TÉCNICA HISTOLÓGICA APLICADA EM ANATOMIA PATOLÓGICA

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TÉCNICA HISTOLÓGICA APLICADA EM ANATOMIA PATOLÓGICA
INTRODUÇÃO
Técnica histológica é o conjunto de operações que tem por finalidade transformar células e tecidos em preparações destinadas ao exame microscópico, mantendo as mesmas características quando em seu estado natural
PROCESSAMENTOS DOS TECIDOS
	PROCESSO [Do lat. processu]
Ato de proceder, de ir por diante; seguimento, curso, marcha.
Sucessão de estados e de mudanças.
Sequência de estados de um sistema que se transforma; evolução
Operações que desenvolvem-se em fases sucessivas, sem modificação do seu ordenamento.
CONSERVAÇÃO DOS TECIDOS:
MÉTODOS FÍSICOS
Frio;
Calor .
MÉTODOS QUÍMICOS
Substâncias químicas (perfusão e imersão).
ETAPAS:
1 - FIXAÇÃO
 É a operação destinada a parar o metabolismo das células, e ao mesmo tempo, conservar a forma e a estrutura que elas tinham quando vivas.
→ SÉRIE COMPLEXA DE EVENTOS QUÍMICOS - REAÇÃO COM OS ELEMENTOS DOS TECIDOS.
→ LIGAÇÃO CRUZADA COM AS PROTEÍNAS ESTRUTURAIS E ENZIMÁTICAS.
→ REPERCUSSÃO DIRETA NAS TÉCNICAS A SEREM UTILIZADAS
FINALIDADES:
Prevenir as alterações “post-mortem”, preservando as células e os tecidos; 
 Dano intrínseco - autólise e 
 Dano extrínseco - proliferação de microorganismos;
Converter a consistência semi-fluida das células em semi-sólida, protegegendo os tecidos pelo endurecimento;
Ajudar na diferenciação visual das estruturas.
NORMAS GERAIS:
1. Intervalo entre a colheita do material e a fixação: 
 Colocar o mais rápidamente possível na solução fixadora ou colocar na geladeira (por no máximo 24 horas) após sua colheita.
2. Volume do líquido fixador: 
 Deverá ser no mínimo 10 vezes maior que o
 volume da peça .
3. Espessura da peça: 
 6 a 15 milímetros.
4. Contato das superfícies da peça com o líquido fixador: 
	Para se conseguir um contato total e imediato da peça com o líquido fixador, deve-se:
 a) Colocar as peças em recipientes bem maiores que seu volume, e que já contenham o líquido fixador.
 → Evitar recipientes com gargalo estreito.
 b) Agitar de vez em quando o recipiente para renovar o líquido fixador em contato com a peça.
TIPOS DE FIXADORES:
Pode-se empregar vários tipos de fixadores num laboratório de anatomia patológica, os mais usuais são: formol, líquido de Bouin, e Zenker-formol.
1. Formol
O formol é o aldeído fórmico, corpo gasoso, em solução aquosa 37 - 40%.
É um líquido cristalino e incolor que libera vapores irritantes, decompondo-se facilmente pela ação da luz em ácido fórmico (prejudicial às colorações).
A) Preparação:
Formol para uso: formol puro (40%) é empregado em solução aquosa a 10%
B) Tempo ideal de fixação: Fixador lento. Fixa entre 6 e 48 horas. A cada 8 horas fixa 1 milímetro de espessura da peça.
C) Tempo máximo de fixação: Indeterminado, porém, depois de alguns meses, as colorações tornam-se deficientes.
D) Indicações: Devido seu baixo custo, o formol é o fixador mais usado num laboratório de anatomia patológica e indicado principalmente para peças de grande volume e material proveniente de necrópsias.
E) Contra-indicações: É um fixador lento e forma um precipitado artificial chamado pigmento de formol (pode ser eliminado), especialmente em lesões hemorrágicas ou em órgãos muito vascularizados como o baço.
2. Líquido de Bouin
É uma mistura de substâncias fixadoras.
A) Tempo ideal de fixação: Fixador rápido. Fixa entre 4 e 24 horas. A cada 4 horas fixa 1 milímetro de espessura da peça.
B) Tempo máximo de fixação: Oito dias.
C) Indicações: É um dos melhores fixadores conhecidos e indicado especialmente para os exames histopatológicos. Por causa do ácido pícrico que tinge de amarelo os tecidos, é indicado também para evitar a perda de peças diminutas como biópsias de fígado ou rim por punção e de brônquio, esôfago ou estômago por endoscopia.
D) Contra-indicações: desvantajoso para os órgãos hematopoiéticos, lesões hemorrágicas (porque deforma as hemácias) e para coloração dos bacilos álcool-ácido resistentes.
FIXAÇÃO
DESCALCIFICAÇÃO 
	
