Trabalho de Citogenética

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Universidade Federal do Pará
Instituto de Ciências Biológicas
Faculdade de Biotecnologia
Novos métodos de sequenciamento aplicados à citogenética
Professora: Adriana Carneiro Folador
Alunos: Marcus Vinicius Brito Brandão; 
Rubem Ferreira da Silva; 
Matheus Gabriel de Souza Barros; 
João Marcos Veras Neves;
David Cristian Rodrigues Lucas; 
INTRODUÇÃO
O que é sequenciamento?
Sequenciamento é a identificação da ordem dos nucleotídeos em um fragmento de DNA ou RNA.
História
1953 – Watson e Crick descobrem a estrutura do DNA.
Meados dos anos 70 – O primeiro método de sequenciamento foi descoberto por Allan Maxam e Walter Gilbert, o método ficou conhecido como Maxam-Gilbert.
História
1977 - Frederick Sanger propõe o Método de Sanger. 
História
Outros métodos foram inventados.
Pirosequenciamento
Illumina
Solid
Ion Torrent
APLICAÇÕES NA CITOGENÉTICA
NO ESTUDO DO CÂNCER
O tumor de mama lobular é encontrado no carcinoma lobular (um subtipo do câncer de mama).
A evolução foi acompanhada durante 9 anos.
Foram utilizados o Método de Sanger e o Illumina para o sequenciamento.
Foram identificadas aberrações genômicas: SNVs, inserções, deleções, fusão de genes, translocações, inversões e alterações nos números de cópias.
Foram identificadas mudanças na transferência de informações do genoma nuclear para proteínas: enzimas de edição de RNA.
Resultados
Foram identificadas mudanças nas frequências das aberrações nos genes com o passar do tempo.
Mostra a importância de dados das sequências de RNA na avaliação da variação de proteínas em tumores.
Mostra a importância do sequenciamento de células tumorais para se conhecer melhor a origem do câncer.
EM DOENÇAS NO NEURODESENVOLVIMENTO
O que é o TEA?
TEA significa: Transtorno do Espectro Autista.
É um distúrbio do neurodesenvolvimento que apresenta déficits na interação social e na comunicação.
Afeta Principalmente pessoas do sexo masculino.
A etimologia do TEA ainda não é conhecida
Porém, sabe-se dizer que há:
Anormalidades Cromossômicas (2%)
Síndromes monogênicas (5%)
Duplicações e deleções (10%)
Fatores Ambientais (3%)
Multifatorial e Epigenética (80%)
Métodos utilizados
Métodos utilizados
Resultados
NO DIAGNÓSTICO DE HEMOPATIAS MALIGNAS
Desde a primeira anomalia cromossômica específica identificada na leucemia a mais de 50 anos atrás, a tecnologia evoluiu muito, agora permitindo a decifração dos genomas em detalhes cada vez maiores;
As primeiras técnicas cromossomicas desenvolvidas permitiram a identificação de anormalidades cromossômicas “brutas”;
Elas incluem citogenética convencional (Bandeamento - cromossomos marcados de uma forma específica, com pares identificados individualmente), molecular e baseada em técnicas de microarranjos (hibridização in situ -  a mais usada marcação por FISH).
A técnica de FISH baseia-se no uso de sondas, isto é, sequências de DNA ligadas a fluorocromos que, por sua vez, se ligam a sequências de DNA que lhe são complementares.
No entanto, essas técnicas podem revelar apenas parte do problema, pois os genes podem ser alterados de várias maneiras como por expemplo por mutações.
Isso levou ao desenvolvimento do que hoje é conhecido como sequenciamento de próxima geração (NGS)
Hemopatias malignas inclui mutações em genes reguladores importantes e fatores epigenéticos além de mudanças estruturais como translocações, exclusões e amplificações.
O uso de tecnologias ômicas, como a transcriptômica (gene expression profiling) e metilação (DNA methylation profiling) dramaticamente aumentaram durante os últimos anos.
Eles são consideradas ferramentas padrão em pesquisa de câncer.
No entanto, como já mencionado, ainda há muito a aprender no nível do genoma com a não completa dissecação de todas as aberrações dirigindo a gênese e a evolução de câncer, notadamente de hemopatias malignas.
A leucemia é caracterizada por proliferação de células hematopoiéticas. Como em outros tumores, o número e complexidade de aberrações genéticas tendem a aumentar durante a evolução da doença.
Além de mutações genéticas, cópia de variações numéricas (supressões e / ou amplificações) e perda de heterozigosidade, hemopatias malignas também são caracterizado pela geração de genes de fusão devido a translocações cromossômicas, inversões ou inserções.
