citogenetica-no-diagnostico-laboratorial-4

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Aula 04
Rosalina Guedes Donato Santos
Citogenética 
no Diagnóstico 
Laboratorial
Diretor Executivo 
DAVID LIRA STEPHEN BARROS
Diretora Editorial 
ANDRÉA CÉSAR PEDROSA
Projeto Gráfico 
MANUELA CÉSAR ARRUDA
Autor 
EDUARDO NASCIMENTO DE ARRUDA
Desenvolvedor 
CAIO BENTO GOMES DOS SANTOS
Olá. Meu nome é Rosalina Guedes Donato Santos. Sou formada 
em Biomedicina, com uma experiência técnico-profissional na área 
de imunologia, hematologia, toxicologia, análises clínicas de mais 
de 12 anos. Passei por empresas com a Faculdade de Ciências e 
Tecnologia, UNIFACS, UNIRB, Laboratórios como o Hospital Roberto 
Santos, Laboratório José Silveira e Universidade Federal da Bahia. Sou 
apaixonado pelo que faço e adoro transmitir minha experiência de vida 
àqueles que estão iniciando em suas profissões. Por isso fui convidada 
pela Editora Telesapiens a integrar seu elenco de autores independentes. 
Estou muito feliz em poder ajudar você nesta fase de muito estudo e 
trabalho. Conte comigo!
Autor 
Rosalina Guedes Donato Santos
INTRODUÇÃO: para 
o início do desen-
volvimento de uma 
nova competência;
DEFINIÇÃO: houver 
necessidade de 
se apresentar um 
novo conceito;
NOTA: quando forem 
necessários obser-
vações ou comple-
mentações para o 
seu conhecimento;
IMPORTANTE: as 
observações escritas 
tiveram que ser prio-
rizadas para você;
EXPLICANDO ME-
LHOR: algo precisa 
ser melhor explica-
do ou detalhado;
VOCÊ SABIA? curio-
sidades e indaga-
ções lúdicas sobre o 
tema em estudo, se 
forem necessárias;
SAIBA MAIS: textos, 
referências biblio-
gráficas e links para 
aprofundamento do 
seu conhecimento;
REFLITA: se houver a 
necessidade de cha-
mar a atenção sobre 
algo a ser refletido 
ou discutido sobre;
ACESSE: se for 
preciso acessar um 
ou mais sites para 
fazer download, 
assistir vídeos, ler 
textos, ouvir podcast;
RESUMINDO: 
quando for preciso 
se fazer um resumo 
acumulativo das 
últimas abordagens;
ATIVIDADES: quando 
alguma atividade 
de autoaprendiza-
gem for aplicada;
TESTANDO: quando 
o desenvolvimento 
de uma compe-
tência for conclu-
ído e questões 
forem explicadas;
Iconográficos
Olá. Meu nome é Manuela César de Arruda. Sou a responsável pelo pro-
jeto gráfico de seu material. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de 
aprendizagem toda vez que:
SUMÁRIO
Princípios da citogenética clínica 10
Papel da genética no metabolismo bioquímico 10
Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) 14
Genômica e proteômica 15
Identificação dos genes de doenças humanas 
e fatores de suscetibilidade 22
Genética das doenças complexas 26
Testes genéticos utilizados no diagnóstico 
das doenças genéticas 32
Metilação do DNA 34
Outros métodos de investigação 35
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 7
UNIDADE
04
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial8
Nas últimas décadas cresceram os interesses a cerca da biologia 
molecular por partes profissionais da saúde, principalmente pela 
possibilidade de um diagnóstico mais assertivo nas doenças genéticas. 
O avanço nas técnicas moleculares, sobretudo na possibilidade de avaliar 
o DNA advindos de materiais biológicos como tecidos, aminiocentese, 
biópsia de vilosidades coriônica aumentaram a chance de prever e 
diagnosticar as doenças genéticas. Além disso, ferramentas diagnósticas 
como a reação de cadeia em polimerase (PCR) despontaram como uma 
ajuda no diagnóstico laboratorial, porque essa técnica utiliza quantidade 
amostras mínimas, além de ser altamente sensível, específica e possui 
alta reprodutibilidade. Essas características foram fundamentais para os 
diagnósticos genéticos quanto aos aspectos éticos e legais, uma vez que 
o diagnóstico se tornou quase que irrefutável dada a precisão das técnicas 
moleculares. Dessa maneira os laboratórios conseguiram uma garantia na 
qualidade dos serviços possibilitando que o número de erros laboratoriais 
tendesse a zero e os laudos emitidos eram de fácil compreensão para os 
indivíduos envolvidos no processo. Entendeu? Ao longo desta unidade 
letiva você vai mergulhar neste universo!
INTRODUÇÃO
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 9
Olá. Seja muito bem-vindo à Unidade 4. Nosso objetivo é auxiliar 
você no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até 
o término desta etapa de estudos:
1. Analisar o papel da genética no metabolismo bioquímico.
2. Reconhecer as principais doenças genéticas e suas caracte-
rísticas.
3. Correlacionar as técnicas utilizadas com o diagnóstico das 
principais doenças genéticas.
4. Associar as técnicas de Biologia Molecular com o diagnóstico 
de doenças genéticas.
Então? Preparado para uma viagem sem volta rumo ao conhecimento? 
Ao trabalho!
OBJETIVOS
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial10
Princípios da citogenética clínica 
INTRODUÇÃO:
Ao término deste capítulo você será capaz de entender 
como ocorrem os erros inatos do metabolismo e quais são as 
consequências e qual o papel do laboratório nessa análise, 
além disso entenderá como a genômica e a proteômica 
podem auxiliar na descoberta dos genes e na avaliação 
da função das proteínas, além de analisar as principais 
vantagens e desvantagens dos testes usados na genética 
como auxílio no diagnóstico laboratorial. E então? Motivado 
para desenvolver esta competência? Então vamos lá. Avante!
Papel da genética no metabolismo 
bioquímico
Os erros inatos do metabolismo (EIM) são distúrbios de natureza 
genética que geralmente correspondem a um defeito enzimático capaz 
de acarretar a interrupção de uma via metabólica.
Os erros inatos do metabolismo ocorrem por defeitos na falha 
de síntese, degradação, armazenamento ou transporte de moléculas 
no organismo. Esses erros causam Doenças Metabólicas Hereditárias 
(DMH) em que a ausência de um produto esperado, ou ainda acúmulo 
de substrato da etapa anterior que foi interrompida ou surgimento de 
uma nova rota metabólica alternativa o que leva ao comprometimento 
de processos celulares. 
As enzimas são catalisadores proteicos que aceleram as reações 
químicas e atuam reduzindo a energia de ativação necessária para que 
uma reação química ocorra. Para que a enzima possa funcionar de 
maneira correta é necessária a presença de sum substrato. Se uma via 
metabólica exige a ação sequencial de diversas enzimas, uma mutação 
de perda de função em qualquer um dos genes codificadores dessas 
enzimas causará um bloqueio metabólico. O substrato irá acumular- se 
antes do bloqueio, e depois desse haverá falta do produto.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 11
Figura 1: Erros metabólicos
Fonte: A autora
Em uma via biossintética, o efeito será a ausência do produto final. 
A exemplo temos a tirosina, uma enzima crucial para a biossíntese da 
melanina, que quando afuncional em homozigose, causa o albinismo. 
Em uma via de degradação, usualmente ocorre acúmulo do 
substrato. Um exemplo clássico, são as doenças de armazenamento 
lisossômico. Os lisossomos são vesículas que contém cerca de 40 
enzimas hidrolíticas diferentes, as quais tem por função a digestão. A 
deficiência de uma ou outra enzima lisossômica causa a degradação 
parcial ou a não degradação do material no interior do lisossomo, o 
que pode acarrear na morte celular. Os pacientes ao nascerem são 
normais, mas depois apresentam inúmeros problemas em função da 
não degradação. A exemplo, temos as mucopolissacaridoses como as 
síndromes de Hunter e Hurler, a falta de uma ou outra enzima necessária 
para a decomposição dos glicosaminoglicanos (mucopolissacarídeos) 
acarreta no armazenamento de material de alto peso molecular não-
degradável e inexportável. 
