citogenetica-no-diagnostico-laboratorial-2

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Aula 02
Rosalina Guedes Donato Santos
Citogenética 
no Diagnóstico 
Laboratorial
Diretor Executivo 
DAVID LIRA STEPHEN BARROS
Diretora Editorial 
ANDRÉA CÉSAR PEDROSA
Projeto Gráfico 
MANUELA CÉSAR ARRUDA
Autor 
EDUARDO NASCIMENTO DE ARRUDA
Desenvolvedor 
CAIO BENTO GOMES DOS SANTOS
Olá. Meu nome é Rosalina Guedes Donato Santos. Sou formada 
em Biomedicina, com uma experiência técnico-profissional na área 
de imunologia, hematologia, toxicologia, análises clínicas de mais 
de 12 anos. Passei por empresas com a Faculdade de Ciências e 
Tecnologia, UNIFACS, UNIRB, Laboratórios como o Hospital Roberto 
Santos, Laboratório José Silveira e Universidade Federal da Bahia. Sou 
apaixonado pelo que faço e adoro transmitir minha experiência de vida 
àqueles que estão iniciando em suas profissões. Por isso fui convidada 
pela Editora Telesapiens a integrar seu elenco de autores independentes. 
Estou muito feliz em poder ajudar você nesta fase de muito estudo e 
trabalho. Conte comigo!
Autora 
Rosalina Guedes Donato Santos
INTRODUÇÃO: para 
o início do desen-
volvimento de uma 
nova competência;
DEFINIÇÃO: houver 
necessidade de 
se apresentar um 
novo conceito;
NOTA: quando forem 
necessários obser-
vações ou comple-
mentações para o 
seu conhecimento;
IMPORTANTE: as 
observações escritas 
tiveram que ser prio-
rizadas para você;
EXPLICANDO ME-
LHOR: algo precisa 
ser melhor explica-
do ou detalhado;
VOCÊ SABIA? curio-
sidades e indaga-
ções lúdicas sobre o 
tema em estudo, se 
forem necessárias;
SAIBA MAIS: textos, 
referências biblio-
gráficas e links para 
aprofundamento do 
seu conhecimento;
REFLITA: se houver a 
necessidade de cha-
mar a atenção sobre 
algo a ser refletido 
ou discutido sobre;
ACESSE: se for 
preciso acessar um 
ou mais sites para 
fazer download, 
assistir vídeos, ler 
textos, ouvir podcast;
RESUMINDO: 
quando for preciso 
se fazer um resumo 
acumulativo das 
últimas abordagens;
ATIVIDADES: quando 
alguma atividade 
de autoaprendiza-
gem for aplicada;
TESTANDO: quando 
o desenvolvimento 
de uma compe-
tência for conclu-
ído e questões 
forem explicadas;
Iconográficos
Olá. Meu nome é Manuela César de Arruda. Sou a responsável pelo pro-
jeto gráfico de seu material. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de 
aprendizagem toda vez que:
SUMÁRIO
Técnicas de cultura de tecidos para análise citogenética 10
Biossegurança no laboratório de citogenética 10
Tipos de amostras utilizadas em culturas de tecidos 15
Recepção e identificação das amostras 17
Critérios de rejeição de amostra 20
Tipos de cultura de tecidos 21
Te ́cnicas de bandeamento e coloração cromossômica 24
Fluorocromos 28
Hibridizaçao in situ por fluorescência - FISH 28
Técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese 
celular 31
Diagnóstico citogenético nas doenças genéticas 33
Técnica de análise para o auxílio de leucemia mielóide 
crônica (LMC) 33
Técnica de análise para o auxílio de leucemia mielóide 
aguda (LMA) 35
Técnica de análise para o auxílio de síndrome 
mielodisplásica (SMD) 36
Técnica de análise para o auxílio de leucemia linfocítica 
aguda (LLA) 36
Técnica de análise para o auxílio de Linfomas 37
Técnica de análise para o auxílio de tumores sólidos 38
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 7
UNIDADE
02
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial8
Nas últimas décadas cresceram os interesses a cerca da biologia 
molecular por partes profissionais da saúde, principalmente pela 
possibilidade de um diagnóstico mais assertivo nas doenças genéticas. 
O avanço nas técnicas moleculares, sobretudo na possibilidade de avaliar 
o DNA advindos de materiais biológicos como tecidos, aminiocentese, 
biópsia de vilosidades coriônica aumentaram a chance de prever e 
diagnosticar as doenças genéticas. Além disso, ferramentas diagnósticas 
como a reação de cadeia em polimerase (PCR) despontaram como uma 
ajuda no diagnóstico laboratorial, porque essa técnica utiliza quantidade 
amostras mínimas, além de ser altamente sensível, específica e possui 
alta reprodutibilidade. Essas características foram fundamentais para os 
diagnósticos genéticos quanto aos aspectos éticos e legais, uma vez que 
o diagnóstico se tornou quase que irrefutável dada a precisão das técnicas 
moleculares. Dessa maneira os laboratórios conseguiram uma garantia na 
qualidade dos serviços possibilitando que o número de erros laboratoriais 
tendesse a zero e os laudos emitidos eram de fácil compreensão para os 
indivíduos envolvidos no processo. Entendeu? Ao longo desta unidade 
letiva você vai mergulhar neste universo!
INTRODUÇÃO
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 9
Olá. Seja muito bem-vindo à Unidade 2. Nosso objetivo é auxiliar 
você no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até 
o término desta etapa de estudos:
1. Descrever as técnicas de cultura de tecidos para análise 
citogenética;
2. Apontar as técnicas usadas no bandeamento e coloração 
cromossômica;
3. Analisar a técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese;
4. Correlacionar as técnicas com o diagnóstico das doenças 
genéticas.
Então? Preparado para uma viagem sem volta rumo ao conhecimento? 
Ao trabalho!
OBJETIVOS
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial10
Técnicas de cultura de tecidos para 
análise citogenética 
INTRODUÇÃO:
Ao término deste capítulo você será capaz de entender 
como ocorre à preparação dos tecidos para a análise, 
bem como quais amostras devem ser escolhidas para ter 
um melhor desempenho. Isto será fundamental para o 
exercício de sua profissão. As pessoas que tentaram realizar 
as técnicas da citogenética sem a devida base tiveram 
problemas na resolução e no diagnóstico laboratorial das 
doenças genéticas. E então? Motivado para desenvolver 
esta competência? Então vamos lá. Avante!
Biossegurança no laboratório de 
citogenética 
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2005) a biosse- 
gurança é um conjunto de ações voltadas para: prevenção, minimização 
e eliminação de riscos para a saúde, ajuda na proteção do meio ambiente 
contra resíduos e na conscientização do profissional da saúde. 
Os laboratórios clínicos lidam com situações, atividades e fatores 
de risco para os profissionais, os quais podem produzir alterações leves, 
moderadas ou graves. Além disso, há possibilidade de causar acidentes 
de trabalhos, bem como doenças aos profissionais expostos, sem a 
utilização de equipamentos de proteção individual (EPI), pois os líquidos 
biológicos e os sólidos manipulados no laboratório clínico, quase sempre 
são fonte de infecção. Assim, para evitar processo de contaminação 
cruzada dos materiais, deve ter critérios bem estabelecidos quanto à 
limpeza dos equipamentos, manuseios de microscópios, treinamento da 
equipe de limpeza e cuidado na geração de aerossóis. Esses cuidados 
alinhados com o descarte dos materiais fazem parte do conjunto de 
boas práticas do laboratório clínico.
Além desses cuidados pré-estabelecidos, outro ponto importante 
é a utilização de jalecos. É sabido que o jaleco protege a roupa bem 
como a pele do analista clínico da contaminação por sangue, respingos 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 11
de fluidos biológicos, derramamentos de materiais biológicos, que pode 
ocorrer desde a coleta de sangue, transporte, manipulação e descarte 
do material biológico. 
