fenol e cobre em condições 
alcalinas
reacção colorimétrica
oxidação (catalisada por cobre) de aminoácidos 
aromáticos por um reagente heteropolifosfato
cor azul, medida entre 500-750 nm e comparada 
com curva padrão
pequeno pico a ~500 nm
determinação de concentrações proteicas 
elevadas
pico maior a ~750 nm
determinação de menores concentrações
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowry
procedimento:
amostra diluída
adição de tartarato de sódio e potássio/Na2CO3
incubar à temperatura ambiente 10 min
adição de CuSO4/tartarato Na K/NaOH
incubr 10 min à temperatura ambiente
adicionar reagente de Folin
misturar e incubar a 50 ºC, 10 min
ler absorvância
curva de calibração com BSA para calcular teor proteico
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowry
vantagens:
10-20 vezes mais sensível que determinação por UV
100 vezes mais sensível que método do biureto
relativamente rápido (1-1.5 h)
bastante específico
poucos interferentes
sacarose, em elevada concentração, lípidos, tampão 
fosfato, ...
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowry
desvantagens:
intensidade da cor pode variar com composição em 
aminoácidos e com condições analíticas
não é completamente proporcional à concentração 
proteica
destrói a amostra
múltiplas operações
necessita período de incubação entre adição de reagentes
requer curva padrão
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométrico directo
maioria das proteínas absorve a 280 nm
presença de tirosina, triptofano e fenilalanina
aminoácidos aromáticos
teor nos alimentos é relativamente constante
absorvância permite calcular a concentração proteica
proteínas solubilizadas num tampão ou base
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométrico directo
vantagens:
rápido e simples
relativamente sensível
mais que método do biureto
não destrutivo
poucas interferências
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométrico directo
desvantagens:
resultados com imprecisão
dependem da concentração dos 3 a. a. na composição da 
proteína
sais de amónio não interferem
ácidos nucleicos podem interferir
problema reduzido por medição da absorvância a 2 
280 nm, 260 nm
preparação da amostra muito longa
funciona melhor em proteínas purificadas ou extraídas
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométrico
determinação pode ser feita por fluorescência
triptofano é fluorescente
método inicialmente desenvolvido para leite e lacticínios
também utilizado em produtos cárneos e vegetais
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos turbidimétricos
medida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada 
por um agente precipitante
ácido tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido 
sulfosalicílico
vantagens:
rápido
simples para amostras líquidas
proteína está em solução
desvantagens:
não aplicável em amostras sólidas
proteína tem que ser extraída para uma solução
resultados variam com tipo de proteína
pode haver precipitação de outras substâncias
requer calibração com padrões
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-binding
utilização tem aumentado
grãos de cereais, sementes de oleaginosas, lacticínios e 
outros produtos animais e vegetais
amostra tratada com excesso de corante aniónico
azul brilhante de Coomassie
pH da proteína ajustado (< pI)
proteínas carregadas positivamente
corante e proteína reagem quantitativamente
corante liga-se aos grupos catiónicos dos resíduos His, Arg, 
Lys e aos grupos terminais amina livres
corante muda de vermelho para azul
max passa de 465 nm para 595 nm
formação de complexo insolúvel, separável por filtração ou 
centrifugação
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-binding
excesso de corante em solução medido colorimetricamente
diferença dá indirectamente teor de proteína
teor de proteína na amostra proporcional à quantidade 
de corante complexado
Corantecomplex = Coranteinit – Corantelivre
para cada alimento constrói-se uma tabela de conversão
permite obter % de proteína
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-binding
procedimento:
corante dissolvido em 95% EtOH
acidificado com ácido fosfórico 85%
amostras com 1-100 g/mL proteína e BSA adicionadas ao 
reagente
ler absorvância a 595 nm contra branco do corante
calcular concentração da proteína a partir da curva de 
calibração
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-binding
corantes utilizados:
laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo, preto amino 