A alta concentração de substrato antes de um bloqueio, em uma 
via de degradação ou sintética, também pode levar à produção de 
metabólitos anormais. Por exemplo, a fenilcetonúria cujo bloqueio na 
via catabólica normal da fenilalanina causa o acúmulo de fenilalanina no 
sangue e em outros tecidos. 
Ainda pode-se ter a ausência do produtofinal, acarretando 
na ausência do controle do mecanismo retroinibitório. A exemplo, a 
síndrome de Lesch-Nyhan, a qual é caracterizada como uma herança 
recessiva ligada ao X, que ocorre por uma superprodução de purinas e 
excreção excessiva de ácido úrico. A deficiência da enzima hipoxantina-
guanina fosforribosiltransferase 1 (HPRT1), cujo gene está localizado no 
cromossomo Xq26-q27.2 resulta em níveis elevados de 5’-fosforribosil-
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial12
1-pirofosfato (substância que em quantidades normais exerce o controle 
da síntese de purinas), acarretando hiperuricemia e hiperuricosúria (altos 
níveis de ácido úrico no sangue e na urina, respectivamente). 
A hiperuricemia, frequentemente, resulta na formação de cálculos 
de ácido úrico nos rins e deposição de cristais de urato nas articulações 
(artrite gotosa) e nos tecidos moles, também podem aparecer hematúria, 
cálculos renais de ácido úrico e nefropatia obstrutiva e quando não 
tratada geralmente é a causa de morte mais comum durante a infância. 
O tratamento é feito com drogas como o alopurinol, para reduzir os níveis 
de ácido úrico e evitar a formação de cálculos de ácido úrico e outras 
complicações, mas nenhuma delas reduz os efeitos prejudiciais ao SNC. 
Nessa síndrome o comportamento compulsivo autodestrutivo é visto 
entre 2 e os 4 anos de idade, quando os pacientes começam a morder a 
mucosa oral, lábios e dedos, sem qualquer perda da sensibilidade. 
Figura 2: Síndrome de Lesch-Nyhan
Fonte: http://bit.ly/36Jwbed
Além disso, nos erros inatos do metabolismo ainda podem conter 
situações em que são encontrados o acúmulo do substrato pode acarretar 
acúmulo do precursor, no qual são produzidos metabólitos tóxicos ou 
ainda o próprio acúmulo de substrato se torna prejudicial às células. 
A exemplo do acúmulo do substrato, têm-se a galactosemia, é uma 
herança autossômica recessiva, determinada por um gene localizado no 
cromossomo 9p13, a qual resulta da deficiência da enzima galactose-
1-fosfato-uridiltransferase, que normalmente converte a galactose-1-
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 13
fosfato em glicose-1-fosfato. Nos homozigotos, essa etapa metabólica 
está bloqueada, acumulando-se galactose nas ce ́lulas sanguíneas, no 
fígado, no cérebro e nos rins. Ao nascerem, os bebês parecem normais, 
mas na segunda semana de vida começam a apresentar vômitos, diarreia, 
desidratação, icterícia, desnutrição e atraso no desenvolvimento. Na 
ausência do tratamento adequado, podem sofrer complicações como 
cirrose, hepatoesplenomegalia, galactosúria, catarata e deficiência 
mental. Assim, o tratamento consiste na substituição permanente do 
leite da dieta por produtos que não contenham galactose nem lactose 
(açúcar do leite, que pode ser convertido em galactose), evitando, assim, 
a maioria dos efeitos prejudiciais da deficiência enzimática.
Um exemplo clássico para a produção de metabólitos tóxicos é a 
fenilcetonúria (PKU), na qual o bloqueio enzimático é causado pela falta da 
enzima fenilalanina-hidroxilase, que tem por função converter a fenilalanina 
em tirosina, no fígado. Na ausência dessa enzima, a fenilalanina acumula-
se no sangue e é degradada, por uma via secundária, em fenilpiruvato, 
fenilactato e fenilacetato, que podem ser tóxicos. O bloqueio enzimático 
acarreta também deficiência de tirosina, com a consequente redução na 
formação de melanina, motivo pelo qual os afetados tendem a ter pele, 
cabelos e olhos claros. Além disso, as áreas cerebrais pigmentadas, 
como a substância negra, também carecem de pigmento. No Brasil a 
prevalência é de 1/25.000. As crianças que tem a doença são normais ao 
nascer, porém se tornam progressivamente deficientes (QI<20) e se tornam 
hiperativas, irritáveis, espásticas e podem ter convulsões. Algumas crianças 
apresentam sinais de agressividade e apresentam comportamento 
psicótico, incapacidade motora, incontinência esfincteriana, odor de mofo 
por conta da excreção urinária de fenilcetonas e dermatite constante. Hoje 
o diagnóstico é feito por meio do teste do pezinho no pré-natal. Uma das 
recomendações nesse paciente é a dieta alimentar, os alimentos proibidos 
na fenilcetonúria são os que têm alto teor de fenilalanina. Entre eles, estão 
carnes e derivados, feijão, ervilha, soja, grão-de-bico, lentilha, amendoim, 
leite e derivados, achocolatados, ovos, nozes, gelatinas, bolos, farinha de 
trigo, alimentos industrializados com altos teores de fenilalanina, pães em 
geral, biscoitos e qualquer alimento que contenha aspartame, uma vez que 
o aspartame sempre está associado com a fenilalanina para adocicar os 
produtos da linha DIET.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial14
Ademais, a falta de um produto final ou excesso de um substrato 
pode interferir nos mecanismos reguladores, gerando vários tipos de 
doenças. Exemplificando tem-se a hipercolesterolemia familiar, uma 
doença autossômica dominante caracterizada pela elevação a nível 
plasmático de colesterol. É uma doença genética do metabolismo das 
lipoproteínas, principalmente por defeito do gene LDLR que codifica o 
receptor de LDL.
Lipoproteínas de baixa densidade (LDL)
LDL é a sigla de Low Density Lipoproteins, que significa lipopro-
teínas de baixa densidade.
As mutações nesse gene podem ser agrupadas em pelo menos 
cinco classes de alterações funcionais dos receptores de LDL: 
1. Redução ou ausência de síntese;
2. Redução ou defeito no transporte do receptor entre o retículo 
endoplasmático e o complexo de Golgi; 
3. Ligação deficiente entre o receptor e a LDL;
4. Internalização anormal da LDL pelo receptor;
5. O receptor não consegue liberar a LDL nos lisossomos e 
retornar para a superfície celular (ausência de reciclagem), sendo 
degradado o complexo LDL-receptor. 
A mutação também pode ser secundária a defeitos no gene 
APOB que codifica a apolipoprotei ́na B100, ou por mutações com ganho 
de função no gene pró-proteína convertase subutilisina/kexina tipo 9 
(PCSK-9). 
Nos pacientes com Hipercolesteerolemia Familiar heterozigótica 
ocorre a circulação de LDL por mais tempo no plasma e por isso há mais 
oxidação e transformações químicas, que resultam na alta captação de 
LDL pelos r macrófagos, deflagrando mecanismos pró-aterogênicos, 
tendo como consequência aterosclerose, doença arterial coronariana 
e doença arterial periférica. Para esses pacientes a dieta alimentar 
também é importante, sendo vetada o consumo de alimentos ricos 
em colesterol e ácidos graxos saturados e recomenda-se a utilização 
de medicamentos hipolipimiantes e a prática de exercícios físicos. O 
diagnóstico da hipercolesterolemia familiar e ́ estabelecido segundo 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 15
os critérios clínicos e laboratoriais devendo sempre ser hipótese 
diagnostica em pacientes com níveis de colesterol da lipoproteína de 
baixa densidade (LDLc) superiores a 190mg/dL e pode ser confirmado 
por testes genéticos que determinam a mutação. 
Ainda existem as doenças que são decorrentes do metabolismo 
das porfirinas. As porfirinas são compostos nitrogenados que se 
ligam facilmente a íons metálicos e fazem parte do grupamento da 
hemoglobina, mioglobina, citocromos e outras proteínas. Essas doenças 
acontecem por deficiência de enzimas na biossíntese do grupamento 
heme, sendo assim classificadas em porfirinas hepáticas ou porfirinas 
eritropoiéticas, de acordo com o maior número de acúmulos se no 
fígado ou no sistema eritropoiético. 
