Cap 5 Técnicas de Coleta, Fixação e Coloração (2)

Prévia do material em texto

CAPÍTULO 5
Técnicas de Coleta, Fixação e Coloração 
Princípios de Coleta 
Duas técnicas de coleta são utilizadas para a citologia ginecológica: esfoliativa e abrasiva. Um exemplo de citologia esfoliativa é o esfregaço vaginal. Ele baseia-se na obtenção de células que descamam espontaneamente das superfícies do colo e da vagina e se acumulam no fundo-de-saco vaginal posterior (Fig. 5.1, A). A citologia abrasiva depende da remoção de células das superfícies da cérvice, da endocérvice e da vagina com o auxílio de um instrumento. Os esfregaços obtidos com uma espátula de Ayre ou uma escova endocervical são exemplos de citologia abrasiva (Fig. 5.1, C a E). 
Técnicas de Coleta Esfregaços Vaginais 
O esfregaço vaginal é preparado com o material removido do fundo-de-saco posterior por meio de um abaixador de língua, uma pipeta de vidro ou a extremidade arredondada de uma espátula (Fig. 5.1, A). Além das células epiteliais descamadas dos epitélios vaginal e cervical, o esfregaço também contém muco, leucócitos, macrófagos e detritos celulares. Mais raramente podemos encontrar células de origem endometrial, tubária, ovariana e, até mesmo, peritoneal. O material também pode conter bactérias, vírus, fungos e parasitas. 
 Figura 5.1 - Métodos de obtenção de amostras citológicas do trato genital feminino. (A) Esfregaço vaginal obtido do fundo-de-saco vaginal posterior, segundo a técnica original de Papanicolaou. Além das células da vagina e do colo, as amostras podem conter células endometriais e das porções mais superiores do trato genital. (B) Esfregaço obtido da parede lateral da vagina para avaliação hormonal. (e) Espátula de Ayre para coleta de esfregaços cervicais. (O) Uma modificação da espátula de Ayre com um prolongamento endocervical mais longo para melhorar a coleta desta região. (E) Escova endocervical.
A vantagem dos esfregaços vaginais é a boa representatividade das células com origem em todos os segmentos do trato genital; a desvantagem é, principalmente, o mau estado de conservação dessas células. Geralmente os esfregaços vaginais demonstram evidências escassas das anomalias produzidas por lesões pré-cancerosas e cancerosas do colo uterino. No entanto, eles são mais eficazes que os esfregaços cervicais na detecção de tumores ocultos do endométrio, das tubas e dos ovários, bem como de lesões metastáticas. Por este motivo, os autores defendem o emprego dos esfregaços vaginais nas mulheres com idades a partir dos 45 anos. 
O esfregaço obtido por raspagem dos terços superiores das paredes laterais da vagina constitui o método ideal para a avaliação do estado hormonal (Fig. 5.1, B; ver Cap. 7). 
Esfregaços Cervicais 
O instrumento mais utilizado para a obtenção do esfregaço cervical é a espátula descrita em 1947 por um citoginecologista canadense chamado Ayre Fig. 5.2, A). O formato da espátula é ideal para a amostragem da superfície ectocervical e da porção mais inferior do canal endocervical. 
Para que o material seja adequadamente coletado, a extremidade mais longa da espátula deve ser introduzida no canal cervical, enquanto sua parte côncava entra em contato com a ectocérvice. Com o auxílio de uma pequena pressão, o instrumento deve ser girado sobre seu eixo maior, de forma a realizar uma rotação completa, permitindo assim a amostragem de toda a superfície epitelial (Fig. 5.3). Existem no comércio, inúmeras variantes da espátuIa de Ayre e os resultados obtidos por elas são todos semelhantes . 
Figura 5.2 - Instrumentos usados na coleta de amostras cervicais. (A) Espátula de Ayre. (B) Escova Cervex. (C) Escova endocervical.
Figura 5.3 - A coleta endocervical, por meio de espátula do tipo Ayre, exige a rotação de 360° do instrumento, ao mesmo tempo em que se aplica uma certa pressão sobre ele. Também podem ser vistos os principais tipos celulares obtidos por esta técnica. 