Os laboratórios de citogenética humana devem funcionar com 
espaços adequados e seguros para realização dos procedimentos 
inerentes à manipulação das amostras, manipulação de substâncias 
tóxicas, locais seguros para os equipamentos, locais para estocagem 
correta de reagentes, setores administrativos e manter um local seguro 
para armazenar as amostras e os laudos dos pacientes. 
Para evitar possíveis acidentes ou incidentes toda a equipe 
técnica deve ser treinada e a mesma deve ser habilitada para executar 
as funções laboratoriais. É de suma importância que o treinamento seja 
efetuado antes do início dasatividades, o que inclui a verificação de 
procedimentos em casos de acidentes ou de contaminação pessoal. O 
responsável técnico analista precisa garantir e assegurar que os manuais 
estejam disponíveis e acessíveis em locais de fácil acesso e que os 
mesmos sejam consultados de forma regular pela equipe técnica.
Uma vez que no laboratório de citogenética se lida com vários 
produtos tóxicos, químicos, cáusticos e potencialmente cancerígenos, 
os analistas clínicos precisam seguir a risca a utilização de luvas 
descartáveis, jalecos, máscaras e a utilização da capela de exaustão para 
a manipulação dos produtos químicos bem como do fluxo laminar para 
a manipulação de meios de cultura e de amostra biológica, para evitar 
contaminação entre o manipulador e a amostra. Além disso, é preciso ter 
um manual com as informações a respeito do manuseio, estocagem e 
descarte desses produtos. 
Assim é importante que o jaleco seja colocado no momento em 
que o profissional chega ao laboratório, e o mesmo deve permanecer 
com o jaleco durante todo o tempo, à exceção de cantinas, refeitórios, 
bancos, bibliotecas, auditórios, nessas áreas deve-se retirar o jaleco 
porque não áreas contaminadas e o jaleco pode levar agentes biológicos 
para esse local. O pano do jaleco deve ser resistente à penetração de 
líquidos, comprimento abaixo do joelho, mangas longas com o punho 
em elástico ou com botão, evitar jalecos muito justos ou bordados que 
deixem à sua pele descoberta expondo o profissional à riscos biológicos. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial12
Outro ponto importante é a utilização das luvas descarta ́veis para 
a manipulação de materiais potencialmente infectantes. As luvas são 
conhecidas como luvas de procedimentos, que são de látex (borracha 
natural) ou de material sinte ́tico (vinil), estas últimas, ale ́m de mais 
resistentes aos perfuro cortantes, são também indicadas a pessoas 
alérgicas às luvas de borracha natural. As luvas descartáveis devem 
ser usadas em todos os procedimentos, desde coleta, transporte, 
manipulação até o descarte das amostras biológicas, pois elas são uma 
barreira de proteção contra agentes infecciosos. É importante que as 
luvas sejam calçadas com cuidado para que não rasguem e que fique 
bem aderida a pele, evitando acidentes.
Caso o laboratório lide com materiais biológicos, reagentes e 
organismos geneticamente modificados precisam revisitar os manuais 
da Vigilância sanitária e a Comissão Nacional Técnica de Biossegurança 
(CNTBio) para a verificação dos procedimentos específicos de cada situação. 
Figura 1: Biossegurança no laboratório
Fonte: pixabay
Os equipamentos e instrumentos usados no laboratório têm de 
passar por uma rotina de limpeza, manutenção e calibração. Além disso, 
os manuais e/ou passo a passo devem estar disponíveis na bancada, ao 
lado do equipamento para sanar qualquer dúvida durante o processo. 
E quanto às amostras e reagentes, deve ser controlado a temperatura. 
É importante que as estufas sejam equipadas com alarmes e 
indiquem erros na temperatura e condições de CO2.
https://pixabay.com/pt/photos/cidade-trans-laborat%C3%B3rio-pipeta-3532804/
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 13
Quanto aos equipamentos precisa-se que os microscópios 
tenham uma resolução adequada para que as análises citogenéticas 
sejam feitas de maneiras seguras e corretas, as datas de manutenção 
e troca do filtro do fluxo laminar precisam ser registradas e seguidas, e 
o tempo de uso lâmpadas UV também precisam ser registradas, pois 
possuem vida útil limitada.
As cabines de segurança biológica servem para diminuir os 
riscos com os aerossóis, por isso, protege tanto o manipulador quanto à 
amostra. Existem três tipos de cabines de segurança biológica: 
1. Classe I, o ar que sai passa através de um filtro chamado HEPA 
(Hight Efficiency Particulate Air- alta eficiência para partículas de ar) e o 
mesmo é eliminado no ambiente livre de partículas contaminadas, esse 
tipo de cabine protege o manipulador e o ambiente, porém, não evita a 
contaminação do material que está sendo manipulado;
2. Classe II o ar é filtrado por meio dos filtros HEPA, antes de 
entrar e antes de sair da cabine, dessa forma consegue proteger o 
manipulador, o ambiente e o material, nesses dois tipos de cabines há 
abertura frontal;
3. Classe III o ar é estéril, e nesse caso a cabine é completamente 
fechada, o que impede a troca de ar com o ambiente e funciona com 
pressão negativa, dessa forma oferece total segurança ao manipulador, 
ambiente e material e, os materiais a serem manipulados entram e saem 
por meio de câmeras de desinfecção. 
A cabine de segurança II é um EPC importante nos laboratórios 
de saúde pública, unidades hemoterápicas e de citogenética. É crucial 
que a cabine esteja funcionando no mínimo 30 minutos antes do início 
do trabalho e após o término do trabalho ligar por mais 30 minutos para 
o processo de limpeza, descontaminação e desinfecção principalmente 
nas paredes laterais e internas da superfície de trabalho.
Para minimizar os riscos de contaminação preconiza-se que os 
materiais de culturas de células sejam adicionados em locais diferentes 
de culturas de bactérias e/ou vírus.
E por fim deve-se reservar uma área protegida da luz, para a 
realização de técnicas moleculares (FISH, CGH etc). 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial14
Figura 2: Tipos de cabines biológicas
Fonte: pixabay
Ademais, deve-se incluir no manual de boas práticas laboratoriais 
cuidados pessoais, a saber, o vestuário deve ser composto por calças 
compridas sem rasgos, sapatos fechados e nesse caso não pode a utilização 
de sapatilhas, o material do calçado não pode ser poroso e resistente para 
impedir lesões no caso de acidente com perfuro cortante ou substância 
química, cabelos compridos devem permanecer presos ou com gorros 
para evitar contato com o material manipulado, evitar o uso de lentes de 
contato no ambiente laboratorial, pois, podem fixar agentes infecciosos 
na mucosa ocular, as unhas devem ser curtas e as mesmas não devem 
ultrapassar as pontas dos dedos, deve-se evitar a utilização de maquiagem, 
pois, as mesmas facilitam a aderência de agentes infecciosos na pele, o uso 
de jóias e bijuterias deve ser evitado, em especial aquelas que possuem 
espaços vazios, pois podem ser depósitos de agentes infecciosos. 
Além disso, o analista clínico deve estar com a carteira de vacinação 
em dia, haja vista que o risco é duas vezes maior de adquirir qualquer 
doença em relação à população. As vacinas recomendadas são hepatites 
A e B, tétano, difteria, (dupla tipo adulto), tétano, difteria e coqueluche 
(tríplice bacteriana adulta), varicela (catapora), influenza (gripe), meningite 
C, sarampo, caxumba e rubéola. 
https://pixabay.com/pt/photos/hospital-dentro-de-casa-medicina-3089884/
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 15
Outros cuidados importantes que se deve ter no laboratório são 
relacionados à comida e bebida, nesse sentido deve-se evitar comer, beber, 
utilizar geladeiras, freezers para guardar sucos e ou refrigerantes, estufas 
de secagem para esquentar o alimento ou estantes para acondicionar 
alimentos. Devem-se evitar brincadeiras, distrações com fones de ouvido 
ou a utilização de celulares bem como conversas paralelas durante os 
procedimentos laboratoriais, pois essas desatenções podem causar 
acidentes graves, e deve ser lembrado que a responsabilidade do resultado 
é do profissional analista clínico, e caso o mesmo libere um resultado errado 
o mesmo sofrerá sanções na justiça bem como do Conselho.