No caso das porfirinas hepáticas, as manifestações clínicas 
são fotossensibilidade, erupções avermelhadas, mudança de cor da 
urina para vermelho escuro ou marrom. As porfirias eritropoie ́ticas são 
caracterizadas por erupções e vesículas na pele no início da infância, 
sendo complicadas por cirrose colesta ́tica hepática e insuficiência 
hepática progressiva.
Genômica e proteômica 
A genômica se refere ao estudo do genoma e para isso sãousadas técnicas que possam caracterizar os genes e a proteômica avalia 
a expressão de proteínas em materiais como fluidos corporais, tecidos 
em condições/e ou momentos distintos.
A genômica estrutural estuda a organização e a sequência de 
informação genética contida em um genoma. Para tanto devem ser 
analisados mapas genéticos e físicos dos cromossomos. O mapa é 
importante porque ele identifica as localizações dos genes, marcadores 
moleculares e segmentos cromossômicos para identificar a posição dos 
segmentos cromossomos e alinha trechos de DNA sequenciado em 
uma sequência do genoma inteiro. 
Os mapas genéticos (também conhecidos como mapas de 
ligação) fornecem uma estimativa das localizações dos genes em relação 
a localizações de outros genes conhecidos. Estes mapas baseiam-se 
na função genética da recombinação. Em resumo, organismos com 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial16
genótipo conhecido são cruzados e a frequência de recombinação entre 
os loci é determinada pelo exame dos descendentes. Se a frequência 
de recombinação entre os loci for 50%, então os loci estão em diferentes 
cromossomos ou distantes no mesmo cromossomo. Se a frequência de 
recombinação for menor que 50%, os loci estão próximos no mesmo 
cromossomo (eles pertencem ao mesmo grupo de ligação). Para genes 
ligados, a taxa de recombinação é proporcional à distância física entre os 
loci. As distâncias nos mapas genéticos são medidas em porcentagem 
de recombinação (centimorgans, cM) ou unidades de mapa. Os dados 
de cruzamentos múltiplos de dois ou três pontos podem ser integrados 
em mapas de ligação para cromossomos inteiros. 
Figura 3: Mapa genético
Fonte: wikimedia commons
Os mapas genéticos têm muitas limitações, a primeira delas 
é a resolução ou o detalhe. O genoma humano inclui 3,2 bilhões de 
pares de bases de DNA e tem uma distância genética total de 4.000 
cM, uma média de 800.000 pb/cM. Mesmo que exista um marcador a 
cada centimorgan (o que não é uma expectativa realista), a resolução 
em relação à estrutura física do DNA ainda seria muito baixa, em outras 
palavras, os detalhes do mapa seriam muito limitados. 
Um segundo problema dos mapas genéticos é que nem sempre 
eles correspondem exatamente às distâncias físicas entre os genes. Os 
mapas genéticos baseiam-se nas taxas de crossing over, que variam de 
uma parte de um cromossomo para outro, portanto, as distâncias em 
um mapa genético são apenas aproximações das distâncias físicas reais 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 17
ao longo de um cromossomo. Existem algumas discrepâncias entre 
as distâncias e até entre as posições de alguns genes. Apesar destas 
limitações, os mapas genéticos são críticos para o desenvolvimento dos 
mapas físicos e o sequenciamento dos genomas inteiros.
Um outro recurso que pode ser usado em consonância com o 
mapa genético é o mapa físico, no qual analisam diretamente o DNA 
e os genes são colocados em relação às distâncias medidas em um 
número de pares de bases, quilobases ou megabases. Para a criação 
desse mapa são utilizadas técnicas como mapeamento de restrição, 
que determina a posição dos sítios de restrição do DNA. Isso são feitas 
por etapas. A primeira etapa consiste na avaliação do segmento de DNA 
na eletroforese em gel, para determinar o número de sítios de restrição 
ao DNA e as distâncias entre elas, as quais podem ser avaliadas pelas 
posições das bandas no gel. A segunda etapa é o encontro da ordem ou 
da localização exata dos sítios de restrição. 
Para mapear os sítios de restrição, uma amostra de DNA é 
cortada com uma enzima de restrição e outra amostra é cortada com 
uma enzima de restrição diferente. Uma terceira amostra é cortada 
com ambas as enzimas de restrição juntas (uma dupla digestão). Os 
fragmentos de DNA produzidos por estas digestões de restrição são 
separados por eletroforese em gel e seus tamanhos são comparados. A 
sobreposição no tamanho dos fragmentos produzidos pelas digestões 
pode ser usada para posicionar os sítios de restrição na molécula de 
DNA original. Assim, são feitos mais mapeamento de restrição com 
várias enzimas de restrição, usadas sozinhas ou em várias combinações, 
produzindo muitos fragmentos de restrição. 
Com segmentos longos de DNA (maiores que 30 kb), programas 
de computador são usados para determinar os mapas de restrição e o 
mapeamento de restrição pode ser facilitado ao se marcar uma extremidade 
de um grande fragmento de DNA com radioatividade ou ao identificar a 
extremidade com o uso de uma sonda. Os mapas físicos, como os mapas 
de restrição de fragmentos de DNA ou até de cromossomos inteiros, 
são criados para análise genômica. Estes mapas compridos são criados 
ao combinar os mapas de fragmentos genômicos curtos e sobrepostos. 
Existem várias técnicas adicionais para criar mapas físicos, incluindo: 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial18
mapeamento de sítio de sequência marcada (STS), que localiza as posições 
de sequências curtas únicas de DNA em um cromossomo, hibridização 
in situ, na qual os marcadores podem ser mapeados visualmente nas 
localizações nos cromossomos e sequenciamento de DNA.
No entanto, para melhorar a análise dos genes e ideal seria 
o sequenciamento do genoma inteiro, no entanto, isso exigiria que o 
DNA fosse rompido em milhares de fragmentos menores para a análise. 
Entretanto, a dificuldade está em posicionar essas pequenas sequências 
de volta na ordem correta. Assim, para montar esses pequenos 
fragmentos podem ser usados o mapa e o sequenciamento Shotgun 
(método de sequenciamento) do genoma completo. 
No caso do sequenciamento baseado no mapa, os fragmentos 
curtos sequenciados são montados em uma sequência de genoma 
inteiro criando primeiro os mapas genéticos e físicos detalhados do 
genoma, que fornecem localizações conhecidas dos marcadores 
genéticos (sítios de restrição, outros genes ou sequências de DNA 
conhecidas) em intervalos regulares ao longo de cada cromossomo. 
Estes marcadores são usados posteriormente para ajudar a alinhar os 
fragmentos curtos sequenciados na sua ordem correta.
Figura 4: Sequenciamento do mapa
Fonte: http://bit.ly/39YCwEI 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 19
Após essa etapa, os cromossomos ou os fragmentos maiores são 
separados por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) ou citometria 
de fluxo. A eletroforese convencional não é usada porque não consegue 
separar segmentos muito grandes de DNA, como cromossomos 
inteiros, mas a PFGE consegue separar grandes moléculas de DNA ou 
cromossomo inteiro em um gel, pois altera periodicamente a orientação 
de um campo elétrico. E na citometria de fluxo, os cromossomos são 
classificados opticamente pelo tamanho. 
Cada cromossomo (ou às vezes, o genoma inteiro) é então 
cortado por digestão parcial com enzimas de restrição. A digestão parcial 
significa que as enzimas de restrição atuam por um tempo limitado de 
modo que nem todos os sítios de restrição em cada molécula de DNA 
sejam cortados. A digestão parcial produz um conjunto de grandes 
fragmentos de DNA sobrepostos, que são clonados com o uso de 
cosmídios, cromossomos artificiais de levedura (YACS) ou cromossomos 
bacterianos artificiais. 