Também existem no mercado vários modelos de escovas que possibilitam a coleta das células que revestem o canal cervical (Fig.5.2, C). Já foi relatado, especialmente por Boon et al. em 1986, que o uso de escovas endocervicais aumenta a eficácia da detecção das lesões situadas nesse local. O lado negativo das escovas é a perda do tampão mucoso, localizado no orifício externo, que precisa ser removido para a introdução das mesmas. Esse muco endocervical é uma fonte valiosa de material celular diagnóstico. 
O emprego das escovas exige prática e destreza manual. É necessário rodar completamente o instrumento, sem produzir traumas no epitélio endocervical (Andersen et al., 1988). Com alguns tipo de escova, a ocorrência de pequenos sangramentos é muito comum. Segundo a nossa experiência, a análise de agrupamentos celulares espessos, presentes nos materiais obtido, com o uso de escovas endocervicais, pode ser tanto difícil.
Os esfregaços coletados com o auxílio das escovas endocervicais devem ser associados à material obtido com uma espátula para que se possam retirar informações relativas à ectocérvice, uma região que alberga algumas lesões pré-cancerosas (Buntinx et al., 1991). A escova Cervex, composta por filamentos plásticos de tamanhos variáveis, permite a amostragem simultânea do canal endocervical e da ectocérvice (Fig. 5.2, B), sendo um possível substituto para a combinação entre escova cervical e espátula. A citologia abrasiva é superior ao esfregaço vaginal no que diz respeito à detecção de lesões pré-cancerosas e cancerosas da cérvice uterina. 
Várias técnicas de autocoleta já foram descritas, tais como a pipeta de Davis e o tampão vaginal. Tais métodos são considerados inferiores à coleta direta e foram abandonados. 
Preparo do Esfregaço 
Antes de o profissional preparar o esfregaço, ele deve assegurar a disponibilidade de lâminas limpas de vidro de boa qualidade. Após identificar a cérvice e obter o material, o instrumento de coleta é colocado sobre a superfície da lâmina de vidro e o esfregaço é produzido arrastando-o ao longo do maior eixo da lâmina. O preparo do esfregaço deve ser rápido para evitar-se o dessecamento do material. Ambas as superfícies da espátula e todas as faces da escova devem entrar em contato com a lâmina de vidro, tomando-se o cuidado para distribuir o material de forma homogênea. Movimentos circulares podem lesar as células e, portanto, não são recomendáveis. 
A fixação dos esfregaços deve ocorrer imediatamente após o seu preparo para preservar as células nele contidas. 
A técnica da tríplice coleta, defendida por Wied e Bahr (1959), na qual uma única lâmina recebe material da vagina, da ectocérvice e do canal endocervical (VCE), permite um rastreamento muito rápido destes três locais, porém exige uma enorme destreza manual para impedir o dessecamento celular. 
Identificação do Esfregaço e Informação Clínica 
A identificação da lâmina deve ocorrer antes do preparo do esfregaço. Caso sejam utilizadas lâminas com uma extremidade fosca, o nome da paciente poderá ser escrito com um lápis; caso contrário, um lápis com ponta de diamante será necessário. Os dados clínicos também devem ser informados. Dentre as informações clínicas mínimas e necessárias devem constar: idade da paciente, data de sua última menstruação ou menopausa, antecedentes pessoais e uso de medicações. 
Após a fixação do esfregaço, ele deverá ser unido ao formulário contendo os dados clínicos e só então enviado ao laboratório para posterior processamento. 
Fixação e Fixadores 
A fixação preserva as características morfológicas das células. Como já foi dito anteriormente, os esfregaços precisam ser fixados imediatamente após sua coleta para evitar o seu dessecamento pelo ar. Esse dessecamento pode produzir modificações significativas nas propriedades morfológicas e tintoriais das células. 
O fixador ideal não pode ser tóxico, não deve evaporar à temperatura ambiente e o custo deve ser aceitável. Por tais razões, o álcool é considerado o fixador ideal, seja em sua forma líquida ou aerossol. O álcool desnatura as proteínas e os ácidos nucléicos, além de torná-losinsolúveis e estáveis. O Quadro 5.1 apresenta alguns fixadores habituais, tais como o etanol (desnaturado ou não desnaturado), o propanol, o isopropanol e uma mistura de álcool com uma solução de um plástico (por exemplo, polietileno glicol). O fixador a base de álcool- éter, que foi inicialmente defendido por Papanicolaou, foi abandonado por motivo de segurança: o éter é inflamável. O período de fixação deve ser de pelo menos 15 minutos. 