Tipos de amostras utilizadas em culturas 
de tecidos 
Segundo a RDC N° 55, DE 11 DE DEZEMBRO DE 2015 são consi-
deradas amostras biológicas sangue, fragmentos de tecidos, esfregaços, 
lavados, entre outros, provenientes de doadores, receptores ou de 
tecidos retirados.
Para que haja a escolha do tecido depende do paciente, por 
exemplo,pré ou pós-natal, qual o motivo do diagnóstico, se é de origem 
constitucional ou adquirido e por fim, qual a indicação clínica do exame. 
Caso o diagnóstico seja pré-natal os tecidos mais utilizados são as 
células do líquido amniótico (LA), vilosidades coriônicas e os linfócitos de 
sangue total, de preferência as amostras devem ser nessa ordem conforme 
figura 03. Ademais, outros fatores são importantes na escolha do tecido 
como idade gestacional, bem como se o diagnóstico é de importância 
primária ou secundária e se haverá necessidade de realização de outros 
testes genéticos moleculares e genéticos. Além desses tecidos podem 
ser usados tecidos fetais como placenta, pele, pulmão, líquido ascítico 
ou renal, também podem ser utilizados para a avaliação citogenética em 
casos de indicação terapêutica ou término da gestação. 
Os componentes do líquido amniótico estão em suspensão e 
dissolução. Os elementos em suspensão são as células esfoliadas no 
âmnio, principalmente do feto, lanugem e gotículas de gordura. E os 
elementos de dissolução são as substâncias orgânicas e inorgânicas, os 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial16
inorgânicos são representados por pelos eletrólitos e os orgânicos são 
as proteínas, aminoácidos, alfa-fetoproteína, substâncias nitrogenadas 
não protéicas, lipídeos, carboidratos, vitaminas e enzimas. A análise do 
líquido é preconiza danos casos de doenças congênitas, defeitos no tubo 
neuronal, idade gestacional e maturidade fetal pulonar, principalmente 
em mulheres acima de 35 anos devido à probabilidade de anormalidades 
cromossômicas fetais. 
Em caso de pacientes neonatos ou adultos, deve ser utilizado para 
o diagnóstico cromossômico constitucional o sangue periférico. Sabe-
se que a heparina e o heme inibem a reação de cadeia em polimerase 
(PCR), por isso o anticoagulante recomendado para a obtenção da 
amostra é o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético). No caso de análises 
moleculares e avaliação do RNA intracelular é recomendado que a coleta 
seja feita em um aditivo para estabilização de RNA ou colocado em um 
aditivo para a estabilização do RNA, além disso, deve ser respeitada 
a recomendação do fabricante quanto ao volume de amostra e a 
quantidade de sangue. A estabilidade do sangue total pode ocorrer na 
temperatura ambiente por 24 horas para análise de DNA e até oito dias, 
quando resfriado (2-8oC). Para ana ́lise de RNA celular, o sangue deve ser 
coletado com aditivo estabilizador, pois o RNA se degrada de maneira 
rápida. A coleta e armazenamento de sangue total sem estabilizador não 
são recomendados para análise de transcrição genética, em função da 
indução e da degradação de RNA que ocorre ex vivo.
Para as alterações referentes às anormalidades cromossômicas 
adquiridas, é utilizada a medula óssea, ou em casos de tumores sólidos 
biópsia do próprio tumor. Devem-se ter alguns cuidados para a obtenção 
da medula óssea, a saber, a coleta deve ser feita com uma seringa já 
contendo EDTA e a equipe do laboratório deve estar a postos para 
processar o material assim que a coleta chegue ao laboratório. Importante 
seguir os critérios para a extração de DNA, no qual o aspirado de medula 
óssea só pode ser armazenado por até 72 horas de 2-8oC antes do 
processamento. Caso seja necessa ́rio armazenar por tempo superior a 
esse, devem-se remover os eritro ́citos e congelar a amostra a -20oC (por 
meses), nesse processamento deve-se evitar a hemólise do material, pois 
a liberação do heme inibe a reação de cadeia em polimerase (PCR). 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 17
No caso da extração do RNA, o aspirado de medula óssea deve 
ser coletado em seringa contendo EDTA, e após a coleta adicionar o 
mais rápido possível a solução estabilizadora do RNA, quando não for 
possível a amostra deve ser transportada com gelo triturado e a extração 
deve ocorrer até no máximo 04 horas após a coleta, e é importante que a 
amostra não deve ser coletada antes da retirada dos eritrócitos. 
Entretanto, nem sempre é possível a utilização de amostras de 
sangue, nesses casos devem ser usadas amostras advindas de um tecido. 
Geralmente, 1 a 2g de tecidos devem ser obtidos para que se tenha uma 
boa quantidade de células. Tecidos não gordurosos acima de 10mg 
fornecem uma cerca de 10 ug de DNA ou RNA, entretanto para cada 
protocolo estabelecido no laboratório verifique a quantidade de material 
desejado para a realização da técnica. A estabilidade depende do tipo de 
tecido, entretanto o acondicionamento não pode ser feito à temperatura 
ambiente, o ideal é congelar o tecido em nitrogênio líquido ou em solução 
de preservação de ácidos nucléicos ou quando não for possível esse tipo 
de acondicionamento colocar a amostra de tecido em banho de gelo e 
transportar. Em amostras pequenas, devem-se embrulhar as mesmas 
embebidas em salina, a fim de evitar o ressecamento da amostra e 
adicionar a solução de preservação dos ácidos nucléicos. 
A maioria dos tecidos usados para o diagnóstico citogenético não 
possui um número significativo de mitoses espontâneas, daí a necessidade 
de realização de culturas para a preparação dos cromossomos. Por isso, 
as técnicas de tecidos têm se tornado um suporte importante na pesquisa 
cromossômica. 
Recepção e identificação das amostras
As etapas dentro de um laboratório clínico correspondem à fase 
pré-analítica, analítica e pós-analítica. O laboratório tem por obrigação 
liberar resultados confiáveis para auxiliar no diagnóstico e tratamento das 
doenças. Os erros inerentes às fases pré e pós analíticas compreendem 
cerca de 93%. 
A fase pré-analítica corresponde a todos os processos referentes 
à a qualidade da mostra antes do processamento laboratorial, a saber, 
requisição de exames inapropriados, coleta de amostra inadequada, mal 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial18
acondicionamento da amostra, letra ilegível na requisição, entre outros. 
Embora esses pontos não estejam dentro da competência do laboratório, 
os mesmos precisam estabelecer critérios de recebimento e rejeição das 
amostras, pois a credibilidade do profissional e do laboratório dependem 
disso. Além dessas informações, é de fundamental importância a análise 
e liberação do laudo. 
Assim, é de fundamental importância que o laboratório monitore o 
transporte de amostra seguindo os procedimentos operacionais padrão 
(POP) quanto ao período de tempo de acondicionamento para o exame 
solicitado, utilização dos conservantes necessários para cada amostra 
biológica coletada e assegurar critérios regulatórios de registro para o 
recebimento das amostras quer sejam nacionais, regionais ou locais. Caso 
haja o recebimento de amostras comprometidas, um relatório final deve 
descrever de forma minuciosa a natureza do problema, e se aplicável o 
cuidado requerido quando á liberação e interpretação do resultado. 
Segundo a Agência de Vigilância em Saúde (2005), a amostra do 
paciente deve ser transportada e preservada em recipiente isotérmico, e 
quando requerido, higienizável, impermeável, garantindo a estabilidade da 
amostra desde a coleta até a fase de processamento do exame. A maleta 
deve conter o símbolo de risco Biológico, com os dizeres Espécimes 
Diagnósticas e com o nome do laboratório responsável pelo envio.