Quando os grandes clones de inserção são montados na ordem 
correta no cromossomo, um subconjunto de clones sobrepostos que 
cobrem eficientemente o cromossomo inteiro pode ser selecionado para 
o sequenciamento cujo objetivo é selecionar o número mínimo de clones 
necessários para representar o cromossomo. Cada um dos grandes clones 
de inserção selecionados é clivado em fragmentos sobrepostos menores 
que são clonados. Estes clones menores (chamados de pequenos clones 
de inserção) são sequenciados e examinadas quanto à sobreposição, o 
que permite que sejam corretamente montadas para originar a sequência 
dos grandes clones de inserção. Uma quantidade suficiente de pequenos 
clones de inserçãosobrepostos é sequenciada para garantir que o genoma 
inteiro seja sequenciado várias vezes. Finalmente, o genoma inteiro é 
montado ao colocar as sequências de todos os contigs sobrepostos. 
Mesmo assim, os espaços no mapa do genoma ainda existem e precisam 
ser preenchidos ao usar outros métodos.
No sequenciamento Shotgun do genoma completo, pequenos 
clones de inserção são preparados diretamente a partir do DNA 
genômico e sequenciados. A utilização de softwares auxilia na montagem 
do genoma inteiro por meio de exame da sobreposição dos pequenos 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial20
clones de inserção. Uma vantagem deste tipo de sequenciamento é que 
os pequenos clones de inserção podem ser colocados em plasmídeos, 
que são simples e fáceis de manipular. A exigência de sobreposição 
significa que a maior parte do genoma será sequenciada múltiplas vezes 
(de 10 a 15 vezes). O número médio de vezes que um nucleotídeo no 
genoma é sequenciado é chamado de cobertura de sequenciamento. 
Figura 5: Sequenciamento Shotgun do genoma completo
Fonte: http://bit.ly/39YCwEI
SAIBA MAIS:
Um suporte nas análises desses dados tem sido o campo 
da Bioinformática. Essa ferramenta se concentra no 
desenvolvimento de bancos de dados, algoritmos de 
pesquisa em computador, programa de previsão gênica e 
outras ferramentas analíticas usadas para dar sentido aos 
dados de sequência de DNA, RNA e proteínas.
Assim, após determinar a sequência de genes é importante 
detectar a função dos genes, por meio da genômica funcional. Os 
objetivos da genômica funcional incluem a identificação de todas as 
moléculas do RNA transcritas a partir de um genoma, o qual chamamos 
de transcriptoma e das proteínas, a qual chamamos de proteoma, e o 
estudo do proteoma é proteômica.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 21
Para a análise proteômica, é necessário a separação das proteínas, 
identificação e quantificação. Uma técnica usada para esse fim é a de 
eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE), no 
qual as proteínas são separadas em uma dimensão pela carga elétrica, 
separadas em uma segunda dimensão pela massa e então coradas. O 
princípio da técnica é a separação das diferentes proteínas em manchas, 
com o tamanho de cada mancha proporcional à quantidade de proteína 
presente. Um típico gel 2D-PAGE pode ter muitas centenas a milhares 
de manchas. Ver figura 09.
Figura 6: Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida 
(2D-PAGE) pode ser usada para separar as proteínas celulares
Fonte: http://bit.ly/2NeSjWm
Para melhorar a identificação de proteínas, ainda podem ser 
usadas outras técnicas como a cromatografia líquida e a espectrometria 
de massa. A cromatografia líquida, ocorre a partir de uma mistura de 
moléculas a qual são dissolvidas em um líquido e passada por uma 
coluna preenchida com partículas sólidas. As diferentes afinidades para 
as fases líquida e sólida fazem com que alguns componentes da mistura 
viajem pela coluna mais lentamente do que outros, resultando na 
separação dos componentes da mistura, já na espectrometria de massa, 
uma molécula é ionizada e é determinada sua taxa de migração em um 
campo elétrico. Como pequenas moléculas migram mais rapidamente 
do que as maiores, a taxa de migração consegue determinar com 
exatidão a massa da molécula. Ver figura 10.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial22
Figura 7: Análise da espectrometria de massa
Fonte: wikipedia
Assim, para a análise genética são necessárias diversas ferramentas 
moleculares e proteicas para identificar o gene bem como a sua função. 
Identificação dos genes de doenças 
humanas e fatores de suscetibilidade 
Na clonagem posicional, um gene de doença é identificado a partir 
apenas do conhecimento de sua localização cromossômica aproximada. 
O gene candidato pode ser identificado pelo conhecimento prévio de 
um homólogo em outras espécies, por um paciente que possui tanto um 
fenótipo de interesse como uma anormalidade cromossômica estrutural, 
ou pela análise de ligação. O sucesso depende de uma interação entre 
o trabalho clínico, a bancada de laboratório e a análise de bancos de 
dados, sendo esta última etapa uma das mais importantes, devido ao 
acúmulo de informações sobre os genomas.
Para que ocorra a clonagem posicional devem ser cumpridos 
04 etapas: definição da região candidata, obtenção dos clones de DNA 
para toda a região, identificação de todos os genes na região, triagem de 
mutações e teste de genes candidatos na identificação das mutações 
na população afetada. No caso de doenças mendelianas, é necessário 
verificar o número de meioses disponíveis para a análise da ligação. A 
resolução será alcançada quando o último recombinante for mapeado 
entre os marcadores intimamente espaçados. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 23
Para realizar a identificação de todos os genes, hoje em dia pode-se 
usar como ferramenta um navegador genômico o Ensembl (http://www.
ensembl.org/) ou o Santa Cruz (http://genome.cse.ucsc.edu/) para mostrar 
todos os genes definidos e possíveis de uma região candidata. Para a 
identificação de mutações devem ser usadas amostras de uma coleção 
de pessoas afetadas não relacionadas sequenciadas. Para isso deve ser 
feita a análise de todos os éxon, e cada éxon deste gene é individualmente 
amplificado por PCR e então sequenciado. Na escolha dos genes para 
sequenciamento, faz sentido começar com os mais promissores, embora a 
facilidade de análise seja também um dos fatores a considerar.
A escolha do gene tem a ver com o nível de expressão, ou seja, 
deve possuir um padrão de expressão consistente com o fenótipo da 
doença. Essa expressão não precisa estar limitada ao tecido afetado, mas 
o gene candidato deve, ao menos, ser expresso no local onde a doença 
é observada e no período, ou antes do período, no qual a patologia 
doença se tornou evidente. As técnicas usadas para analisar a expressão 
do gene podem ser a reação de cadeia em polimerase em tempo real 
(RT-PCR), nothern blotting ou por análise em série da expressão gênica 
(SAGE), uma técnica que avalia a expressão de RNA mensageiro. Outras 
técnicas como hibridização in situ ou imuno-histoquímica podem avaliar 
padrões de expressão. 
Após essa análise, é necessário identificar a função do gene. Para 
um gene novo, análises de sequência fornecerão indícios de sua função 
por meio do reconhecimento de motivos de sequência comuns tais como 
domínios transmembrana ou motivos de tirosina quinases. Estes podem 
ser suficientes para priorizar um gene como candidato, considerando-se 
a patologia da doença. 
Anormalidades cromossômicas podem, algumas vezes, fornecer um 
método alternativo para a localização de um gene de doença, em substituição 
à análise de ligação. Para condições que são normalmente esporádicas, 
como muitas doenças dominantes graves, aberrações cromossômicas 
podem proporcionar o único método de se chegar a um gene candidato.
Uma quebra cromossômica pode causar a perda de função de 
um gene se esta interrompe a sequência codificadora daquele gene 
ou se separa a sequência codificadora de uma região regulatória que 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial24
age em cis. Alternativamente, ela pode causar um ganho de função, por 
exemplo, aproximando éxons de dois genes para criar um novo gene 
quimérico. Em ambos os casos, os pontos de quebra fornecem uma 
pista valiosa da localização física exata do gene da doença. A posição 
do ponto de quebra é mais facilmente definida utilizando a técnica de 
hibridização in situ (FISH).
Entretanto, para a avaliação de microdeleções e de microdupli-
caçoes deve-se usar a técnica de hibridização genômica comparativa 
(CGH, do inglês comparative genomic hybridization). Para realizar essa 
técnica de CGH, as amostras de DNA de um paciente e de um controle 
não afetado são marcadas com dois fluorocromos diferentes. Quantidades 
equivalentesdas duas amostras de DNA são misturadas e hibridizadas a 
um microarranjo de clones de um indivíduo normal. Após a lavagem da 
sonda não ligada, a fluorescência é medida nos dois comprimentos de 
onda, e a proporção vermelho-verde é calculada para cada clone. 