Os fixadores na forma aerossol contêm isopropanol e polietileno glicol (carbowax), sendo este último o responsável pela proteção das células durante o dessecamento. A fixação com um aerossol deve obedecer a certas regras. O orifício de saída do fixador deve estar situado a cerca de 30 cm da superfície da lâmina (Fig. 5.4). Caso ele esteja muito próximo da lâmina, o jato poderá deslocar e danificar as células, criando assim artefatos que dificultam a análise do esfregaço. Em contrapartida, se a distância for superior a 30 cm, a fixação poderá ser inadequada. 
Alguns aerossóis para cabelo, os quais apresentam uma composição química semelhante à dos fixadores, são de uso fácil e econômicas. A dessecação pelo ar, após a fixação do esfregaço, pode ocasionar pequenas distorções na qualidade da coloração, ainda que ela ofereça a grande vantagem da lâmina poder ser enviada ao laboratório em uma condição seca, sobre papelão ou dentro de recipientes plásticos. Ainda que não existam evidências demonstrando qualquer grau de toxicidade de seus componentes, recomenda-se evitar a inalação dos aerossóis fixadores. 
É essencial remover o polietileno glicol mediante lavagem com álcool, antes de o esfregalo ser corado. 
Coloração 
O processo de coloração facilita o reconhecimento dos componentes celulares. Como regra, os núcleos captam os elementos basofílicos dos corantes, assumindo uma cor azul ou um tom azulado. O citoplasma pode adquirir uma cor rosa (eosinofílico) ou azul (cianofílico). 
A coloração de Shorr, combinada com a hematoxilina de Harris, pode dar excelentes resultados, tal como foi proposto por Pundel (1957), sendo há vários anos a técnica de escolha de um dos autores (Claude Gompel). A técnica de Shorr produz um bom contraste na coloração citoplasmática das células escamosas. Por este motivo, é recomendada nas avaliações hormonais. Hoje em dia a coloração de Papanicolaou é empregada de forma universal na citologia ginecológica. 
Figura 5.4 - Fixação do esfregaço com aerossol. A distância ideal entre o orifício de saída do aerosoI e a lâmina é de aproximadamente 30cm.
Todas as técnicas de coloração respeitam os mesmos princípios. Os núcleos são corados pela hematoxilina, que é tratada com óxido de mercúrio e transformada em hemateína. A cor azul dos núcleos é intensificada após seu tratamento com alumínio-sulfato de amônia (ALUM). 
Os corantes laranja G (LG), eosina-álcool (EA), verde claro e marrom de Bismarck são citoplasmáticos. Papanicolaou propôs diversas variações para os corantes citoplasmáticos, sendo as mais empregadas a EA 36 (comercialmente disponível como EA 50) ou a EA 65, combinadas com LG 6. 
Método de Papanicolaou Componentes da Coloração de Papanicolaou 
Hematoxilina de Harris Ingredientes (para lL) 
Hematoxilina C.I. 75290............................... 5g 
Metanol ou etanol absolutos...................... 50 mL 
Óxido de mercúrio (HgO)............................ 2,5g 
Alumínio-sulfato de amônia 
(ALUM)...................................................... 100g 
Ácido acético glacial.................................... 40 mL 
Água destilada............................................ 1.000 mL 
Método de preparo (usar um frasco de vidro com capacidade para 1.500mL) 