10B
boa correlação com método de Kjeldahl
equipamentos fazem:
reacção colorimétrica
filtração do complexo insolúvel
medida colorimétrica da solução filtrada
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-binding
vantagens:
simplicidade
rapidez (2 min)
menos interferências que método de Lowry
mais sensível que método de Lowry
exactidão
reprodutibilidade
preço
desvantagens:
dependência do equipamento
cor varia com tipo de proteína
dificuldade na escolha do padrão
complexo pode ligar-se a cuvetes d quartzo
usar vidro ou plástico
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do ácido bicinchoninico (BCA)
proteínas reduzem iões Cu2+ a Cu+ em condições alcalinas
Cu+ complexa com reagente BCA (verde) tornando-o púrpura
procedimento:
misturar solução de proteínas com reagente BCA
pH 11.25
incubar 30 min a 37 ºC, ou 2 h à temperatura ambiente, ou
30 min a 60 ºC
escolha depende da sensibilidade pretendida
temperatura mais elevada dá melhor resposta
ler absorvância a 562 nm contra branco do reagente
curva padrão com BSA
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do ácido bicinchoninico
vantagens:
sensibilidade semelhante a método de Lowry
método micro BCA mais sensível que Lowry
um único passo de mistura
reagente mais estável que o de Lowry
poucas interferências
desvantagens:
cor instável com tempo
qualquer composto capaz de reduzir Cu2+ a Cu+ interfere
açúcares redutores interferemmais que no método de Lowry
concentrações elevadas de (NH4)2SO4 interferem
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica
vantagens:
rápidos
simples
sensíveis a baixas concentrações
desvantagens:
requerem soluções transparentes e diluídas
maioria das amostras exigem preparação complexa
homogeneização
extracção por solventes
centrifugação ou filtração
em alimentos processados pode ser difícil extrair as proteínas
absorvância depende das sequências de aminoácidos
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Outros métodos instrumentais
medição de propriedades físicas brutas
medição da adsorção de radiação
medição da dispersão de radiação
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição de propriedades físicas brutas
densidade
densidade das proteínas superior à da maioria dos 
componentes dos alimentos
aumento do teor proteico provoca aumento da 
densidade
teor proteico determinado através da medição da 
densidade
índice de refracção
índice aumenta com aumento do teor proteico
teor proteico determinado por medição do índice de 
refracção
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição da adsorção de radiação
UV-Vis
IV
grupos químicos no esqueleto polipeptídico possuem 
vibrações características
6.47 m, 3300-3500 nm, 2080-2220 nm, 
1560-1670 nm
absorção de radiação IV a determinados 
comprimentos de onda usada para quantificar 
concentração proteica numa amostra
permite análise rápida e on-line
não destrutivo
não necessita muita preparação de amostra
elevado custo incial
requer calibração demorada
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição da adsorção de radiação
NMR
usado para determinar concentração total de proteínas
medição da área dos picos correspondentes à fracção 
proteica permite determinar o teor proteico
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição da dispersão de radiação
dispersão de luz
turbidez de uma solução directamente proporcional à 
concentração de agregados de proteínas presentes
dispersão de ultra-sons
velocidade e absorção de ultra-sons proporcionais à 
concentração de agregados proteicos presentes
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Outros métodos instrumentais
vantagens:
não destrutivos
pouca preparação de amostra
medidas rápidas e precisas
desvantagens:
requerem curvas de calibração
dependem do tipo de proteína e do alimento
válidos apenas para analisar alimentos com composições 
simples
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos físicos
pouco utilizados
índice de refracção
densidade específica
viscosidade
tensão superficial
condutividade
polarização
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Comparação dos métodos
aplicações oficiais
métodos Kjeldahl e Dumas e em alguns casos UV-Vis
controlo de qualidade
métodos rápidos e simples
IV
estudos fundamentais em laboratório
métodos rápidos, precisos e sensíveis a baixas concentrações
UV-Vis
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Comparação dos métodos
factores a ter em conta:
métodos Kjeldahl, Dumas e IV requerem pouca preparação 
de amostra
métodos de UV-Vis requerem muita preparação
métodos Dumas e Kjeldahl medem N orgânico total
método do biureto mede ligações peptídicas
método de Lowry mede ligações peptídicas e aminoácidos 
aromáticos
IV é um método indirecto
métodos UV-Vis são mais sensíveis
métodos de Lowry, dye-binding, BCA e UV mais sensíveis que 
Kjeldahl, Dumas e biureto
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Comparação dos métodos
factores a ter em conta:
métodos IV são rápidos (< 1 min)
método de Dumas é automatizado e rápido (< 5 min)
métodos UV-Vis permitem analisar diversas amostras 
simultaneamente
disponibilidade de equipamento
rigor da medida
técnica destrutiva ou não
facilidade de operação
processamento do alimento (aquecimento,...) pode reduzir a 
eficácia da extracção de proteínas
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
proteínas separadas com base em:
diferentes propriedades físico-químicas
tamanho
carga
adsorção
solubilidade
estabilidade térmica
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
métodos de purificação mais comuns:
precipitação
cromatografia de permuta iónica
cromatografia de afinidade
cromatografia de exclusão molecular
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
escolha da técnica de separação depende de:
objectivo da análise
quantidade de amostra disponível
pureza desejada
equipamento disponível
tipo de proteínas presente
preço
ter em conta que estrutura tridimensional da proteína pode ser 
alterada durante separação
efeito das condições ambientais sobre a estrutura da proteína e 
suas interacções
pH
força iónica
solvente
temperatura
...
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos baseados em características de solubilidade
solubilidade determinada pela sequência de aminoácidos
condiciona tamanho, forma, hidrofobicidade e carga eléctrica
proteínas solubilizadas ou precipitadas selectivamente por 
alteração de:
pH
força iónica
constante dielétrica
temperatura
usados quando grandes quantidades de amostra disponíveis
rápidos
baratos
não influenciáveis por outros componentes dos alimentos
frequentemente usados como 1º passo em processos de 
separação
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Salting out
proteínas, em solução aquosa, precipitadas quando concentração 
salina excede um valor crítico
água “liga-se” ao sal, deixando de estar disponível para 
hidratar as proteínas
(NH4)2SO4, NaCl, KCl
procedimento:
sal adicionado, em concentração ligeiramente inferior à 
necessária para precipitar a proteína de interesse
solução centrifugada
remoção de proteínas menos solúveis
adição de sal em concentração ligeiramente superior à 
necessária para precipitar a proteína
proteína precipita
separada por centrifugação
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Salting out
concentrações elevadas de sal contaminam a solução
remoção por diálise ou ultrafiltração
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Precipitação isoeléctrica
proteínas têm carga 0 no ponto isoeléctrico (pI)
proteínas agregam e precipitam devido à não existência de 
repulsão electrostática
diferentes sequências de aminoácidos originam diferentes pI
ajuste do pH da solução permite separar proteínas por 
precipitação selectiva
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Fraccionamento por solvente
solubilidade de proteínas depende da constante dielétrica do 
solvente
a pH e força iónica constantes
diferentes interacções electrostáticas entre grupos carregados
quando constante dieléctrica diminui, aumentam 
interacções electrostáticas entre grupos carregados
solubilidade das proteínas diminui
constante dieléctrica de soluções aquosas diminui quando se 
adicionam solventes orgânicos
EtOH, acetona
diferentes proteínas requerem diferentes quantidades de 
solvente orgânico
separação proteica
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Fraccionamento por solvente
trabalhar a ≤ 0 ºC para impedir desnaturação proteica
aumento de temperatura quando se misturam solventes 
orgânicos com água
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Desnaturação de proteínas contaminantes
proteínas desnaturam e precipitam quando:
temperatura muito elevada
pH muito ácido ou muito básico
separação baseada na resistência de proteínas a condições 
extremadas
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos baseados em características de adsorção
cromatografia de afinidade ou de permuta iónica