Independentemente da técnica utilizada, é importante confirmar 
os resultados por FISH. Anormalidades balanceadas podem não ser 
detectadas, e os resultados para duplicação ou amplificação podem ser 
incapazes de distinguir repetições em tandem de repetições dispersas. A 
principal limitação destas técnicas está na interpretação dos resultados.
Além disso, um gene de doença pode ser identificado por meio do 
conhecimento de seu produto gênico devido à degeneração do código 
genético, a sequência gênica predita é também degenerada. Uma sonda 
utilizada para varrer uma biblioteca de cDNA deve conter um coquetel de 
todas as sequências possíveis que poderiam codificar aqueles aminoácidos. 
Considerando que apenas uma sonda da mistura corresponderá à sequência 
autêntica, é importante manter o número de diferentes oligonucleotídeos 
baixo para aumentar a probabilidade de identificar o alvo correto.
SAIBA MAIS:
Para entender melhor a influência da genética leia o artigo 
Avaliação genética, triagem familiar e exercício, disponível 
em https://bit.ly/2m06EuZ
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 25
RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo 
tudinho? Agora, só para termos certeza de que você 
realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo, 
vamos resumir tudo o que vimos. Você deve ter aprendido 
que os erros metabólicos hereditários são distúrbios 
bioquímicos determinados geneticamente, nos quais 
um defeito enzimático especifico produz um bloqueio 
metabólico que pode originar uma doença. Alguns erros 
metabólicos são assintomáticos e não acarretam doenças, 
como, por exemplo, a redução da sensibilidade gustativa à 
feniltiocarbamida; outros são assintomáticos até que sejam 
evidenciados pela ingestão de certas substâncias, como 
a deficiência da enzima glicose-6-fosfatodesidrogenase 
(G6PD). Por outro lado, certa fração dos erros metabólicos 
é sintomática, mas não causa grandes problemas clínicos 
(p. ex., alcaptonúria). A maioria deles, no entanto, manifesta-
se com sintomas agudos, e só são compatíveis com a 
sobrevivência normalmente se sua causa for eliminada (p. 
ex., galactosemia). Assim, surge a genômica e proteômica 
para a análise do gene e das proteínas. Para essa análise 
inicial são feitos mapas genéticos que posicionam os 
genes em relação a outros genes ao determinar as taxas 
de recombinação. O sequenciamento de um genoma 
inteiro exige a clivagem dele em pequenos fragmentos 
sobrepostos cujas sequências de DNA podem ser 
determinadas em reações de sequenciamento. As 
sequências individuais podem ser ordenadas em uma 
sequência de genoma inteiro usando uma abordagem 
baseada no mapa, na qual os fragmentos são montados 
em ordem ao usar mapas genéticos e físicos previamente 
criados ou com o uso de uma abordagem do genoma 
completo pela estratégia Shotgun, no qual é usada a 
sobreposição entre os fragmentos para montá-los em uma 
sequência de genoma inteiro. Hoje em dia, praticamente 
todos os genomas são sequenciados usando o método 
Shotgun do genoma completo. E a proteômica determina 
o conteúdo de proteína de uma célula e as funções 
destas proteínas, as proteínas intracelulares podem ser 
separadas e identificadas com o uso de espectrometria de 
massa, cromatografia líquida ou ainda citometria de fluxo.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial26
RESUMINDO:
A proteômica estrutural tenta determinar a forma 
tridimensional das proteínas. Assim, existem várias maneiras 
pelas quais um gene para doença pode ser identificado. Isso 
pode ser feito a partir do conhecimento do produto proteico 
ou de um gene relacionado (em humanos ou em outras 
espécies) para a correta identificação do gene. De maneira 
mais frequente, primeiro a localização cromossômica do 
gene é definida e a seguir é feita uma busca nesta região 
para um gene que contenha mutações em pacientes, 
mas não em controles (clonagem posicional). Algumas 
vezes, anormalidades cromossômicas podem sugerir uma 
localização. Translocações, inversões ou deleções podem 
causar problemas clínicos pela interrupção ou deleção de 
genes. Se dois pacientes não relacionados compartilham 
um ponto de quebra cromossômico e também uma 
característica clínica específica, talvez um gene responsável 
por esta característica esteja localizado naquele ponto de 
quebra ou próximo a ele. Mais frequentemente, entretanto, 
genes de doenças são localizados por análise de ligação em 
um conjunto de famílias onde a doença está segregando.
Genética das doenças complexas 
As principais doenças complexas genéticas são artrite 
reumatoide, diabetes mellitus, diabetes mellitus insulinodependente, 
doenças cardiovasculares, doenças cardíacas congênitas, doença 
arterial coronariana, hipertensão, doença de Hirschsprung, obesidade, 
osteoporose e febre reumática. A suscetibilidade genética pode 
ocorrer devido à herança monogênica de um produto gênico anormal 
envolvido num padrão metabólico determinado, como a doença arterial 
coronariana precoce devida à hipercolesterolemia familiar ou hereditária. 
No diabetes mellitus tipo 2, o pâncreas não produz insulina 
suficiente ou o organismo não consegue usar corretamente a insulina, 
resistindo à sua ação; por isso, quantidades pequenas de insulina 
conseguem entrar dentro da célula. A prevalência dessa doença é na 
meia-idade e no idoso, mas, geralmente, e ́ menos grave do que o tipo 1. A 
chance de risco maior são em pacientes acima de 45 anos, com histórico 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 27
familiar de diabetes, excesso de peso associado ao sedentarismo, baixos 
níveis de colesterol do tipo HDL ou altos níveis de triglicerídeos, mulheres 
que tiveram diabetes gestacional e crianças que não dependem de 
insulina para o controle glicêmico. O diagnóstico é baseado em três fases 
clínicas como a normalidade da glicemia apesar da resistência à insulina, 
hiperglicemia pós-prandial e diminuição dos níveis de insulina em estado 
de hiperglicemia. Em adição à hiperglicemia, ocorre a desregulação 
metabólica resultante da disfunção das células das ilhotas de Langerhans 
e a resistência à insulina causam aterosclerose, neuropatia periférica, 
doença renal, cataratas e retinopatia.
Estudos tem mostrado a detecção do polimorfismo de compri-
mento de fragmento de restrição na extremidade 5’ do gene da insulina, 
mapeado no braço curto do cromossomo 11. Um dos alelos desse 
polimorfismo está associado com o diabetes mellitus não insulino 
dependente, pode estar associado na regulação da síntese da insulina. 
Assim, os fatores genéticos revelam herança multifatorial, os quais estão 
intimamente relacionados com os fatores ambientais como idade, sexo, 
etnia, condicionamento físico, obesidade, dieta e uso de fumo, bem 
como o efeito da distribuição de gordura e a sensibilidade à insulina 
bem como a excreção. 
O diabetes mellitus insulino dependente é um distúrbio autoimune 
da hemostasia da glicose, o qual é caracterizado pela deficiência de 
insulina causada pela destruição das células beta e pela suscetibilidade a 
cetoacidose na ausência de reposição da insulina. Os sinais clássicos são 
polidipsia, polifagia e poliúria, que resultam da diurese osmótica e da sede 
secundária, induzida pelo processo da hiperglicemia. Existem pelo menos 
seis alelos (HLA-B8, HLA-B15, HLA-B18, HLA-C3, HLA-DR3 e HLA-DR4) 
desse sistema que conferem ao seu portador um risco aumentado de vir 
a apresentar diabetes do tipo 1, bem como três alelos (HLA-B7, HLA-B12 
e HLA-DR2) que, ao contrário, protegem seu portador contra esse risco.
A artrite reumatoide (AR) é caracterizada pela presença 
de inflamações frequentes nas articulações, que podem levar a ̀ 
incapacidade funcionaldos pacientes, com um complexo componente 
genético. É uma doença que acomete as pequenas articulações, o que 
leva a deformidades pela erosão da cartilagem e do osso. Essa doença 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial28
afeta muitos órgãos e tecidos, sobretudo nas articulações como os 
punhos, mãos, cotovelos, ombros e pescoço, levando à deformidades. 