1. Dissolver a hematoxilina no álcool. 
2. Dissolver o ALUM na água e aquecer até o ponto de fervura. 
3. Adicionar a hematoxilina dissolvida à solução de ALUM e mais uma vez aquecer até o ponto de fervura. 
4. Remover o frasco do fogo e acrescentar imediatamente o óxido de mercúrio. 
5. Agitar a solução até que surja uma cor vermelho-escura. 
6. Resfriar o frasco em banho-maria. 
7. Filtrar e armazenar em uma garrafa escura. 
Contracorantes citoplasmáticos EA 36 (para citologia cérvico-vaginal)
 Ingredientes (para 1L) 
Verde-claro a 0,1 % em etanol a 95% ............................450 mL 
Marrom de Bismarck a 0,5% em etanol a 95%...............100 mL 
Eosina a 0,5% em etanol a 95% .....................................450 mL 
Ácido fosfotungstênico...................................................2g 
Carbonato de lítio...........................................................10 gotas 
EA 65 (para outras preparações citológicas)
 Ingredientes (para 1L) 
Verde-claro a 0,1% em etanol a 95% ...............................225 mL 
Marrom de Bismarck a 0,5% em etanol a 95% ................100 mL 
Eosina a 0,5% em etanol a 95% ........................................450mL 
Ácido fosfotungstênico.....................................................6g 
Etanol a 95%.....................................................................225 mL 
Comentário sobre o preparo do EA 36 e do EA 65: Prepare soluções de reserva dos corantes, diluídas a 1:9 em água destilada. Para obter uma solução a 0,1% de verde-claro misture 1 mL de solução aquosa em 999mL de etanol; para obter uma solução a 0,5% de marrom de Bismarck ou de eosina, misture 5mL de solução aquosa em 995 mL de etanol. Filtre e armazene em garrafas escuras até o uso. O EA 36 (ou o seu correspondente comercial, o EA 50) contém uma proporção maior de verde claro do que o EA 65 e, portanto cora de forma muito intensa os esfregaços não ginecológicos. Alguns profissionais preferem o EA 65 para os esfregaços ginecológicos, por ser capaz de corar em azul as células do adenocarcinoma de endométrio e em rosa as do carcinoma da endocérvice. Tais diferenças tintoriais são de pouco uso na prática diária. 
Laranja G 
Ingredientes 
LG a 10% em água destilada................... 50 mL 
Ácido fosfotungstênico...........................0,15g 
Etanol a 95%.......................................... 950 mL 
Comentário sobre o preparo da LG: Prepare uma solução aquosa de LG a 10%. Para preparar uma solução de reserva, misture 50 mL da solução aquosa em 950mL de etanol a 95%. Agite a solução e armazene em garrafas escuras. Filtre antes de usar. 
 Coloração de Papanicolaou 
Etanol a 80, 70 e 50% ......................................................10 imersões cada um. 
Água destilada..................................................................1 minuto.
Hematoxilina de Harris..................................................... 1 a 3 minutos.
Água destilada..................................................................1 minuto.
Diferenciação em ácido clorídrico a 0,25%........................6 imersões cada um.
Água corrente (azulamento) ........................................... 6 minutos. 
Etanol a 50, 70 e 95%....................................................... 10 imersões cada um 
LG....................................................................................2 minutos 
Etanol a 95%................................................................... 3 lavagens, 10 imersões cada um 
EA 36, EA 50 ou EA 65..................................................... 2 minutos 
Etanol a 95%................................................................... 3 lavagens, 10 imersões cada um 
Etanol absoluto ...............................................................3 lavagens, 10 imersões cada um 
Xilol, 3 a 5 lavagens......................................................... 10 imersões cada um 
Montar a lâmina e cobrir com lamínula. 
Nota: As lâminas fixadas com aerossol contendo propileno glicol (carbowax) devem ser lavadas em etanoI a 50%, por 5 a 10 minutos, antes de serem coradas. 
Método de Shorr com Hematoxilina de Harris 
Ingredientes 
Etanol a 50% ...........................................100mL 
LG ............................................................0,25g 
Vermelho escarlate de Bielrich.................0,5g 
Verde claro..............................................0,075g 
Ácido fosfotungstênico............................0,5g 
Ácido acético glacial................................. 1 mL 
Dissolver todos os ingredientes em etanol. Filtrar e armazenar em garrafas escuras. 
Coloração de Shorr
Etanol a 70%.................................................. lavagem, 10 imersões 
Água destilada............................................... lavagem, 10 imersões 
Hematoxilina de Harris................................. 1 a 3 minutos 
Caso necessário, diferenciar em ácido clorídrico a 1%
Carbonato de lítio, saturado......................... Iavagem, 10 imersões 
Etanol a 70, 95% e absoluto.......................... Iavagem, 10 imersões cada um
 Xilol................................................................3 a 5 lavagens, 10 imersões cada um 
Nota: Para maiores detalhes com relação aos corantes e técnicas de coloração, consulte Bales e Durfee, 1992.
Princípios de Rastreamento 
As lâminas que foram adequadamente fixadas, e coradas estão agora prontas para o exame microscópico ou rastreamento. 
A primeira etapa é verificar a identificação do esfregaço e o formulário com os dados clínicos que veio junto com ele. Os arquivos do laboratório devem ser checados em busca de exames anteriores da mesma paciente. Esta informação deve estar disponível antes do início do rastreamento. 