Portanto, dadas as limitações das técnicas até agora disponível para estudar o genoma das hemopatias malignas, é preciso recorrer a vários métodos, desde a citogenética até sequenciamento do genoma completo para ter uma imagem melhor, ainda que incompleta das aberrações genéticas.
Citogenética
Durante muito tempo, a citogenética convencional foi a ferramenta padrão para estudar anormalidades cromossômicas em hemopatias malignas.
Este método é particularmente útil na detecção de rearranjos balanceados (principalmente translocações, também inserções e inversões) associado com quimérico (fusão) genes. No entanto, esta metodologia tem limitações. Ele depende da presença de células em divisão que podem ser bloqueadas na metáfase no estágio de mitose, mas alguns distúrbios têm uma baixa índice.
Além disso, sua resolução é baixa (cerca de 10 Mb). Portanto, alguns rearranjos, como pequenos deleções ou translocações crípticas, podem escapar da análise.
Uso da técnica de FISH;
Diferentes tipos de sondas de DNA foram desenvolvidos variando de sondas identificadoras específicas para locus para testes de cromossomo inteiro.
sondas identificadoras específicas para locus não dependem da presença de células em divisão, mas pode ser realizada em células em interfase, e detecta deleções crípticas e translocações balanceadas visando o gene ou os genes envolvidos na deleção ou na fusão;
No entanto, não fornece uma avaliação genômica ampla para o contrário de multiplex-FISH (Cariótipo 24 cores).
Embora esta última técnica possa ser útil na revelação do constituição de cariótipos complexos, tem as mesmas limitações como citogenética convencional (células em divisão, baixa resolução).
Hibridização genômica comparativa de Array (CGH-Array ou aCGH) é uma técnica citogenética molecular usada para comparar o material genético de uma amostra de teste com uma amostra de referência.
Os 46 cromossomos humanos é explorado em um único teste em uma escala de alta resolução sem a necessidade de cultivar células.
É um método de escolha para pesquisar alterações no número de cópias cromossomicas, seja perdas ou ganhos de todo ou segmentos dos cromossomos. Alterações no número de cópias 5 a 10 kb de DNA podem ser identificados.
No entanto, um grande revés da técnica é sua incapacidade de detectar anormalidades cromossômicas equilibradas, tais como translocações recíprocas ou inversões que são comuns em hemopatias malignas e analisar pequenas populações de células malignas. 
Técnicas baseadas em microarranjos
Dois outros fenômenos também são eventos freqüentes em malignos hemopatias. Estes são LOH (também chamado de perda de heterozigosidade) e o número de cópias de LOH  neutras(CN-LOH). 
Somente o Array de polimorfismo de nucleotídeo único pode identificar CN-LOH, que não pode ser detectado por citogenética (convencional ou FISH) ou aCGH. 
Inicialmente, as mutações em genes individuais foram pesquisadas usando PCR seguido de sequenciamento de Sanger. Os avanços tecnológicos revolucionaram nossas capacidades de questionar o genoma em uma resolução de um único par de bases. Várias técnicas foram desenvolvidas, conhecidas como Sequenciamento de Nova-Geração(NGS)
O sequenciamento total do exoma (WES) foi projetado para seletivamente sequenciar as regiões codificadoras do genoma. Como os exons constituem cerca de 1% do genoma humano, este método tem custo reduzido em comparação com outros métodos NGS, mas não identifica mutações fora das regiões de codificação (que representam 99% do genoma humano), nem anormalidades cromossômicas, como translocações e inversões, com pontos de interrupção localizados
nos introns.
O sequenciamento do genoma completo pode superar essas dificuldades..
Suas principais desvantagens são o alto custo, a grande quantidade de dados gerados e a complexidade do análise. Além disso, não fornecer informações sobre alterações na expressão gênica e modificações epigenéticas.
Um método alternativo é o sequenciamento do transcriptoma (também conhecido como sequenciamento de RNA ou RNA-seq). Ambos RNAs codificantes e não codificantes são explorados.
Essa técnica permite mudanças pós-transcricionais e fusão transcricional para serem analisadas. No entanto, como para WES, não pode se detectar mutações em regiões não codificantes do genoma.
Além disso, a descoberta de mutação permanece difícil devido ao mapeamento complexo entre os limites intron-exon e variação de splice(remove os íntrons e junta os éxons depois da transcrição do RNA). Essa técnica é computacionalmente mais complexo e caro do que outros métodos NGS.