proteínas possuemdiferentes afinidades para fase 
estacionária ou eluente
coluna aberta ou HPLC
métodos comuns em laboratório para separar proteínas e 
aminoácidos
pouco comuns a nível comercial
caros e não permitem separação rápida de grandes 
quantidades
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de permuta iónica
mais usada
adsorção reversível das proteínas carregadas a um suporte sólido 
carregado
para proteínas usam-se mais resinas aniónicas
condições (pH e força iónica) ajustadas para favorecer ligação da 
proteína de interesse
outras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais 
rapidamente
proteína de interesse eluída com outra solução tampão
diferente pH ou força iónica
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de permuta iónica
aplicações:
separação de proteínas no laboratório
quantificação de aminoácidos
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de afinidade
fase estacionária consiste numa molécula ligada covalentemente 
a um suporte sólido 
ligando possui afinidade específica e reversível para uma 
dada proteína
condições tampão que favorecem afinidade
outras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais 
rapidamente
proteína de interesse eluída com outra solução
técnica mais eficaz para separar proteínas
cara, devido a necessidade de colunas com ligandos 
específicos
optimização do método requer ajuste de muitas variáveis
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de afinidade
aplicações: 
aplicações laboratoriais
purificação de glicoproteínas
utilização de lectinas como ligantes
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos baseados em diferença de tamanho
PM de proteínas variam entre 104 – 106 D
separação não depende do PM mas do raio de Stokes
raio médio de uma proteína em solução
depende da estrutura tridimensional
para proteínas com mesmo PM, raio de Stokes:
proteína globular compacta < proteína enrolada flexível 
< proteína rígida
separação por:
diálise
ultrafiltração
cromatografia de exclusão molecular
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Diálise
utiliza membranas semi-permeáveis
permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa 
dimensão
solução de proteínas colocada num tubo de diálise selado
tubo colocado num grande volume de água ou tampão
lentamente agitado
solutos de baixo PM saem do tubo; restantes ficam
método lento (até 12 h)
mais usado em laboratório
frequentemente usado para remoção de sais de soluções usadas 
em salting-out
também usada em permuta de tampões
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Diálise
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Ultrafiltração
utiliza membranas semi-permeáveis sob pressão
permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa 
dimensão
solução de proteínas colocada numa célula contendo a membrana
aplica-se pressão
solutos de baixo PM atravessam membrana; restantes 
ficam
diversas membranas disponíveis
mais rápido que diálise
usada em laboratório e em escala comercial
utilizada para concentrar soluções de proteínas, remover sais, 
trocar tampões ou fraccionar proteínas
nanofiltração pode ser usada para mesmos fins
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de exclusão molecular
separa proteínas por PM
solução de proteína atravessa coluna empacotada com material 
polimérico poroso
dextrano, agarose
moléculas maiores que os poros excluídas
atravessam rapidamente a coluna
restantes moléculas retardadas
moléculas eluídas por ordem decrescente de tamanho
existem diversos empacotamentos, para separar proteínas com 
diferentes PM
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de exclusão molecular
usada para:
remoção de sais
trocar tampões
fraccionar proteínas
cálculo do PM
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de exclusão molecular
PM de proteínas desconhecidas determinadas por comparação 
dos seus volumes de eluição com os de proteínas de PM 
conhecido
gráfico de volume de eluição vs. log(PM) dará uma recta
PM não está directamente relacionado com raio de Stokes
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Separação por electroforese
separação baseada no tamanho, forma e carga
migração de moléculas carregadas através de um campo eléctrico
electroforese de zona é a mais usada com proteínas
proteínas de uma mistura separadas por migração num gel
gel de poliacrilamida mais comum
alternativas – amido e agarose
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese não desnaturante