O principal sinal da doença é muita dor nas articulações afetadas, dor, 
calor, inchaço, simetria das articulações, movimentos limitados, rigidez 
matinal, fraqueza e fadiga. 
A fisiopatologia ocorre pela ação das células T e B autorreativas, 
que levam ao quadro de sinovite, à infiltração celular e a um processo 
desorganizado de destruição e remodelação óssea. A membrana 
sinovial é a principal fonte de citocinas pró-inflamatórias e proteases 
e, em conjunto com osteoclastos e condrócitos, promove a destruição 
articular. Múltiplos fatores genéticos, incluindo o sistema HLA (HLA-
DRB1; 142857), influenciam a suscetibilidade à AR, a associação mais 
citada de AR e sistema HLA é o lócus HLA-DR4. O diagnóstico da 
AR é feito por meio da associação de dados clínicos, laboratoriais e 
radiográficos. Os exames laboratoriais incluem a determinação do 
fator reumatoide, porém os resultados devem ser analisados de forma 
criteriosa. E além disso, pode-se dosar os anticorpos anti-CCP o qual 
possui elevada especificidade e sensibilidade semelhante ao FR, o que 
torna a determinação do anti-CCP uma ferramenta de grande utilidade 
para o diagnóstico da AR.
As doenças cardiovasculares são o resultado de um estilo de vida 
inadequado, fatores psicológicos, sedentarismo, ausência de atividade 
física, dieta mal balanceada e tabagismo. A idade bem como o histórico 
familiar são importantes porque podem aumentar a chance de risco de 
doença cardiovascular. As doenças cardíacas congênitas podem ser 
devido a agentes teratogênicos como drogas, elementos ambientais 
e infecções. As principais alterações cromossômicas observadas são 
numéricas e correspondem à presença adicional ou à falta de um 
cromossomo. Dentre elas, temos a trissomia livre do cromossomo 21 (+21), 
a principal constituição cromossômica observada em indivíduos com 
síndrome de Down, trissomia livre do cromossomo 18 (+18), responsável 
pela síndrome de Edwards. Anormalidades recorrentes, mas menos 
frequentes, consistiram da trissomia livre do cromossomo 13 (síndrome 
de Patau), da monossomia do cromossomo X (síndrome de Turner), da 
síndrome de Klinefelter e da triploidia. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 29
As doenças arteriais coronarianas tem como fatores de risco o gênero 
do sexo masculino, idade, histórico familiar da doença, hiperlipidemia, 
hipercolesterolemia, hipertensão, diabetes, obesidade, baixos níveis de 
lipoproteínas de alta densidade (HDL) e altos níveis de LDL, polimorfismos 
lipoproteicos, como altos níveis de apolipoproteína B, apolipoproteína A1 
(apo A1), lipoproteína a – Lp(a) – e a enzima conversora da angiotensina I, 
além de associação coma hipercolesterolemia familiar. Outros associados 
são os genéticos e ambientais, como vida sedentária, dieta rica em 
colesterol, tabagismo, caracterizado por ansiedade. A análise laboratorial é 
feita a partir da análise do polimorfismo genético da apolipoproteína E ou 
apo E (codificada por um gene do lócus, no cromossomo 19q13.2; OMIM 
107741), o qual está relacionado com os níveis lipídicos. Essa lipoproteína 
plasmática está envolvida no transporte e no metabolismo dos lipídeos, 
sendo a principal lipoproteína associada ao aumento dos riscos de DAC. A 
apo E liga-se aos receptores de LDL nas superfícies celulares, os quais são 
responsáveis pela captação de colesterol pela célula.
A hipertensão arterial é um fator de risco das doenças cardiovascu-
lares é a causa mais importante de insuficiências cardíaca e renal, bem 
como de morte súbita. As pessoas com hipertensão enquadram-se 
em dois grupos: no primeiro grupo, a manifestação da hipertensão se 
dá, geralmente, no início da vida adulta é uma consequência de outro 
distúrbio, por exemplo, doença renal ou anomalias de algumas glândulas 
endócrinas, o que é chamado de hipertensão secundária; no segundo 
grupo, o mais comum, a hipertensão começa na meia-idade, sem 
causa reconhecida, sendo denominada hipertensão essencial. O gene 
associado é o C3 além da associação de vários lócus como o gene HYT1 
(OMIM 603918), localizado no cromossomo 17q, HYT2 (OMIM 604329), no 
cromossomo 15q, e HYT3 (OMIM 607329), no cromossomo 2p.
A obesidade é uma síndrome plurimetabólica que pode ser 
definida tecnicamente de acordo com o IMC, que é o peso corporal em 
relação à altura e que é dado pela medida do peso dividido pela altura 
ao quadrado (peso/altura2). Mutações heterozigotas no gene do receptor 
da melanocortina 4 (MC4R; OMIM 155541) causam obesidade como uma 
característica isolada. Distúrbios autossômicos recessivos, cuja principal 
característica è a obesidade, incluem deficiência de leptina (OMIM 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial30
164160), deficiência do receptor de leptina (OMIM 601007), deficiência 
do pró-hormônio convertase 1 (OMIM 162150) e deficiência da pró-
opiomelanocortina (OMIM 609734). Associados a esses distúrbios, estão o 
hipogonadismo hipogonadotrófico, o hipoadrenalismo e a baixa estatura.
E por fim, a osteoporose é caracterizada como diminuição da 
densidade óssea e é uma das doenças mais comuns em mulheres 
pós menopausa. Há uma possível interação entre o gene VDR (OMIM 
601769), do receptor da vitamina D, e o gene ESR1 (OMIM 133430), do 
receptor de estrogênio 1, associada diretamente com a densidade óssea. 
O estrogênio influencia o metabolismo e o crescimento ósseo, e esse 
efeito é dependente de receptores nucleares. Outro gene associado 
com a determinação da densidade mineral óssea é CALCR (OMIM 
114131), do receptor da calcitonina e o gene do colágeno tipo I alfa 1 
(COLIA1; OMIM 120150) está associado à massa óssea e à predisposição 
a fraturas. Outro gene envolvido no processo da osteoporose e ́ o da 
apolipoproteína E (APOE; OMIM 107741), que pode atuar no aparecimento 
de fraturas, alterando a absorção de vitamina K. Assim, a pesquisa em 
genética pode contribuir na elucidação das doenças complexas por 
utilizar metodologias capazes de identificar os genes. 
RESUMINDO:
Há doenças que não apresentam um erro metabólico 
específico identificado, nem um tipo de herança definido, 
mas sua agregação familiar indica que estão sob a influência 
de alguns fatores genéticos. Essas doenças compõem o 
grupo das doenças complexas. As doenças mais comuns da 
espécie humana não estão relacionadas a mutações em um 
ou dois genes, mas são devidas a polimorfismos genéticos 
combinados com a ação de fatores ambientais. Um novo 
paradigma para a investigação dessas doenças são o 
mapeamento de da variação genética, útil na descoberta 
de genes relacionados às doenças complexas. Suas 
principais aplicações são comparar padrões de SNPs de 
indivíduos afetados com os padrões de indivíduos normais, 
identificar as variações espalhadas no genoma e descobrir 
abordagens para lidar com as doenças no nível genético, 
desenvolvendo terapêuticas mais adequadas e eficientes.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 31
RESUMINDO:
As diferentes doenças podem ser consideradas dentro 
de um espectro relacionado com os papéis relativos 
da herança e do ambiente em sua etiologia. Esse 
espectro vai desde as doenças que ocorrem somente 
em indivíduos com uma determinada constituição 
genética, independentemente das condições ambientais 
– acondroplasia, hemofilia, fenilcetonúria – passando 
pelo grupo das doenças complexas que não apresentam 
padrão simples de herança e mostram a contribuição de 
múltiplos fatores genéticos que interagem entre si e com 
fatores ambientais de um modo complexo, e atingindo 
outro extremo, onde estão agrupadas as doenças que 
dependem quaseexclusivamente de fatores ambientais (p. 