RNA-seq é a melhor ferramenta para identificar novos eventos de fusão.
Mecanismos epigenéticos contribuem para a leucemogênese.
Ela envolve muitos mecanismos genéticos e epigenéticos.
Logo, estudos em larga escala usando sequencia de bissulfito de genoma completo para investigar Metilação do DNA e imunoprecipitação da cromatina (ChIP ou ChIP-seq) seguido por NGS para analisar a estrutura da cromatina foram feitos e ainda estão sendo realizados.
Em conclusão, NGS é um grande avanço na elucidação da base molecular da leucemia. É difícil dizer um  método único que pode decifrar todos os mecanismos envolvidos na leucemogênese. Sendo asism, é improvável que uma técnica específica tornar-se a "padrão"
durante sua evolução, hemopatias malignas tendem a acumular uma série de anormalidades genéticas que podem não ter significado clínico e / ou terapêutico.
Assim sendo, estudos Bionformáticos ainda será maior do que estudos em ambiente clínico, em conjunto com métodos NGS do laboratório de pesquisa.
Em um futuro próximo, é provável que essas técnicas sejam realizada em células selecionadas de acordo com seu perfil de expressão proteica imunofenotípica ou na circulação células malignas.
O propósito final é, primeiro, relacionar as mudanças estruturais nos genomas de hemopatias malignas para os mecanismos de doença subjacentes e, segundo, revelar novas oportunidades para desenvolver estratégias para o tratamento.
NA AGRICULTURA
Resumo
Este estudo examinou inserções de mtDNA dentro de cromossomos de um conjunto diversificado de Zea mays ssp(milho) endogâmicas pelo uso de hibridização fluorescente in situ(FISH). O presente estudo analisa a variação NUMT(Sequência Nuclear-mtDNA) em um conjunto de linhas endogâmicas que captam a diversidade do milho.
Um NUMT relativamente grande no braço longo do cromossomo 9 (9L) foi identificado aproximadamente na mesma posição em quatro linhas endogâmicas (B73, M825, HP301 e Oh7B). Uma análise mais aprofundada do 9L NUMT posicionado de forma semelhante em duas linhas, B73 e M825, indicou que o grande tamanho destes locais é devido à presença da maioria do genoma mitocondrial. Além de analisar sequências, o B73 9L NUMT foi examinado com o uso de FISH e FISH de fibra. Este trabalho levou a uma imagem mais clara do conteúdo e do tamanho do mtDNA do 9L NUMT e também ilustra os benefícios de complementar a análise de sequência com citogenética.
Materiais e métodos
Linhas endogâmicas
Cada uma das 16 linhas endogâmicas examinadas na triagem de diversidade é uma linha fundadora da população de mapeamento de associação aninhada de milho, com exceção de B37, Mo17 e M825. Pelo menos uma linha de cada subgrupo genético de milho foi incluída:(A) duas linhas de caule rígido (B73 e B37); (B) três linhas de milho de haste não rígida (Mo17, Ky21 e Oh7B); (C) uma linha de milho de pipoca (HP301); (D) três linhas de milho doce (IL14H, M825 e P39); (E) seis linhas de milho tropicais / subtropicais (CML52, CML228, CML277, Ki11, NC350 e Tzi8); (F) e uma linha mista (Tx303).
Análises citogenéticas e sequenciais
A análise citogenética foi feita utilizando a técnica de hibridização fluorescente in situ(FISH) para se obter uma imagem mais clara do conteúdo e do tamanho do mtDNA.
A sequência do genoma mitocondrial do milho NB foi comparada com o genoma de referência nuclear pelo uso do programa ZeAlign disponível através do Maize Genetics e Genomics Database (MaizeGDB). Os arquivos resultantes desta comparação foram carregados como uma trilha personalizada no navegador do genoma de milho no MaizeGDB para visualizar as inserções do mtDNA relativas ao cromossomo 9.
Resultados
Triagem de um conjunto de linhas endogâmicas de milho para NUMTs
A variação no número e localização dos NUMTs foi observada neste conjunto de linhas pelo uso do FISH. O menor número de NUMTs encontrados foi na linhagem de milho doce P39, que possuía apenas 12 NUMTs detectáveis. O maior número de NUMTs encontrados foi em Tzi8, que continha 24 NUMTs detectáveis. 