solução tamponizada de proteínas colocada num gel poroso
poliacrilamida, amido, agarose
voltagem aplicada ao gel
proteínas deslocam-se no gel numa direcção que depende do 
sinal da sua carga e a uma velocidade que é função da 
grandeza da carga
deslocamento também depende da fricção
relação entre tamanho da molécula e tamanho dos poros 
do gel
voltagem aplicada x carga molecular
mobilidade = 
fricção molecular
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese não desnaturante
quanto mais alta a voltagem ou a carga da proteína, mais 
esta se move
quanto mais pequena a molécula ou maior o tamanho dos 
poros do gel, mais rapidamente ela se move
separação baseada numa combinação da carga, tamanho e forma 
da proteína
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese desnaturante (SDS-PAGE)
sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
proteínas separadas segundo PM
proteínas desnaturadas antes da análise
misturadas com mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio 
(SDS)
mercaptoetanol quebra ligações bisulfito
SDS forma ligações hidrofóbicas com proteínas
desdobramento da estrutura, devido a repulsão entre 
grupos com carga negativa do SDS
cada proteína liga-se aproximadamente à mesma 
quantidade de SDS por unidade de 
comprimento
carga por unidade de comprimento e 
conformação idêntica em todas as proteínas
Java applet
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese desnaturante
movimento no gel depende do tamanho da proteína
proteínas mais pequenas movem-se mais rapidamente
adiciona-se um corante à solução da proteína
azul de bromofenol, …
pequena molécula crregada que migra à frente das 
proteínas
no fim da electroforese, gel tratado com corante
permite visualizar proteínas
distância percorrida pela proteína
mobilidade relativa = 
distância percorrida pelo corante
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese desnaturante
mobilidade relativa comparada com curva de calibração
gráfico log(PM) vs. mobilidade relativa é linear
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese
aplicações:
parte do processo de purificação
caracterização proteica
equipamentos comerciais permitem purificar grandes 
quantidades de proteína
determinação da composição proteica de um alimento
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese de focagem isoeléctrica
um dos métodos de separação de proteínas com melhor 
resolução
modificação da electroforese
proteínas separadas segundo carga, num gel com um gradiente 
de pH
proteínas migram para o local em que pH = pI
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese de focagem isoeléctrica
gradiente de pH gerado por anfólitos
pequenos polímeros contendo simultaneamente grupos 
carregados positiva e negativamente
mistura de anfólitos tem milhares de polímeros com gama 
variada de valores de pH
anfólitos adicionados ao gel antes da polimerização
após formação do gel, aplica-se uma voltagem e anfólitos 
migram segundo o seu pH
gradiente de pH
Análise de Proteínas e Azotonão proteico
Electroforese bidimensional
utilização conjunta de focagem isoeléctrica e SDS-PAGE
melhora resolução de misturas complexas de proteínas
capaz de separar >1000 proteínas
proteínas separadas numa direcção segundo carga
focagem isoeléctrica
depois separadas na direcção perpendicular segundo tamanho
SDS-PAGE
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
utilização de um tubo capilar em vez de um gel
fluxo electroosmótico no tubo influencia separação de 
proteínas
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
procedimento:
amostra introduzida no recipiente de entrada
aplica-se baixa pressão ou voltagem através do capilar
carregar o volume pretendido de amostra na coluna
bandas de proteínas detectadas por detectores semelhantes 
aos usados em HPLC
UV-Vis, fluorescência, condutividade
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
1. pre-albumin 
2. Albumin 
3. alpha 1-Acid-Glycoprotein 
4. alpha 1-Antitrrypsin 
5. Haptoglobin
6. alpha2 macroglobulin 
7. Hemopexin
8. Transferrin
9. Complement 
10. Gamma 
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
utilização obretudo laboratorial
3 variantes usadas em separação de proteínas:
electroforese de zona capilar
electroforese capilar em gel
focagem isoeléctrica capilar
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
electroforese de zona capilar
semelhante a PAGE
proteínas separadas em solução no interior do capilar 