ex., traumatismo, rubéola e tuberculose). A suscetibilidade 
genética para uma dada doença complexa pode ocorrer 
por meio da herança monogênica de um produto gênico 
anormal envolvido em um padrão metabólico determinado, 
como a doença arterial coronariana precoce devida à 
hipercolesterolemia familiar. Em um indivíduo com uma 
mutação no gene dessa doença, a suscetibilidade genética 
é o principal determinante do desenvolvimento da doença 
arterial coronariana, mas isso pode ser modificado por 
alterações ambientais, como a redução da ingestão de 
colesterol e a prevenção de outros fatores de risco, como 
obesidade, falta de exercícios e tabagismo. A herança 
monogênica da suscetibilidade a uma determinada 
doença não acarreta, necessariamente, o desenvolvimento 
dessa doença. Em alguns casos, a exposição a fatores 
ambientais específicos será o principal determinante desse 
desenvolvimento. Para entender a genética das doenças 
complexas, o investigador pode abordar o problema de 
diversas maneiras: comparar sua prevalência e incidência 
em vários grupos populacionais diferentes; estudar os 
efeitos da migração; investigar a ocorrência da doença entre 
parentes; comparar a frequência em gêmeos idênticos e 
fraternos; determinar o efeito de alterações ambientais em 
estudos de adoção; estudar a associação dessas doenças 
com diversas características, como os grupos sanguíneos, 
sistema CHP e os polimorfismos bioquímicos e de DNA.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial32
Testes genéticos utilizados no diagnóstico 
das doenças genéticas
Os testes podem ser realizados com DNA ou com RNA. O RNA 
deve ser obtido a partir de um tecido no qual o gene em questão é 
expresso, e estas amostras precisam ser manipuladas com muito mais 
cuidado do que amostras de DNA. Entretanto, análises de RNA podem 
ser mais econômicas para um gene que possui vários éxons pequenos e 
podem revelar splicings anormais que não aparecem em testes de DNA.
A amostra de DNA quando chega ao laboratório precisam ser 
feitas algumas perguntas, tais como o paciente possui alguma mutação 
em algum gene que possa explicar a doença? Essa pergunta deve 
ter sido responda previamente pelo médico, uma vez que os testes 
genéticos precisam ser direcionados, pois existem milhares de variações 
específicas no DNA. Outra pergunta que dever feita é o paciente possui 
alguma mutação neste gene específico que possa ser a causa da 
doença? O paciente possui uma mutação específica neste gene em 
particular, por exemplo, uma deleção de três bases no códon para 
fenilalanina 508 no seu gene CFTR?
Com base nessas respostas, surge um outro questionamento, o 
que testar e por que testar? O DNA pode ser obtido a partir a partir de 
qualquer célula nucleada e o RNA pode ser avaliado quando se quer 
saber a expressão de uma proteína, por exemplo. 
Diversos materiais biológicos podem ser a fonte de DNA ou de 
RNA. O sangue é a melhor fonte de DNA, a raspagem bucal pode ser 
usada como fonte de DNA mas tem como limitação a quantidade e a 
qualidade da amostra, pois pode vir com contaminantes. Tecidos como 
pele e músculos são boa fonte de RNA, porém precisa ser o local onde 
o gene está expresso e para isso é necessário uma biópsia, por isso tem 
como desvantagem o fato de ser invasivo. 
Raízes capilares, sêmen, pontas de cigarro podem ser usadas para 
DNA especialmente para análises forenses ou toxicológicas, célula única 
de um blastocisto pode ser usada para diagnósticos de pré-implantação 
e a principal desvantagem é que requer um profissional bem treinado, 
vilosidades coriônicas pode ser usada para fins diagnósticos no pré-
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 33
natal entre 9-14 semanas, fluido amniótico é uma fonte rica de DNA mas 
só devem ser usadas para testes entre 15 e 20 semanas de gestação, 
cartão de Guthrie papel absorvente usado para o teste do pezinho para 
a triagem neonatal, caso os cartões fiquem ativados também servem de 
fonte para DNA. 
Se um gene precisa ser explorado para se obter informações 
acerca de mutações desconhecidas, deve ser testado o RNA por PCR 
com transcriptase reversa, uma vez que testar diretamente o DNA 
envolve amplificar e testar cada éxon separadamente, e isso pode ser 
um grande trabalho em um gene com muitos éxons, além de demora 
na emissão do resultado. Contudo, alguns cuidados são necessários 
quanto a análise do RNA, a saber, a manipulação deve ser feita com 
cuidado e de forma rápida, pois, o DNA se degrada de uma maneira 
muito rápida, o gene de interesse precisa estar expresso no tecido feita 
a biópsia, além disso, podem ser detectados um número muito baixo 
de transcritos ilegítimos, e além disso mutações truncadas geralmente 
resultam em um mRNA instável devido ao decaimento mediado por 
moléculas sem sentido, de maneira que o produto de RT-PCR de uma 
pessoa heterozigota pode apresentar apenas o alelo normal.
Um gene é normalmente investigado para mutações por meio 
de sequenciamento. Para o sequenciamento podem ser usados alguns 
métodos como mobilidade de heterodúplices, que possui como 
vantagem o fato de ser simples, barato e de uso simples e as desvanta-
gens são aplicabilidade em sequências inferiores a 200 pares de 
bases, sensibilidade limitada e não revela a alteração, outra técnica é a 
cromatografia líquida de alto desempenho desnaturante que possui como 
vantagem ser rápida, alta eficiência e é quantitativa e como desvantagens 
o equipamento é caro e também não revela a posição da alteração, ainda 
tem o método de polimorfismo de conformação de fita simples que tem 
como vantagem a alta sensibilidade e como desvantagem a plataforma é 
exclusiva do aparelho Light-Cycler e por fim, têm-se o teste de truncagem 
de proteínas que possui alta sensibilidade para análise de mutações de 
término de síntese, indica a posição da alteração e como desvantagens 
o fato de ser útil apenas na identificação de mutações de término de 
síntese, metodologia cara e difícil e geralmente trabalha com RNA.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial34
Os métodos de truncamento das proteínas são baseados na 
tradução. É um teste específico para verificar alterações do quadro de leitura 
(frameshifts), sítios de splice ou mutações sem sentido que criam um códon 
de terminação prematura. É um método que pode ser utilizado para avaliar 
determinadas mutações como polipose adenmatosa ou câncer de mama 
associado ao BRCA1. Esse ensaio ignora substituições de bases silenciosas 
ou sem sentido e revela a localização aproximada de qualquer mutação. 
Além dessas técnicas, ainda pode-se detectar padrões de metilação do DNA.
Metilação do DNA
A metilação do DNA está associado ao controle de expressão 
gênica. A análise da metilação é importante para algumas doenças, 
como a síndrome do X frágil, porque a expansão da repetição do gene 
FMR1 dispara a metilação do promotor e a metilação silencia o gene e 
causa a síndrome, na síndrome de Prader–Willi, Angelman, Beckwith-
-Wiedemann e Russell–Silver também ocorrem padrões de metilação 
genitor-específico em loci impritados e em tumores, uma vez que genes 
supressores de tumor geralmente são silenciados por metilação. 
Estudos de metilação no genoma inteiro utilizam a imunoprecipitação 
da cromatina com um anticorpo contra o DNA metilado e o estado de 
metilação de uma sequência individual é feito a partir de digestão com 
enzima de restrição na qual a enzima HpaII cliva apenas a sequência 
CCGG não metilada, enquanto a MspI cliva qualquer sequência CCGG, 
estando ou não metilada. Assim, o DNA genômico metilado apresenta 
diferentes padrões de fragmentos de restrição com essas duas enzimas. 
EXPLICANDO MELHOR:
Ensaios de heterodúplices são ensaios de hibridização 
que envolvem, a ligação da amostra-teste à superfície de 
um suporte sólido ou a fixação da população de sondas 
a esse suporte. A ligação da população de moléculas aosuporte sólido é feita de maneira a permitir que sequências 
diferentes sejam fixadas em posições definidas na superfície 
sólida, mas não necessariamente em apenas uma das 
extremidades da superfície.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 35
Alternativamente, um molde de PCR contendo uma sequência CCGG pode 
ser digerido com qualquer uma destas enzimas antes da amplificação. Se 
a sequência CCGG estiver metilada, o molde não será clivado por HpaII, 
e a PCR produzirá um produto e outro ensaio é a modificação bissulfito, 
que quando ocorre o tratamento do DNA pelo bissulfito de sódio, a citosina 
(exceto a 5-metilcitosina) é convertida em uracila.