A identificação da amostra primária é iniciada a partir da identifi-
cação do paciente hospitalar ou ambulatorial. A partir desse momento, 
deve-se criar um vínculo entre o paciente, amostra coletada, profissional 
que realizou a coleta do procedimento, para que haja a rastreabilidade 
do processo. 
Além desses fatores, deve-se levar em consideração o posicio-
namento da amostra primária, uma vez que o posicionamento inade-
quado pode derramar a amostra ou formar coágulos, evitar a exposição 
à luz e a altas temperaturas, evitar excessiva agitação já que pode causar 
hemólise, especialmente em amostras de sangue. 
As solicitações dosformulários e ou requisições não devem ser 
colocadas em torno dos tubos, pois podem danificar, antes devem ser 
colocadas em separado, e de preferência dentro de envelopes impermeáveis. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 19
No caso de substâncias líquidas, o recipiente primário e secundário 
deve ser a prova de vazamento. Além disso, deve ser colocado um material 
absorvente entre o recipiente primário e secundário para não comprometer 
o material. O recipiente primário ou embalagem secundária deve ser capaz 
de suportar, sem vazamento, uma pressão interna de 95kPa. 
Figura 3: Tipo de acondicionamento com recipiente primário e secundário
Fonte: http://bit.ly/2TckKrI
Contudo hoje já podem ser encontrados no mercado dispositivos 
capazes de registrar a temperatura e o tempo em intervalos pré 
determinados, a exemplo do TempStick®, outros que validam apenas 
o transporte como o Mission Starter e o System Manager que avalia 
as condições de transporte, sendo permitida a visualização da leitura 
e da validação dos dados registrados pelo TempStick® durante um 
determinado transporte.
As amostras encaminhadas para o laboratório de citogenética 
precisam ser registradas e devem receber um código de identificação 
único que as acompanhará por todas as etapas do processo de análise, 
esse código é de fundamental importância porque torna a amostra 
rastreável em qualquer etapa do processo o que facilita na hora de 
tomadas de decisões ou tirar quaisquer dúvidas que surjam no processo 
do exame. Os códigos gerados devem distinguir indivíduos da mesma 
família ou diferentes amostras coletadas do mesmo indivíduo. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial20
Todas as amostras devem vir acompanhadas de um formulário 
de requisição de exame com os dados preenchidos a cerca de nome do 
paciente, código de registro do laboratório, data de nascimento, idade, 
sexo do paciente, data e hora da colheita do material, tipo de amostra 
(a exemplo de sangue periférico, medula óssea, líquido amniótico, etc.), 
profissional que solicitou a realização do exame, indicação do exame, 
informações clínicas quanto à realização do exame, história familiar 
(quando necessário) e profissional que realizou a coleta do material. 
Critérios de rejeição de amostra
Os critérios de aceita/rejeição de amostras devem ser 
estabelecidos pelo laboratório. As amostras têm de ser rejeitadas quando 
não atenderem as normas estabelecidas pelo laboratório, incluindo 
aqueles relacionados com as condições ideias de armazenamento da 
amostra, temperatura, acondicionamento e transporte. 
Pode-se citar como exemplo de critérios de rejeição dados 
de identificação incorretos ou incompletos dos pacientes, e volume 
insuficiente de amostra. Nesses casos, o laboratório deve entrar em 
contato com o serviço ou com o médico responsável para comunicar 
a inadequação da amostra coletada e enviada e discutir a possibilidade 
de uma recoleta, bem como informar as chances de sucesso envolvidas 
no procedimento. 
Além desses fatores, devem ser observados a relação anticoa-
gulante sangue, armazenamento da amostra, mostra hemolisada, 
coagulada, tubos quebrados ou com vazamentos, caso as amostras 
recebidas estejam parcialmente hemolisadas ou parcialmente coagula-
das serão processadas com caráter restritivo para a interpretação 
laboratorial, nesse caso deve ser informado por e-mail ou telefone para 
o paciente sobre a possibilidade de recoleta. 
O ideal é que amostras de sangue total sejam enviadas no 
tubo primário e não alíquotas para a realização dos exames. O ideal é 
que amostra não seja manipulada fora do ambiente estéril. Amostras 
enviadas com seringas para o laboratório de citogenética, a exemplo do 
líquido amniótico e vilocorial, devem estar acondicionadas em seringas 
sem o bico (borracha preta) e com êmbolo e agulha imobilizados. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 21
As amostras em espera para cadastro são aquelas em que há 
ausência de dados como nome do laboratório ou médico solicitante, 
nome do paciente, cadastro incompleto do nome completo do exame 
solicitado, informações sobre a data da coleta do material, descrição do 
material enviado (sangue total, líquido amniótico, tecido, entre outros tipos 
de amostras), envio de exames sem o preenchimento do formulário correto 
bem como sem a assinatura do termo de consentimento. E caso tenha um 
exame para a pesquisa de mutação pontual, a mutação encontrada no 
caso – índice (primeira pessoa a ser investigada) deve ser especificada no 
relatório médico ou no pedido e quando possível enviar uma cópia. 
SAIBA MAIS:
Para entender a cerca dos critérios usados para a coleta, 
transporte e armazenamento de amostra em biologia 
molecular leia o artigo: Coleta, transporte e armazenamento 
de amostras para diagnóstico molecular, disponível em: 
https://bit.ly/2ls9XLd
Tipos de cultura de tecidos
O sangue é o tecido mais utilizado nas culturas dado a facilidade 
de obtenção, bem como facilidade no cultivo. A coleta deve ser feita 
com uma seringa estéril, com heparina e em casos de adultos coletar 
um volume aproximado de 10 mL e em crianças em torno de 5mL , sendo 
menor ainda para neonatos ou cordão umbilical com volume de 1 a 2 mL. 
O sangue do cordão umbilical deve ser coletado por um médico 
obstetra depois da vigésima semana de gestação, com o auxílio do 
ultrassom. A indicação para essa coleta pode ser a ausência de líquido 
amniótico (material mais apropriado para detecção de anormalidades 
cromossômicas), devido a alguma malformação fetal detectado mais 
tardiamente na gestação ou suspeita de cromossomopatia, ou mesmo 
para confirmação de um cariótipo duvidoso em líquido amniótico. 
Importante ressaltar que para o lanc ̧amento na cultura, pingam-
se de 8 a 10 gotas de sangue total em 5 mL de meio de cultura (dentro 
da capela de fluxo laminar devidamente asséptica), deixado a 37°C na 
estufa, em cultura fechada ou aberta, por 72 horas. O meio de cultura 
https://bit.ly/2ls9XLd
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial22
mais usado é o RPMI para manter as células viáveis no meio de cultivo. 
Após são feitas as lâminas e a análise microscópica dos cromossomos.
A medula óssea também pode ser usada, porém a cultura 
usando esse material dura apenas 24 horas. Devido a alta taxa de 
proliferação celular as desvantagens dessa técnica são baixo índice 
mitótico, morfologia de baixa qualidade dos cromossomos, uma vez 
que se apresentam mais condensados e curtos, o que dificulta a análise. 
Entretanto, na tentativa de melhorar a análise do material os laboratórios 
usam mais de um protocolo para terem sucesso no exame. No primeiro 
protocolo é feita a cultura e adicionada a colchicina, uma substância 
que inibe a polimerização das proteínas do fuso mitótico e para a 
divisão celular na metáfase, após realizar o protocolo de coloração 
(bandeamento GTG). 
O segundo protocolo estabelecido é a utilização do meio de cultura 
específico para a medula óssea (Marrow Max – GIBCO), após suspender 
as células do sobrenadante e incubar de 24 a 48 horas e acrescentar 0.1 
mL de colchicina de 40 a 50 minutos. Centrifugar o material a 800 rpm por 
8 minutos, retirar o sobrenadante, seguido de hipotonia com Kcl , fixação 
do material e coloração com bandeamento GTC.