Neste conjunto de linhagens de milho, observou-se um NUMT com forte sinal de hibridação próximo ao centrômero de 9L em quatro linhas: B73, Oh7B, HP301, e M825. Assim, além dos 9L NUMT B73(Lough et al. 2008), três NUMTs comparáveis foram identificados em linhas de diferentes subgrupos genéticos de milho. Todas as outras linhas analisadas aqui têm um NUMT 9L com um sinal de hibridação muito mais fraco.
Caracterização citogenética do cromossoma 9L NUMT em quatro linhas de milho
Para analisar os NUMTs próximos ao centrômero no braço longo do cromossomo 9, um exame detalhado da região NUMT em quatro linhas endogâmicas foi completado usando as 20 sondas de cosmídeos contendo mtDNA individuais. O NUMT B73, grande previamente examinado (Lough et al. 2008), é comparado aqui com o 9L NUMT em M825, B37 e Mo17. O M825 foi escolhido porque contém um forte sinal NUMT em 9L (Figura 1). B37 e Mo17 foram escolhidos porque contêm um sinal NUMT mais fraco em uma posição similar em 9L (Figura 1).
As duas linhas com um sinal NUMT 9L mais fraco, B37 e Mo17, foram examinadas quanto à extensão do genoma mitocondrial presente naquele local. Apenas duas das sondas cosmídicas contendo mtDNA (5 e 20) hibridizaram com 9L NUMT nestas linhas (Figura 2B).
Análise de Fibra-FISH do cromossomo B73 9L NUMT
A técnica de fibra-FISH foi utilizada para determinar se o B73 9L NUMT é metilado. Cada fibra de DNA mostrou um padrão de metilação similar. A sobreposição na hibridação dos rótulos de metilação (5-metil-citosina; verde) e mtDNA (mistura de 19-cosmídeo; vermelho) indica que o NUMT é metilado (Figura 7). 
O painel superior sobrepõe-se a etiquetas vermelhas e verdes. O painel central mostra apenas o rótulo vermelho. O painel inferior mostra apenas o rótulo verde.
Discussão
Usando o FISH, mostrou-se que a distribuição de NUMTs varia muito entre as linhas de milho pesquisadas. Além de documentar a extensa variação de NUMTs no milho, também se descobriu locais de inserção de mtDNA que provavelmente contêm a maioria do genoma mitocondrial do milho em um local similar no braço longo do cromossomo 9 em quatro linhagens de diferentes subgrupos de milho.
A extensa variação dos sítios de inserção de mtDNA mostrados aqui ilustra a natureza frequente e contínua das transferências e perdas de DNA organelares do genoma nuclear. Como visto no presente trabalho e publicações anteriores, obter uma sequência completa para um NUMT grande pode ser difícil. Os BACs que contêm apenas mtDNA são frequentemente considerados como contaminação e rotineiramente são removidos do processo de montagem. Para assegurar que os sítios de inserção de DNA organelares estão corretamente representados na sequência de genomas nucleares, técnicas citogenéticas como FISH e FISH de fibra devem ser usadas para complementar as análises de sequências.
Com a tecnologia avançada e a consequente mudança para uma aplicação crescente de técnicas genéticas moleculares (por exemplo, microarrays, sequenciamento de próxima geração) com o potencial de maior resolução em contextos
específicos, bem como a aplicação de estratégias de teste combinadas para o diagnóstico de distúrbios cromossômicos, é crucial que a citogenética e os serviços citogenômicos mantenham-se atualizados com a tecnologia e tenham documentos que forneçam orientação nesta constante evolução do cenário.
Sempre que uma anomalia citogenômica é suspeitada pelo clínico como subjacente a condição/desordem de um determinado paciente uma análise citogenômica deve ser considerada
O FISH (Hibridização in situ Fluorescência) para detectar síndromes de instabilidade cromossômica.
Utiliza sondas (DNA com fluorescência) que se associa com uma sequencia de DNA semelhante no cromossomo.
Pode aplicar-se o FISH na intérfase e ou metáfase 
E ao pré-natal rápido
O FISH pode detectar:
Trimossia 21;
Detecta aneuploidias;
Constituição do cromossomo sexual em recém-nascidos;
Diagnóstico pré-natal ou para a investigação rotineira de perdas da gravidez.
A análise de FISH utiliza amostras de sangue, urina, pele
Tipos de sonda:
Break-apart: sondas que detectam quebras genéticas. Consiste em marcar a região distal de uma cor e proximal com outra cor.
Sondas para avaliação numérica: para saber o número de cópias de um determinado gene a ser estudado.
Fusão: dois genes distintos marcados com cores diferentes. Para detectar a translocação e fusão desses genes.
OBRIGADO!!!