	Os tecidos calcificados não podem ser cortados por terem consistência pétrea, é necessário usar substâncias capazes de dissolver o cálcio que impregna as peças. Esta operação é chamada de descalcificação.
2- DESIDRATAÇÃO
É feita pelo álcool etílico, até hoje o reagente mais vantajoso para este fim. Durante a desidratação as peças diminuem de tamanho (retração) e readquirem sua cor natural.
3- DIAFANIZAÇÃO
É a operação pela qual o álcool da peça é substituído por um solvente da parafina. Os diafanizadores mais usados são xilol, benzeno e toluol. Os diafanizadores têm densidade maior que o álcool.
4 - IMPREGNAÇÃO
É a penetração da parafina nos espaços celulares. Utiliza-se parafina aquecida acima de seu ponto de fusão, entre 58º a 60º C.
5 – INCLUSÃO EM PARAFINA
Depois de impregnadas, as peças precisam ser incluídas num bloco de parafina.
Para se preparar o bloco, é necessário ter moldes destinados a conter a parafina líquida.
Os moldes são variáveis e podem ser de metal ou de papel.
6 - MICROTOMIA
Micrótomo: aparelho destinado ao corte dos blocos incluídos em parafina, em espessuras finíssimas (3 a20µm).
Cortes na rotina: Quanto mais finos, mais perfeitas serão as colorações.
Espessura ideal do corte entre 4 a 6µm.
1 micrômetro corresponde a 1 milésimo de 1 milímetro. 
CONGELAÇÃO
 Técnica utilizada em materiais a fresco ou fixados que não possam ser processados. Cortes de congelação são utilizados para diagnósticos imediatos.
Criostato
7 - COLORAÇÃO
É a operação pela qual os tecidos são submetidos à ação de substâncias capazes de tingir seus constituintes.
 • COLORAÇÃO DE ROTINA.
 • COLORAÇÃO ESPECIAL OU
 ESPECÍFICA.
 
COLORAÇÃO DE ROTINA OU HEMATOXILINA - EOSINA (HE)‏
É a mais antiga coloração combinada (1863) e a mais difundida em todos os laboratórios de anatomia patológica. O HE constitui a coloração básica geral.
COLORAÇÕES ESPECIAIS:
1. Gomori ou Reticulina: cora as fibras reticulares em negro. 
2. Tricrômico: cora o colágeno em azul.
3. PAS (Periodic Acid-Schiff): cora fungo, membrana basal e glicogênio em rosa.44
4. FITE-Faraco, Ziehl-Neelsen: cora os bacilos álcool-ácido resistentes (B.A.A.R) de Hansen e Koch) em vermelho vivo; núcleos em azul intenso e citoplasma em azul celeste.
5. Brown-Hopps ou Gram: 
	Cora bactérias Gram + (estafilococo, clostrídio, etc.) em azul intenso. 
 Bactéria Gram – (gonococo, salmonela, etc.) em vermelho.
6. Giemsa: 
	Método mais eficiente para a pesquisa de protozoários (leishmaniose, moléstia de Chagas, toxoplasmose, malária), bactérias (H.Pylori), riquétsias cora em azul negro.
7. GMS: 
 Cora fungos em preto.
8. Verhoeff: 
 Fibras elásticas em preto.
9. Levaditi: 
 Cora treponemas em negro em fundo amarelado.
10. Perl’s: 
 Cora ferro em azul.
11. Vermelho Congo: 
 Cora amilóide em vermelho.
10. Mucicarmin: 
 Cora muco ácido em rosa.
3.8-MONTAGEM OU COBERTURA
É a operação pela qual as secções coradas são protegidas através da utilização de lamínula e meio de montagem (cola).
 • PERMANENTE.
 • AQUOSO.
COLORAÇÕES ESPECIAIS
COLORAÇÕES ESPECIAIS
COLORAÇÕES ESPECIAIS
COLORAÇÕES ESPECIAIS
TÉCNICA CITOLÓGICA APLICADA À ANATOMIA PATOLÓGICA
A técnica citológica aplicada à anatomia patológica é aquela destinada ao estudo morfológico de células livres ou isoladas dos tecidos, constituindo a citopatologia, exame citológico ou citopatológico ou ainda citologia diagnóstica.
MODALIDADES DE TÉCNICA CITOLÓGICA
A) Esfregaços de secreções e líquidos orgânicos (citologia esfoliativa);
B) Esfregaços de biópsias por aspiração;
C) Decalque (imprint) da superfície de corte de peças cirúrgicas.
FIXAÇÃO
Qualquer célula isolada fora do organismo sofre autólise, de forma mais rápida que nos tecidos.Portanto a fixação deverá ser imediata.
A fixação do exame citológico pode ser feito de duas maneiras: pela dessecação (hematologia) ou pela ação de líquidos fixadores (o álcool é o fixador mais adequado e econômico), pode-se utilizar mistura de álcool-éter, acetona, álcool metílico ou isopropílico, mas não oferecem maiores vantagens.
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Método relativamente recente de técnica histológica, a imunoistoquímica (IHQ) consiste no uso de anticorpos selecionados para identificar antígenos específicos. Estas reações são muito sensíveis, podendo detectar pequeníssimas quantidades das substâncias em amostras fixadas e incluídas de modo rotineiro.
Antígenos 
 Substância que ao ser introduzida no organismo, estimula uma resposta imune, com a produção de anticorpos. O antígeno é a substância que se quer demonstrar.
Anticorpos 
 São proteínas séricas (imunoglobulinas) produzidas em resposta a substâncias específicas, os antígenos. Num preparado imuno-histoquímico, essa ligação do anticorpo com o antígeno traduz-se por marcador colorido no local da reação.
INDICAÇÕES: 
Visualizar componentes celulares ou microorganismos préviamente não identificáveis. O patologista experiente só lança mão de IHQ quando esgota todas as técnicas histológicas clássicas.
2. EXEMPLOS DE MARCADORES
 IMUNO-HISTOQUÍMICOS:
#Ki-67 (Mib1): Marca uma proteína presente em todas as fases do ciclo celular, menos na fase G0. 
#CD 34: Marcador de células hematopoiéticas primitivas e de células endoteliais. 
#EMA (Antígeno de membrana epitelial) : Marcador de diferenciação epitelial, presente em grande parte dos adenocarcinomas.
ACABOU!