O líquido amniótico é usado após a retirada por meio da 
aminiocentese, as ce ́lulas fetais estão flutuando neste líquido, e por 
isso podem ser realizadas análises bioquímicas, moleculares ou 
cromossômicas. Importante ressaltar que após a coleta o material deve 
ser transportando para o laboratório na própria seringa em temperatura 
ambiente. Ao chegar no laboratório o líquido deve ser transferido para 
dois tubos cônicos e centrifugados a 1500 rpm por 08 minutos. Após 
o sobrenadante é retirado e guardados no freezer para uma análise 
posterior. Ao pellet dos tubos são adicionados 4 mL de meios de cultivo, 
Amniomax, transferidosem frasco de cultura e incubados na estufa de 
CO2. O restante do procedimento, ou seja, hipotonia, fixação, preparação 
de lâminas e coloração, e ́ semelhante ao do sangue.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 23
Figura 4: Aminiocentese: coleta do líquido amniótico
Fonte: http://bit.ly/2TdCmDh
A biópsia de vilosidades coriônicas deve ser coletada com meio 
de cultura (RPMI 1.640, ou HAM F-10, ou Amniomax) já inserido na própria 
agulha, essa coleta é feita por meio de um médico. A lavagem das 
vilosidades é feita com qualquer meio de cultura ou cloreto de sódio. 
O cultivo deve ser feito apenas do material fetal. As vilosidades são 
formações esbranquiçadas e ramificadas que ficam ao redor da placenta, 
e se assemelham a árvores brancas. A dissecação das vilosidades deve 
ser realizada sob microscópio invertido, de preferência dentro da capela 
de fluxo laminar e de maneira estéril. 
Após a separação e limpeza, as vilosidades devem passar 
por dois procedimentos, o direto que consiste na separação de 3 ou 
4 vilocoriônicos, transferência para uma placa de petri com 3 mL de 
meio de cultivo ( Amniomax). Após adicionar 0,1mL de colchicina numa 
concentração de 10 ug/mL, colocar por 02 a 03 horas na estufa de CO2. 
Após devem ser feitas a preparação, coloração e análise das lâminas. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial24
RESUMINDO:
E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu 
mesmo tudinho? Agora, só para termos certeza de que 
você realmente entendeu o tema de estudo desses 
capítulos, vamos resumir tudo o que vimos. Você deve 
ter aprendido que a biossegurança é de fundamental 
importância para a manipulação das amostras, bem como 
para a segurança do analista para evitar contaminação. 
Além disso, foi visto que as amostras usadas nas técnicas 
de citogenética compreendem desde sangue até tecidos 
ou líquido amniótico, entre outras. No entanto, o mais 
importante na escolha desses materiais é a identificação 
do motivo do exame, pois, cada amostra biológica tem 
uma especificidade e sensibilidade diferente. Ademais, é 
mandatório que cada laboratório estabeleça os protocolos 
de recepção e de rejeição de amostra, uma vez que o 
sucesso do diagnóstico depende desses fatores. E, um 
dos pontos mais relevantes é a utilização de meios de 
cultivo para manter a viabilidade das células, uma vez que 
o estudo do cromossomo é baseado na integridade celular 
após a cultura de célula.
Técnicas de bandeamento e coloração 
cromossômica
Até meados dos aos 70, a coloração usada para a verificação 
dos cromossomos eram Giemsa e a orceína, ambas tinham afinidade 
por cromatina e coravam de forma uniforme. No entanto, com esse tipo 
de coloração, eram caracterizadas apenas as aneuplodias, e as outras 
alterações cromossômicas eram difíceis de identificar. A fim de melhorar 
o diagnóstico, foram implementadas no laboratório várias técnicas de 
bandeamento e coloração. Essas técnicas foram divididas em duas 
classes, a primeira está relacionada com as bandas ou faixas ao longo 
de toda a extensão do cromossomo (bandas Q, G e R) e a outra se refere 
a marcação de regiões específicas de alguns cromossomos (bandas C, 
RON,T,G-11, Cd coradas com DAPI/DA). 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 25
Corantes como orceína e giemsa são usados porque ambos 
têm afinidade pelo DNA, fluorescem sob a luz ultravioleta, e após o 
tratamento é possível verificar zonas brilhantes e escuras ou bandas que 
são específicas para o tamanho e localização do cromossomo, e dessa 
maneira era possível identificar as aneuplodias (alterações numéricas). 
Estas técnicas permitem a identificação exata de cada elemento do par 
cromossômico, além da detecção das aberrações estruturais, o que 
possibilita a análise de todo o cariótipo humano.
O primeiro método de marcação foi o bandeamento Q, que 
consiste na utilização de fluorocromos. Essa técnica é usada para estudar 
os polimorfismos, bem como detectar a presença de material genético 
no cromossomo Y. Entretanto, as desvantagens desse método de 
bandeamento é o decaimento da fluorescência, o que diminui a eficácia 
da análise, por isso é recomendado realizar a preparação e análise das 
lâminas no ambiente escuro e com a utilização de fluorescência. 
O bandeamento G ou bandeamento de Giemsa é uma técnica usada 
em citogenética para produzir um cariótipo visível por meio da coloração de 
cromossomos condensados. Essa técnica é útil na identificação de doenças 
genéticas através da representação fotográfica de todo o complemento 
do cromossomo. As vantagens desse ensaio são o custo baixo, além da 
durabilidade das bandas coradas nas lâminas preparadas.
Figura 5: Bandeamento G
Fonte: http://bit.ly/37XNIzH
No bandeamento R, as bandas reversas têm um padrão de 
marcação cromossômica oposto ao produzido pelas bandas Q e G, ou 
seja, as bandas fluorescentes e escuras possuem maior afinidade por 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial26
regiões ricas em bases CG, e as bandas opacas e claras têm afinidade 
pelas bases AT. A preparação da lâmina se dá por meio de altas 
temperaturas e com a utilização de tampões, seguidos pela coloração 
de acridina laranja. 
DEFINIÇÃO:
O bandeamento C é uma técnica responsável por corar 
de maneira específica a heterocromatina constitutiva (HC), 
localizada ao redor dos centrômeros.
No cariótipo humano, além disso, marca regiões polimórficas 
pericentroméricas dos cromossomos 1, 9 e 16 e a porção distal do 
braço longo do cromossomo Y. Essa técnica é usada para detectar a 
presença de cromossomos dicêntricos (cromossomos que possuem 
dois centrômeros) ou pseudodicêntricos, e ainda podem servir como 
marcadores na identifcação de linhagem ou doador em caso de 
transplante de medula, neoplasias e variantes pleomórficas. 
O bandeamento C permite a observação da heterocromatina 
constitutiva, para isso são necessárias 04 etapas: preparação e 
envelhecimento das lâminas, hidrólise, lavagem, desnaturação, hidrólise, 
lavagem, renaturação e avaliação do DNA. O envelhecimento deve ser 
feito a partir da digestão enzimática por 02 dias à temperatura ambiente. 
A hidrólise deve ser feita mergulhando as lâminas em um recipiente de 
ácido acético a 45% em banho-maria, pré-aquecido por 10 minutos. 
Após isso, deve colocar o ácido acético em outro recipiente para 
posterior uso, e após as lâminas devem ser lavadas em água de torneira 
corrente durante 01 minuto e após as mesmas devem ser secadas com o 
auxílio de uma bomba de ar, a desnaturação deve ser feita mergulhando 
as lâminas numa solução saturada de hidróxido de bário à temperatura 
ambiente por 10 minutos. Após lave com a água da torneira até retirar 
o excesso dos cristais do hidróxido de bário e adicione a solução de 
ácido acético 45%, depois seque as lâminas, transfira para um jarro de 
Coplin e adicione uma solução de 2X de SSC (cloreto de sódio isotônico) 
pré-aquecido a 60oC. Imediatamente em seguida, coloque o jarro em 
banho-maria durante 80 minutos.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 27
A técnica de bandeamento RON cora as regiões organizadoras de 
nucléolos (RON), as quais estão localizadas na constricção secundária 
dos cromossomos humanos com satélites (Grupos D e G). Essa técnica 
pode ser usada na identificação dos dromossomos marcados e na 
detecção dos rearranjos ou polimorfismos envolvendo cromossomos 
acrocêntricos. Uma aplicação clínica seria na identificação de trissomias. 
