DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS

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DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS
- PROTEÍNAS
- Polímeros de elevado peso molecular
- a.a. ligados por ligações peptídicas são sua
unidade funcional
- Constituintes: 50 - 55% de carbono, 6 - 8% de
hidrogênio, 20 - 24% de oxigênio, 15 - 18% de
nitrogênio, 0,2 - 0,3% de enxofre
- Podem ser simples (somente a.a.) ou
conjugadas (a.a. e outros constituintes, como as
glicoproteínas)
- São constituintes das células e desempenham
funções biológicas associadas às atividades
vitais
● Enzimas
● Hormônios
● Estruturais
● Defesa
● Transporte de substâncias
- Função nos alimentos: conferem valor
nutricional e propriedades organolépticas
→ Maior conteúdo de proteínas nos alimentos
de origem animal - soja e amendoim são boas
fontes de proteínas
→ As proteínas de origem animal são mais ricas
em relação aos a.a. essenciais em relação às de
origem vegetal e possuem maior digestibilidade
(relação entre os nitrogênios que ingerimos com
os que absorvemos)
- Alterações das proteínas nos alimentos
- Diversas reações de degradação durante o
processamento e armazenamento podem
ocorrer, acarretando alterações indesejáveis nas
proteínas
● Perda da qualidade nutricional
● Alterações desejáveis/indesejáveis no
flavour
● Perda de funcionalidade (hidratação,
viscosidade, solubilidade)
● Aumento do risco de toxicidade - lisina e
cisteína
- Alterações das proteínas durante o
processamento dos alimentos
- Processos importantes:
● aquecimento
● pH extremos
● Presença de carboidratos
- Alterações desejáveis:
● Térmico:
○ No leite, melhora digestibilidade e
ocorre desnaturação de enzimas
de microrganismos
○ Leguminosas possuem inibidores
de tripsina. Logo, melhora
biodisponibilidade
- MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO
- Procedimento mais comum: determinação de
um elemento ou de um grupo pertencente a
proteína
- Conversão para conteúdo protéico: através de
um fator
- Análise de elementos: carbono e nitrogênio
- Análise de grupos: a.a. e ligações peptídicas
- METODOLOGIA
1. ANÁLISES ELEMENTARES
A. Análise de carbono
B. Análise de nitrogênio
2. ANÁLISES POR GRUPOS
A. Método por biureto
B. Método por fenol
C. Método por UV (tirosina, triptofano e
fenilalanina)
D. Métodos turbidimétricos (TCA)
E. Métodos dye-binding (corante)
F. Métodos físicos
- ANÁLISES ELEMENTARES
1. ANÁLISE DE CARBONO
- Fator de correção
- Digestão ----- nitrogênio
- Menor erro no resultado: > quantidade de C em
relação ao N
- Dificuldade: separar carbonos pertencentes à
proteína dos carbonos de outros componentes
2. ANÁLISE DE NITROGÊNIO
- Determinação mais utilizada
- Considera: proteínas possuem 16% de
nitrogênio
- Fator geral na transformação de nitrogênio
para proteína = 6,25
16 g N ----------------- 100 g PTN
n g N ----------------- X g PTN
X = n . 100 / 16 = n. 6,25
- Esse valor pode variar para cada tipo de
alimento, esse valor já foi determinado e
tabelado, mas, no geral, adota-se 6,25 como
padrão
- MÉTODO DE KJELDAHL
- Premissa fundamental: em uma amostra, todo
o nitrogênio presente provém de proteínas
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- Determina o nitrogênio protéico propriamente
dito e o nitrogênio não protéico (aminas,
amidas, lecitinas, nitrilas e a.a.)