cheio com um tampão do pH pretendido
uma única “corrida” capaz de separar moléculas 
carregadas e não carregadas
alterando pH ou força iónica do tampão
varia fluxo electroosmótico
variação da velocidade de migração das proteínas
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
electroforese capilar em gel
proteínas separadas por tamanho
proteínas desnaturadas e dissociadas na presença de SDS 
e agente redutor
separação em capilares cheios com gel de poro específico
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
focagem isoeléctrica capilar
anfólitos formam gradiente de pH no capilar
proteínas separadas com base no pI
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
determinação da composição em aminoácidos das proteínas
hidrólise da amostra com ácido forte
libertação dos aminoácidos
aminoácidos separados por métodos cromatográficos
permuta iónica
cromatografia de afinidade
cromatografia de absorção
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidrólise
HCl 6N, 24 h
diferente comportamento dos aminoácidos durante hidrólise
triptofano destruído
metionina, cisteína, treonina e serina progressivamente 
degradados
duração da hidrólise influencia resultados
asparagina e glutamina convertidos em ácidos aspártico e 
glutâmico
não se conseguem quantificar
isoleucina e valina hidrolisadas mais lentamente que 
restantes aminoácidos
tirosina e metionina podem ser oxidados
procedimentos especiais de hidrólise necessários para 
evitar erros
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidrólise
percas de treonina e serina calculadas por hidrólise da 
amostra em 3 períodos de tempo
24, 48, 72 h
compensação para degradação de aminoácidos
extrapolação para tempo zero, assumindo cinética de 1ª 
ordem
valina e isoleucina calculadas a partir de um hidrolisado de 
72 h
cisteína e cistina convertidos em ácido cístico
mais estável
triptofano sofre hidrólise alcalina
depois cromatografado
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidrólise
hidrólise de peptídeos e proteínas origina normalmente 16 a. a.
fosfoaminoácidos requerem processos especiais
análise semi-quantitativa de PSer, PThr e PTyr
HCl 6N; 1-4 h; 110 ºC
derivatização pré ou pós-coluna
análise lenta e resultados frequentemente maus
não é uma análise de rotina
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidrólise
HCl em fase de vapor
amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaio
tubo colocado num frasco com 200 L HCl 6N e um cristal de 
fenol
tapar frasco com válvula
desarejar 3 vezes com Ar
fechar válvula
aquecer frasco 1 h a 150 ºC
finda a hidrólise, abrir válvula
transferir tubos com amostra para outro recipiente
secar sob vácuo
guardar a -20 ºC, sob Ar, até análise
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidrólise
HCl em fase líquida
amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaio
adicionar 100 L HCl 6N, contendo 4% ácido tioglicólico
desarejar sob vácuo e selar à chama
aquecer 22 h a 110 ºC
arrefecer o tubo
abrir, secar sob vácuo e analizar
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
separação por permuta iónica
eluição com gradiente
tampões com aumento gradual de pH e força iónica
derivatização pós-coluna
após eluição, a. a. quantificados por reacção com nihidrina
nihidrina reage com grupo amina primária dos a. a.
produto de cor púrpura
medição espectrofotométrica a 570 nm
prolina a 440 nm
método automatizado e adaptado para utilização com HPLC
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
separação por permuta iónica
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
separação por RP-HPLC
a. a. hidrolisados e derivatizados antes da cromatografia
derivatização com feniltiocarbamil, ...
quantificação por espectroscopia UV
detecção de quantidades picomolares de a. a.
tempo de análise ≤ 30 min
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Análise de Proteínas e Azoto não proteico
quantificação
utilização de padrão interno
a. a. não existente nos alimentos
norleucina
resultados expressos em % moles
resíduos por 100 resíduos
dividir nº moles de cada resíduo pela soma de todos e 
multiplicar por 100
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
utilização:
quantificar peptídeos e proteínas
determinação da qualidade nutricional de uma proteína
caracterizar ou identificar novas proteínas e peptídeos sintéticos
detectar a. a. não comuns
delinear estratégias de fragmentação
calcular PM de uma proteína
determinar volume parcial específico de uma proteína