A coloração de RON deve ser feita usando os seguintes passos: 
preparação da lâmina, colocar as lâminas na estufa durante 03 horas 
na temperatura de 40oC, após adicionar nas lâminas a solução de SSC 
aquecida a 60oc durante 10 minutos. Lavar com água destilada e após 
fazer uma câmera úmida e colocar na estufa entre 70 e 80oC, adicionar 
uma gota da solução de nitrato de prata sobre a lâmina, cobrir com 
lamínula e levar até a câmera úmida previamente aquecida. Espere por 
02 minutos e leve aomicroscópio para verificar se o material foi corado, 
lave e retire a lamínula. Seque a lâmina e para montar adicione bálsamo 
do Canadá e analise os RONS dos cinetócoros e centríolos adjuntos.
O bandeamento T avalia as bandas T (telomerebanding), repre-
sentam um subconjunto das bandas R e marcam somente as porções 
cromossômicas terminais ou dos telômero. 
REFLITA:
É importante refletir sobre a utilização das técnicas de 
bandeamento para análise dos cromossomos. Para um 
correto diagnóstico, sempre avalie a causa da solicitação 
médica, quais cromossomos poderiam estar envolvidos no 
processo, pois dessa maneira escolherá a melhor técnica, 
bem como o melhor marcador para o teste.
Diversos cromossomos são constituídos ou organizados de 
maneiras diferentes, por isso podem ser corados de maneira diferencial. 
Os segmentos diferenciais geralmente estão restritos a uma determinada 
região do cromossomo, formando o que chamamos de bandas. A 
presença dessas bandas permite caracterizar o cromossomo, bem 
como identificar regiões homólogas. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial28
Fluorocromos
Os fluorocromos são corantes fluorescentes, que emitem luz após 
excitação luminosa. Na citogenética são usados por apresentarem afinidade 
pelos pares de bases AT ou GC, produzindo um padrão fluorescente 
característico. Para melhorar a coloração podem ser usados dois corantes, 
por isso chamamos de dupla marcação. Nesses procedimentos, a 
fluorescência emitida pelo fluorocromo examina os cromossomos, e esse 
corante é chamado de primário, enquanto que o outro corante usado se liga 
ao DNA. Esse segundo corante pode ser fluorescente ou não. Os principais 
fluorocromos utilizados nestas técnicas de coloração são: 
1. DAPI – 4, 6-Diamino-2-Phenole-Indole (afinidade por bases AT);
2. Hoechst 33258 – 2-[4-hidrox yphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2, 
5 bi-1 H-benzimidazole (bases AT); 
3. Quinacrina (bases GC); 
4. CMA3 – Cromomicina A3 (ba- ses GC); 
5. Olivomicina (bases GC), entre outros.
As combinações de corante prima ́rio e contra-corante são 
baseadas em suas afinidades pelas bases de DNA:
 � corante prima ́rio especi ́fico – AT e contra‐corante tambe ́m 
específico – AT;
 � corante primário específico – AT e contra‐corante específico – GC;
 � corante primário específico – GC e contra‐corante específico – AT.
ACESSE:
Para entender melhor a cerca das colorações usadas na 
citogenética leia texto Como observar cromossomo: Um 
guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana, 
disponível em: https://bit.ly/2lr84hH
Hibridizaçao in situ por fluorescência - FISH
A técnica de FISH (hibridização in situ por fluorescência) se baseia 
na ligação das sequência de DNA marcadas com fluorocromos (sondas) 
aos genes ou cromossomos alvo complementares.
https://bit.ly/2lr84hH
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 29
A sonda é uma sequência de oligonucleotídeos complementares 
e específicos. A marcação com as sondas pode ser direta ou indireta. 
Na marcação direta, um ou mais fluorocromos são ligados às sondas 
que se ligarão nas regiões 5’ ou 3’ da molécula alvo. A marcação indireta 
ocorre quando se liga a molécula de digoxigenina à sonda e só após 
há a ligação do anticorpo conjugado com o fluorocromo, nesse tipo de 
teste há o aumento da sensibilidade da técnica.
A técnica de hibridização in situ (FISH) é um método histoquímico 
que auxilia na visualização, identificação, enumeração e localização dos 
agentes patogênicos in situ, sem a necessidade de culturas celulares. 
Além disso, essa técnica permite a avaliação de ácidos nucléicos e dessa 
forma pode-se avaliar a genética e correlacionar com alterações celulares. 
As etapas da técnica compreendem quatro procedimentos, são 
eles fixação e permeabilização da amostra, hibridização, lavagem para a 
retirada das sondas em excesso e avaliação do material por meio de um 
microscópio fluorescente. 
Figura 6: Etapas do FISH
Fonte: http://bit.ly/309F9Pw
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial30
A marcação cromossomo-específica é visualizada por meio dos 
pontos fluorescentes de uma ou várias cores diferentes, a depender 
da quantidade de fluorocromos usados no processo. As sondas mais 
usadas na técnica de FISH são oligonucleotídeos entre 15 e 30 bases 
com única molécula fluorescente ligada covalentemente ao 5’ terminal. 
Os fluorocromos mais usados na rotina são fluoresceína (FITC), derivados 
de rodamina e os fluocromos de cianina Cy3 e Cy5. 
Apesar dessa técnica ser de alta sensibilidade e especificidade, 
podem ocorrer resultados falsos positivos quando as substâncias 
analisadas emitirem autofluorescência, a exemplo de tecidos que 
contenham alta quantidade de elastina e colágeno, bem como eritrócitos 
e eosinófilos. Resultados falsos-negativos podem ocorrer quando houver 
penetração insuficiente da sonda no interior do material analisado. 
A nomenclatura para a técnica de FISH deve indicar a sonda 
utilizada, o cromossomo e a banda correspondentes a ela, bem como o 
número de cópias de marcações observadas com a sonda. Se for realizada 
também a citogenética convencional, o resultado deve ser colocado em 
primeiro lugar, seguido por um ponto (.), e a nomenclatura resultante da 
FISH deve ser indicada pela abreviatura ish, um espaço e o resultado da 
hibridização. Por exemplo, cariótipo 46, XX.ish 22q11.2 ( D22S75 X 2), esse 
resultado indica carótipo normal feminino e, por FISH, foi utilizado a sonda 
D22S75 (a região 22q11.1 é responsável pela sídrome de DiGeorge), e nesse 
teste a mesma apresentou padrões de normalidade. 
SAIBA MAIS:
Estude sobre as doenças genéticas e como o laboratório 
de citogenética pode auxiliar no diagnóstico, leia o artigo: 
Genética médica para não especialistas: O reconhecimento 
de sinais e sintomas, disponível em: https://bit.ly/2ko1qIV
https://bit.ly/2ko1qIV
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 31
Técnica de micronúcleos com bloqueio da 
citocinese celular
A avaliação da frequência de micronúcleos (MNs) é um 
ensaio usado na determinação da presença e da extensão do dano 
cromossômico em populações expostas a agentes genotóxicos, exemplo 
organofosforados, pesticidas, ou ainda avalia susceptibilidade genética. 
Além disso, esse teste também pode ser usado na identificação de dietas 
e fatores genéticos. Assim, esse teste é capaz de detectar os agentes 
genotóxicosclastogênicos( promotores de quebras cromossômicas) e os 
interferentes da formação do fuso mitótico. 