Um dos princípios básicos do rastreamento e a colocação da lâmina sobre a placa do microscópio. Todas as lâminas devem ser sempre posicionadas da mesma forma, com a identificação para a direita ou esquerda. O posicionamento adequado dos esfregaços torna mais fácil a marcação e a descoberta de células importantes. 
O rastreamento primário é feito com uma objetiva de 1Ox e uma ocular de 10x ou 15x. 
Ele deve ser sistemático e cada campo do esfregaço precisa ser avaliado de tal forma que ele seja sobreposto aos campos vizinhos. 
O rastreamento pode ser vertical ou horizontal. De acordo com nossa experiência, o rastreamento vertical é melhor, pois permite um maior controle da superposição dos campos (Fig. 5.5). Quaisquer anomalias observadas durante o rastreamento devem ser reexaminadas com a objetiva de 40x. Células anômalas ou não habituais devem ser marcadas com pontos de tinta, sempre posicionados da mesma forma por todos os funcionários do laboratório. Essa metodologia de marcação dos esfregaços facilita sobremaneira a revisão das células que preocuparam o avaliador inicial. 
A qualidade do esfregaço, o nível técnico da lâmina e qualquer achado anômalo devem ser incluídos no resumo diagnóstico. O laudo final deve obedecer ao Sistema Bethesda, tal como foi resumido por Kurman e Solomon em 1993 (ver Cap. 9). No caso dos esfregaços negativos, é essencial indicar se o mesmo é inadequado ou inferior ao considerado ideal. Caso ele seja "inferior ao ideal”, as razões que levaram a esta conclusão deverão ser apresentadas. A seguir, são discutidos os critérios que definem um esfregaço como adequado. 
Definição de um Esfregaço Adequado 
Um esfregaço adequado deve ser representativo de todas as superfícies epiteliais do colo e da vagina, bem como precisa conter um número suficiente de células que permita o reconhecimento de qualquer alteração. Na prática, o número ideal de células é algo extremamente difícil de ser definido e a análise básica do esfregaço acaba sendo baseada no bom senso. A experiência vem demonstrando que um esfregaço cervical adequado, de mulheres em idade fértil, contém entre 50.000 e 300.00 células epiteliais. Obviamente, os esfregaços de mulheres pré-púberes ou menopausadas contêm menor número de células. Os esfregaços obtidos com raspagens ou escovagens muito vigorosas podem apresentar-se obscurecidos por sangue ou então conter células estromais. 
Figura 5.5 - Três métodos para rastreamento do esfregaço. Em nossa opinião, o método 2 é o melhor, pois ele permite a superposição de campos durante o exame. O método 3 é recomendado por alguns autores como uma forma de rastreamento rápido para controle de qualidade. 
Um dos aspectos fundamentais da amostragem cervical é a presença de células provenientes da zona de transformação, as quais representam o epitélio endocervical passando por uma metaplasia escamosa. Sendo assim, a presença de células endocervicais ou metaplásicas deve ser considerada uma evidência de um esfregaço adequado. O terceiro componente que, segundo nossa experiência, precisa ser valorizado é a visibilização de muco cervical, que surge na forma de faixas de material amorfo azulado com células em seu interior. Muitas vezes o muco cervical é a única estrutura que contém evidências de um processo patológico, particularmente nas lesões do canal endocervical. 
Alguns autores defendem que a presença de células endocervicais colunares é fundamental para que um esfregaço seja considerado adequado (Mitchell e Medley, 1992, 1993). Já Kurman e Solomon (1993) sugerem que um esfregaço, para ser considerado adequado, deve conter dois agrupamentos de cinco células endocervicais. Em contrapartida, outros autores relatam que a presença de células endocervicais não é necessariamente um critério confiável de qualidade de um esfregaço (Metcalf et al., 1994). Essa é também a nossa experiência; sendo assim, considera-se um esfregaço adequado e interpretável, caso ele contenha pelo menos dois dos seguintes três elementos: células colunares endocervicais, células metaplásicas e muco endocervical. Estes critérios são aplicáveis apenas a esfregaços de mulheres em idade fértil. No caso de pacientes menopausadas, a presença destes componentes não pode ser verificada. O conceito de "esfregaço adequado" só pode ser aplicado aos esfregaços negativos. Qualquer esfregaço contendo células anômalas é, por definição, adequado. 
	
� PAGE \* MERGEFORMAT �1