- Resultado conhecido como “proteína bruta”
- A amostra contida em um tubo semelhante a
um tubo de ensaio ao qual é adicionado ácido
sulfúrico e catalisador (selênio e cobre) e a
amostra vai passar por um processo de
digestão, sobrando o nitrogênio como produto,
na forma de sulfato de amônio
- Esse processo gera gases tóxicos (capela)
- O processo leva cerca de 4 horas
- O produto, sulfato de amônio vai para um
processo de destilação, onde reage com o
NaOH e libera amônia, que é volátil, destilada e
recolhida com ácido bórico, formando borato
de amônia
- O borato de amônia é titulado na presença de
HCl e encontra-se o % de nitrogênio na amostra
- Agora multiplica o % N com o fator de
conversão e encontra-se o % de proteínas
% N . 6,25 = % PTN
- RESUMO DAS ETAPAS
1. Aquecimento da amostra com ácido
sulfúrico concentrado até que todo o
carbono seja oxidado a CO2 (DIGESTÃO)
2. O N é transformado em sulfato de
amônio
3. Adiciona-se NaOH + aquecimento:
liberação da amônia dentro de volume
conhecido de solução de ácido bórico e
formação do sal borato de amônio
(DESTILAÇÃO)
4. Este sal (N) é titulado com uma solução
de HCI (TITULAÇÃO) - coloração rósea
para verde que indica a presença de
borato de amônio
- Digestão
- Destilação
- Titulação
- A titulação deve ser feita em até no máximo 2 h
após destilação, porque a amônia está
fracamente ligada ao ácido bórico
- CÁLCULOS
- nº de eq do HCl = nº eq do N
- nº eq N = massa de N(g)/eq N (eq N= 14)
%N. fator = %PTN
- VANTAGENS
● Aplicável a todo tipo de alimento
● Relativamente simples
● Barato
● Boa exatidão
- DESVANTAGENS
● Mede todo o N orgânico
● Menor precisão que o método de biureto
● Reagente corrosivo
- MÉTODO DE MICRO-KJELDAHL
- Aplica-se a qualquer tipo de alimento, sendo
ideal para alimentos com alto teor de proteína -
economia em amostra e reagentes
3. MÉTODO POR BIURETO
- Substâncias contendo 2 ou mais ligações
peptídicas → Sal e cobre (complexo de cor roxa -
meio alcalino) → intensidade da cor formada é
proporcional à quantidade de proteína
→ Medida colorímetro
● Rápido - < 30 min
● Específico (elimina interferentes)
● Barato e simples
● Necessidade de curva de calibração
● Uso em cereais e carnes
- Complexo de coordenação entre o Cu e a
cadeia peptídica - coloração arroxeada
- Leitura é feita num comprimento de onda de
540 nm
4. MÉTODO POR FENOL
- Bioquímica de proteínas (simples e sensível)
- Pouco utilizado para alimentos - extração de
proteínas (elas precisam estar separadas do
alimento antes da análise)
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- Interação das proteínas com reagente fenol e
Cu (condições alcalinas)
- Oxidação de a.a. aromáticos - coloração azul
(750 nm)
- EXEMPLO
- Uma amostra de farinha de trigo analisada,
pelo método de Kjeldahl, para determinação de
proteína bruta, nos forneceu os seguintes
dados:
Peso da amostra: 1,2598 g
Normalidade de HCl usado na titulação: 0,1265
mL de HCI gastos na titulação: 11,8 mL
Eq do Nitrogênio = 14
- Calcule o conteúdo de proteína bruta na
amostra, assumindo que a proteína possui 17%
de nitrogênio
nº de eq do HCl = nº eq do N
nº eq N = massa de N(g)/eq N (eq N= 14)
m/14 = N . V . f
m/14 = 0,1265 . 11,8
m = 0,1265 . 11,8 . 14
m = 20,8978 mg de N
100 mg PTN ---------------- 17 mg N
X mg PTN ---------------- 20,8978 mg N
X = 122,93 mg PTN
0,12293 g PTN ---------------- 1,2598 g amostra
Y g PTN ---------------- 100 g
Y = 9,76% de proteínas