O ensaio de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CB-MN) pode 
ser usado para avaliar os efeitos genotóxicos e citotóxicos de espécies 
reativas de oxigênio, tais como peróxido de hidrogênio, superóxido, 
neutrófilos ativados e/ou radiação ionizante.
A técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese (CBMN) 
avalia os micronúcleos em culturas humanas. Além do sangue, também 
podem ser usadas células epiteliais esfoliadas, células mononucleares do 
sangue periférico e eritrócitos. A escolha da amostra biológica deve ser feita 
a partir dos estudos a cerca do mecanismo de ação do agente estudado. 
Os micronúcleos são produzidos durante o processo de divisão 
celular, na etapa da telófase, quando o envelope nuclear é reconstituído 
ao redor dos cromossomos das células filhas. São formados por 
fragmentos cromossômicos acêntricos ou cromossomos inteiros que 
são perdidos durante a divisão nuclear, e por isso, foram excluídos do 
núcleo principal das células filhas. Assim, a detecção de micronúcleos 
representa perda de cromatina devido ao dano cromossômico estrutural 
no aparelho mitótico, somente na fase da mitose. Assim, os micronúcleos 
contêm fragmentos cromossômicos resultantes da quebra de DNA, 
replicação do molde de DNA danificado e inibição da síntese da DNA. 
O teste in vitro consiste na utilização da citocalasina B, uma 
substância responsável por inibir a polimerização da proteína actina, 
requerida para a formação de anelde microfilamentos, responsável por 
induzir a contração do citoplasma e divisão da células em duas células 
filhas, fenômeno chamado de citocinese. Assim, o resultado é o acúmulo 
de células binucleadas a partir de células que passaram por apenas um 
ciclo de divisão nuclear. Ver figura 09.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial32
Figura 7: Micronúcleo em célula binucleada
Fonte: http://bit.ly/306yky2
Os critérios estabelecidos para realizar o teste de micronúcleo 
são binucleação, apresentação de dois núcleos em célula binucleada, 
membranas nucleares intactas e situadas dentro do mesmo limite 
citoplasmático, os dois núcleos da célula binucleada devem ser 
proporcionalmente iguais em tamanho e intensidade da coloração, união 
de uma fina ponte nucleoplasmática entre os dois núcleos da célula e 
ausência de sobreposição.
Os fatores que podem influenciar na frequência de micronúcleos são 
idade, provavelmente devido ao aumento de mutações em decorrência 
do acúmulo de DNA não reparado ou à diminuição da capacidade de 
reparação dos danos celulares, tabagismo, pois estudos têm mostrado 
que o fumo altera a frequência de mutações, atividade física que quando 
em excesso pode gerar altos níveis de estresse oxidativo, podendo 
acarretar danos ao DNA e peroxidação lipídica. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 33
RESUMINDO:
A evolução das técnicas de citogenética contribuiu muito 
para a acurácia do diagnóstico das doenças genéticas. 
A escolha do ensaio depende dos objetivos desejados 
bem como dos recursos disponíveis no laboratório, assim 
também como a escolha do corante. Alguns corantes 
permitem visualizar simultaneamente os cromossomos 
e os nucléolos, enquanto outros coram apenas os 
cromossomos, porém com maior nitidez e contraste. 
Quando os cromossomos são grandes, a coloração com 
orceína pode ser mais adequada, por ser mais simples e 
permitir uma observação rápida e direta dos cromossomos. 
Quando os cromossomos são muito pequenos, deve ser 
utilizado o corante de Giemsa, que garante uma coloração 
mais intensa e melhor contrastada. Além dessas técnicas 
convencionais, pode-se utilizar as técnicas moleculares, 
a exemplo de Hibridização in situ na qual são utilizadas 
sondas marcadas com fluorocromos que se ligam ao DNA 
ou ainda pode-se usar o ensaio de micronúcleos para 
avaliar a presença e extensão do dano cromossômico.
Diagnóstico citogenético nas doenças 
genéticas 
No laboratório clínico de forma rotineira são usadas várias técnicas 
de análise cromossômicas para o auxílio de doenças como a leucemia 
mieloide crônica, síndrome mielodisplásica, leucemia linfócítica aguda e 
crônica, linfomas e tumores sólidos. 
Técnica de análise para o auxílio de 
leucemia mielóide crônica (LMC)
A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa 
clonal na qual o paciente apresenta fraqueza, cansaço, indisposição, dor 
abdominal, aumento de volume do abdome ou empachamento após as 
refeições devido ao aumento do tamanho do baço. A fisiopatologia da 
doença é caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia(Ph), 
com apresentação da translocação t (9;22)(q34;q11), formando o rearranjo 
gênico BCR-ABL.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial34
O gene da fusão BCR‐ABL1 transcreve RNAm, que é responsável 
por codificarumaproteína com atividade tirosina-quinase maior que a 
proteína produzida pelo ABL “selvagem”. Dependendo do ponto de quebra 
no BCR, o produto da fusão pode ser: M-BCR (major), m-BCR (minor) ou 
μ BCR. O M-BCR é o mais comum na LMC, e resulta em proteína de 210 
kD (p210BCR-ABL). A ativação constitutiva da sinalização mitogênica, 
redução da apoptose e redução da adesão das células ao estroma e à 
matriz extracelular são as possíveis ações da proteína BCR‐ABL1 são os 
mecanismos propostos na fisiopatologia da LMC. Ver figura 10.
Figura 8: Indivíduo normal x indivíduo com LMC
Fonte: http://bit.ly/2NeQ7xV
Para o diagnóstico da LMC são usados o hemograma, avaliação 
da extensão sanguínea, imunofenotipagem e citogenética para a 
identificação do cromossomo Philadelphia ou do complexo BCR/ABL1. 
A técnica usada é a hibridização in situ por fluoresce ̂ncia (FISH). Essa 
te ́cnica detecta o rearranjo BCR/ABL1, e tem sido preconizada para as 
situações em que não se têm metáfases para análise ou de cromossomo 
Ph mascarado no cariótipo. 
O prognóstico é feito por meio da correlação entre as alterações 
cromossômicas e a leucemia e que conferirá um bom ou pior prognóstico 
para o paciente. Dessa maneira, a presença do cromossomo Ph confere 
maior sobrevida aos pacientes, por isso é considerado bom prognóstico, 
o que não ocorre com os Ph negativos, os quais devem fazer testes 
confirmatórios para excluir totalmente a não-presença do cromossomo 
Ph. A prevalência do cromossomo Ph é de cerca de 90% a 95% dos 
pacientes e os Ph negativos geralmente são encontrados nos idosos, 
osqauis apresentam leucocitose, trombocitopenia com resposta fraca 
à terapia e a sobrevida desses pacientes geralmente é bem mais curta. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 35
Técnica de análise para o auxílio de 
leucemia mielóide aguda (LMA)
A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença que tem por 
característica aproliferação de mieloblastos anormais. Fatores como 
exposição a benzeno, radiação ionizante e tratamento com agentes 
alquilantes ou outras drogas citotóxicas podem desencadear a LMA. 
O diagnóstico laboratorial é feito a partir da análise do hemograma, 
mielograma, imunofenotipagem, estudo cromossômico dos blastos 
(cariótipo) e análises moleculares.
A citogenética busca a identificação das alterações t(8;21), t(15;17), 
inv(16) e 11q23, recomendadas pela Organização Mundial de Saúde. 
As categorias de risco são baseadas na identificação citogenética, por 
exemplo, quando for encontrado t(8;21) com ou sem del(9q) e com ou 
sem complexidade com mais de três alterações, t(15;17) com ou sem 
alterações adicionais, inv(16)/ t(16;16)/del(16q) com ou sem alterações 
adicionais, é favorável para o paciente, porém se for identificado -5/
del(5q), -7/del(7q), inv(3q)/t(3;3), t(6;9), del(9q), t(9;22), 11q anormal, 20q, 
21q, ou 17p ou cariótipo complexo definido com mais de três alterações, 
é desfavorável para o paciente.