Outros métodos de investigação
Ainda pode-se investigar uma alteração de sequência específica 
especialmente nos casos de diagnóstico de doenças com heterogeneidade 
alélica limitada, diagnóstico familiar, polimorfismo, genotipagem de SNPs. 
Os métodos que podem ser utilizados para essa investigação 
são PCR que pode ser utilizado quando a mutação cria ou elimina um 
sítio de restrição natural, hibridização de DNA amplificado por PCR a 
oligonucleotídeos núcleo específicos em um dot plot ou chip gênico o 
qual avalia mutações de pontos específicos e conseguem avaliar grande 
número de mutações ou SNPs, PCR com primers alelo-específicos é 
usado para mutações de ponto únicas e nesse ensaio o desenho dos 
primers é crítico para o sucesso do resultado, extensão de primer de 
nucleotídeo único é usado para mutações de pontos específicos e a leitura 
precisa ser realizada em um sequenciador de DNA, ensaio de ligação de 
oligonucleotídeo (OLA) também avalia mutações de ponto específicas e 
os testes precisam ser feitos em multiplex, pirossequenciamento é um 
método de larga escala de poucos nucleotídeos em posições específicas 
e o resultado é quantitativo, espectrometria de massa gera resultados 
quantitativos e é rápido, PCR com primers localizados nas extremidades 
de um ponto de translocação em uma amplificação bem sucedida 
mostra a presença da deleção suspeita ou do rearranjo especificado. 
A localização do primer comum pode ser escolhida para originar 
produtos de diferentes tamanhos para diferentes mutações, de maneira 
que os produtos de uma reação de PCR multiplex possam ser separados 
por eletroforese. Os pares de primers específicos para a mutação também 
podem ser projetados para originar produtos distinguíveis. Por exemplo, 
eles podem ser marcados com fluorescências diferentes ou com outras 
marcações, ou acrescidos de extensões 5 de diferentes tamanhos. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial36
Geralmente, os íntrons são muito maiores do que os éxons 
que flanqueiam, e por isso pontos de quebra aleatórios em um gene 
têm maior probabilidade de estarem em um íntron. Desta maneira, 
deleções ou duplicações parciais de uma sequência gênica em escala 
de quilobases, se não estiverem inteiramente em um íntron, irão muito 
provavelmente remover ou duplicar um ou mais éxons inteiros. Quando 
o gene candidato já for conhecido, a técnica de escolha para detectar 
deleções ou duplicações de éxons inteiros é a amplificação de sonda 
dependente de ligação multiplex (MLPA).
Como ocorre no OLA, pares de oligonucleotídeos hibridizam em 
regiões adjacentes no DNA teste, e a DNA-ligase sela a fenda entre eles 
produzindo uma única molécula. No OLA a fenda é posicionada em um 
nucleotídeo variante suspeito, e a ligação ocorrerá apenas se houver um 
pareamento exato; no MLPA a fenda é posicionada em um nucleotídeo 
(espera-se) não variante no DNA teste, de maneira que a ligação será 
sempre feita se a sequência molde estiver presente. A ligação cria uma 
molécula amplificável por A presença de um produto de PCR indica a 
presença da sequência correspondente apropriada no DNA teste.
SAIBA MAIS:
Para entender a aplicação desses ensaios nas doenças 
acesse o artigo Diagnostico citogenético de pacientes com 
retardo mental idiopático, disponível em https://bit.ly/2kqFblz
RESUMINDO:
O sucesso da análise laboratorial das mutações depende 
de fatores como o tipo de amostra utilizada bem como da 
metodologia escolhida. Para isso, é necessário que a escolha 
do teste genético seja capaz de investigar os casos bem 
como identificar os genes sejam inteiros ou apenas parte dele. 
A obtenção das amostras se DNA ou RNA depende em qual 
tecido o gene em questão é expresso, e além disso, deve-
se prestar atenção na manipulação correta das amostras 
para evitar a degradação ou a contaminação das mesmas. 
A primeira parte da análise ocorre a partir da amplificação 
de sequências relevantes por meio de PCR ou RT-PCR.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 37
RESUMINDO:
Seu propósito é reduzir o volume de sequenciamento 
necessário para detectar uma mutação, estes métodos 
geralmente exploram diferenças nas propriedades de 
heterodúplices de DNA ou a conformação de DNA de 
fita simples sob condições não desnaturantes. O teste 
de proteína truncada pode ser utilizado com o fim de 
triar um gene para mutações que introduzem um códon 
de terminação prematuro, novas alterações de sentido 
trocado ou sinônimas identificadas durante a triagem de 
um gene candidato para mutações patogênicas oferecem 
grandes problemas de interpretação. Várias abordagens 
são utilizadas para tentar decidir se a alteração é patogênica 
ou não, mas se elas falham em fornecer uma resposta 
definitiva, a alteração deve ser listada como uma variante 
não classificada, eles geralmente envolvem a hibridização 
alelo-específica, a ligação de DNA alelo-específico ou a 
extensão de primer por meio do sítio em questão. Estes 
métodos são utilizados também para a genotipagem de 
polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Além dessas, 
técnicas especiais para identificar deleções ou outras 
alterações de número de cópia incluem a amplificação 
múltipla de sonda dependente de ligação (MPLA; utilizada 
para detectar a duplicação ou a deleção de um ou alguns 
éxons) e a hibridização genômica comparada (CGH; 
utilizada para detectar grandes alterações) e às vezes o 
rastreamento gênico é utilizado em estudos familiares 
para descobrir se alguém herdou um alelo patogênico, 
em casos nos quais é impraticável ou indesejável buscar 
diretamente a mutação. Assim, os genótipos de um número 
limitado de microssatélites altamente polimórficos podem 
ser utilizados para produzir um perfil de uma amostra 
de DNA e esse perfil de DNA pode ser empregado para 
determinar a zigosidade de gêmeos ou a paternidade de 
uma criança, ou em investigações criminais para identificar 
a fonte do DNA recuperado na cena de um crime.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial38
BIBLIOGRAFIA
ARRUDA, Jalsi Tacon et al. Proteína P53 e o câncer: controvérsias 
e esperanças. Estudos Goiânia, Goiânia, v. 35, n. 1, p. 123-141, 01 fev. 2008. 
SILVA, Bárbara V. et al. Proteínas quinases: características estruturais 
e inibidores químicos. Quim. Nova, Rio de Janeiro, v. 32, n. 1, p. 453-462, 
05 fev. 2009.
FARRELL, S.O.; CAMPBELL, M.K. Bioquímica. 5a ed. São Paulo, 
Thomson, 2007. CHAMPE, P.C.; HARVEY, R.A.; FERRIER, D.R. Bioqui ́mica 
Ilustrada. 4a ed. Rio Grande do Sul, Artmed, 2009.
SNUSTAD, D.P. Fundamentos de Genética. 4a ed. Rio de Janeiro, 
Guanabara Koogan, 2008.
GRIFFITHS, A.J.F. Introdução a Genética. 9 ed. Rio de Janeiro, 
Guanabara Koogan, 2009.
Turnpenny, Peter & Ellard, Sian (2009) Emery - Genética Médica. 
13a Edição. Elsevier Editora Ltda, Rio de Janeiro, RJ, 426 pp.
Dudek, Ronald W. & Wiley, John E. (2009) Genética Humana 
Básica. Editora Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, 177 pp.
Lewin, Benjamin (2009) GENES IX. 9a Edição. Artmed Editora S.A., 
Porto Alegre, RS, 893 pp.
Read, Andrew & Donnai, Dian (2008) Genética Clínica: uma nova 
abordagem. Artmed Editora S.A., Porto Alegre, RS, 425 pp.
Nussbaum, Robert L.; McInnes, Roderick R.; Willard, Huntington 
F. (2008) Thompson & Thompson – Genética Médica. Sétima Edição. 
Editora Guanabara Koogan S.A.,Rio de Janeiro, RJ, 525 pp. Disponível 
em; http://bit.ly/2P2DINR. Acesso em 28 de agosto de 2019.