Na fase LMA-M0 o estudo da imunofenotipagem relata uma 
população blástica com relação entre tamanho/grânulo (FSC/SSC) 
baixa, com positividade para pelo menos um dos antígenos de linhagem 
mielóide CD33, CD13 e/ou CD11b. Na LMA-M7 os marcadores de 
superfície encontrados são CD13 e CD33, CD41, CD42, CD61 e em alguns 
casos HLa-DR negativo. Na LMA-M2V os blastos são positivos para os 
antígenos de linhagem mielóide CD13, CD33, CD65w e anti-MPO. 
No entanto, o achado imunofenotípico patognomônio é a 
presença dos antígenos de linhagem linfóide (CD19) ou linhagem 
NK (CD56) associados aos antígenos CD33 e CD34, na LMA-M3 os 
blastos apresentam grande auto-fluorescência, e positividade para os 
marcadores de linhagem mielóide CD13 e CD3343. E apresentam, os 
antígenos CD34, HLA-DR e CD14 são negativos, na LMA-M4Eo apresenta 
marcação positiva para os antígenos de linhagem mielóide CD13 e CD33, 
assim como para os antígenos de linhagem monocítica CD14, CD15 e 
CD11b. Caracteristicamente, há expressão anômala do antígeno de 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial36
linhagem linfóide CD2, na LMA-M5 os antígenos de linhagem mielóide 
CD33 são positivos e os CD13, negativos. Os antígenos CD14 e CD15 são 
positivos. A técnica para a identificação dessas alterações é Hibridização 
in situ que é rápida, sensível e específica. 
Técnica de análise para o auxílio de 
síndrome mielodisplásica (SMD)
A síndrome mielodisplásica (SMD) corresponde ao um conjunto 
de doenças com proliferação clonal das células da medula óssea, 
caracterizado, nas fases iniciais, por pancitopenia devido à alteração na 
apoptose e na maturação das células e, nas fases mais tardias,por evolução 
para leucemia aguda, em decorrência do bloqueio de diferenciação.
Agentes físicos e químicos podem estar associados ao desen-
volvimento da doença. O estudo citogene ́tico em SMD é usada como 
ferramenta para o diagno ́stico, progno ́stico, previsa ̃o de progressa ̃o da 
doença e escolha terapêutica. Ale ́m disso, a presenc ̧a de anormalidade 
citogene ́tica confirma a monoclonalidade da doenc ̧a. As alterações 
citogenéticas mais comuns são 5q-, 7q-, 20q-, 11q-, 13q-, 12p-, 17p-.
Além desses testes, pode-se realizar a imuno-histoqui ́mica, 
usando os marcadores CD34, CD117/c-kit ou da protei ́na p53 em ce ́lulas 
imaturas; nesse caso haverá expressa ̃o de marcadores de linhagem em 
precursores imaturos ou pode realizar a técnica de Hibridização in situ 
por fluorescência. 
Técnica de análise para o auxílio de 
leucemia linfocítica aguda (LLA)
A leucemia linfoci ́tica aguda (LLA) e ́ uma doenc ̧a de origem 
heterogênea, caracterizada pela proliferac ̧a ̃o clonal com acu ́mulo de 
ce ́lulas linfobla ́sticas malignas na medula o ́ssea e no sangue perife ́rico. 
É uma doença que podem ter várias etiologias como genética, fatores 
ambientais, hematopoiéticos ou ao acaso. 
A abordagem diagnóstica é feita a partir da combinação de vários 
métodos como a citomorfologia, a citoqui ́mica e a imunofenotipagem 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 37
permitem a categorização em diferentes linhagens. As leucemias de 
linhagem B estão divididas de acordo com os estágios de maturação 
dos progenitores B na medula óssea, dessa forma são classificadas em: 
pró-B, comum, pré-B e B-maduro. A LLA do tipo pró-B representa 5% 
dos casos pediátricos e 10% dos casos de LLA em adultos. As células 
expressam: HLA-DR, Terminal Desoxinucleotidil Transferase (TdT), CD34, 
CD19 e CD22(c)(31). 
A LLA do tipo comum expressa CD10, o que é de bom prognóstico, 
CD22(c), CD19 e/ou CD20. Esse tipo representa cerca de 75% dos casos da 
LLA infantil e 50% dos casos em adultos. A leucemia pré-B expressa cadeia 
µ citoplasmática, em adição a CD19, CD20 e CD10(31), representando, 
aproximadamente, 15% das crianças com LLA e 10% dos casos em adultos. 
E, a LLA do tipo B maduro, presente em 2% a 5% de crianças e adultos, 
apresenta um fenótipo incomum, caracterizando-se pela expressão de 
cadeias leves de imunoglobulina na superfície de membrana (SmIg). Os 
blastos apresentam as mesmas características morfológicas (FAB L3) e 
translocações cromossômicas associadas à célula maligna do linfoma 
de Burkitt (23, 28, 31, 34). Este tipo de leucemia apresenta prognóstico 
desfavorável, pois há elevada incidência de envolvimento no sistema 
nervoso central (SNC), resposta deficiente à terapia e sobrevida abreviada.
A anormalidade estrutural mais frequente é a t(12;21) (TEL/AML1 
ou ETV6/RUNX1), ocorrendo em 20 a 25% dos pacientes. A técnica usada 
é a de Hibridizaçaoin situ por imunofluorescência. 
Técnica de análise para o auxílio de 
Linfomas
Os linfomas são doenças caracterizadas por desordem hemato-
lógica e representam a terceira causa de câncer na infância. Os sintomas 
dos pacientes são aumento de linfonodos e/ou sintomas sistêmicos, 
como febre, sudorese noturna, perda de peso ou fadiga. O diagnóstico 
deve ser baseado na história clínica, exame físico detalhado, realização 
de um aspirado de medula óssea com biópsia, com avaliação pela 
imuno-histoquímicas como auxílio na distinção dos infiltrados e a 
imunofenotipagem. 
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial38
Diversos fatores estão elencados no ínicio da doença como infecc ̧a ̃o 
crônica, imunossupressa ̃o e histo ́ria familiar. Infecções com o vírus Epstein-
Barrvi ́rus [EBV, HTLV ( víruslinfotrópico para células T humanas do tipo 1, 
o herpes vi ́rus humano do tipo 8 [HHV8]), Helicobacterpylori e o vírus da 
hepatite C podem estar associados ao aparecimentos de linfomas. 
Técnica de análise para o auxílio de 
tumores sólidos
Tumores sólidos são caracterizados pelo crescimento anormal 
de células de um tecido, alguns tumores como câncer de mama e 
meduloblastoma, são avaliados na citogenética a partir da alteração 
ERBB2/ HER2/NEU, receptor de fator de crescimento de epiderme e 
para o muduloblastoma é avaliado o isocromossomo do brac ̧o longo 
do cromossomo 17 (i17q). A técnica usada para a identificação é a de 
hibridização in situ por fluorescência. 
RESUMINDO:
As doenças genéticas tem origem multifatorial como 
fatores ambientais, genotóxicos, desordens hematológicas, 
translocações cromossômicas, entre outras coisas. O 
diagnóstico laboratorial é baseado num conjunto de 
métodos diagnósticos como avaliação celular, imunofeno-
tipagem, imunohistoquímica, citogenética molecular. A 
citogenética é de fundamental importância porque ajuda 
no estadiamento da doença, bem como no prognóstico. O 
diagnóstico realizado de maneira precoce ajuda no início 
do tratamento e diminui o avanço da doença. A técnica 
mais utilizada hoje no laboratório é a de hibridização in situ 
devido a alta sensibilidade e especificidade.
Citogenética no Diagnóstico Laboratorial 39
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Editora Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, RJ, 525 pp. Disponível 
em: http://bit.ly/2P2DINR. Acesso em 28 de agosto de 2019.
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