Relatório Microbiologia - CONTAGEM DE MICRORGANISMOS

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CAMPINA GRANDE 
2018 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA – UEPB 
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA – CCT 
CURSO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL 
 
COMPONENTE CURRICULAR: Técnicas Experimentais de Microbiologia Experimental 
PROFESSORA: Weruska Brasileiro Ferreira 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADES PRÁTICAS 
 
AULA VIII – CONTAGEM DE MICRORGANISMO 
 
 
 
 
 
 
 
AMANDA MYRNA DE MENESES E COSTA 
Matrícula: 162010010
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 2 – Técnicas spread plate e pour plate ........................................................................... 4 
Figura 1 – Esgotamento por estrias ............................................................................................ 4 
Figura 3 – Semeadura em gotas .................................................................................................. 5 
Figura 3 – Membrana Filtrante (placa de Petri evidenciando a presença de E. coli) ................. 5 
Figura 4 – Área de contagem da Câmara de Neubauer .............................................................. 6 
Figura 5 – Detalhes da técnica de estriamento e placas de Petri com crescimento de culturas por 
essa técnica ............................................................................................................................... 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 4 
2. OBJETIVO .......................................................................................................................... 8 
3. MATERIAIS UTILIZADOS ............................................................................................... 9 
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................ 10 
4.1. Esgotamento por estrias .............................................................................................. 10 
4.2. Técnica de spread plate ou espalhamento .................................................................. 10 
4.3. Técnica de pour plate ou profundidade ...................................................................... 10 
5. EXPERIMENTO PRÁTICO ............................................................................................. 12 
5.1. Esgotamento por estrias .............................................................................................. 12 
5.2. Técnica de spread plate ou espalhamento .................................................................. 12 
5.3. Técnica de pour plate ou profundidade ...................................................................... 12 
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 13 
Referências ............................................................................................................................... 14 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
Para realizar análises precisas e atingir os objetivos por ela propostos, muitas vezes é 
necessário não somente cultivar microrganismos presentes na amostra, mas também os 
quantificar. O método que permite a quantificação de microrganismos é o isolamento, onde 
seleciona-se e se obtêm culturas puras desses seres. 
As técnicas utilizadas para o isolamento de bactérias baseiam-se no crescimento seletivo 
dos microrganismos de interesse contidos em uma alíquota da amostra pelo emprego de meios 
sólidos ou líquidos que fornecem os nutrientes específicos para essas bactérias sob condições 
apropriadas e controladas de temperatura e tempo de incubação (CEBALLOS e DINIZ, 2017). 
Tais técnicas (de cultivo, isolamento e contagem) exigem a manipulação de amostras 
possivelmente contaminadas, além de vidrarias e meios esterilizados, assim como alguns 
equipamentos. Por isso deve-se seguir as recomendações de assepsia recomendadas. 
Além da técnica dos tubos múltiplos, também temos o cultivo por semeadura, que é 
realizado em meio sólido. A semeadura pode ser feita por estrias até o esgotamento para obter-
se colônias isoladas, utilizando alças de platina. Também pode ser realizada por espalhamento 
(ou spread plate), onde uma alíquota da amostra é colocada sobre o meio e espalhada por toda 
superfície do mesmo; ou pela técnica de pour plate (ou profundidade), onde alíquotas da 
amostra são primeiro colocadas nas placas de Petri e logo após adiciona-se o meio e mistura-se 
ambos. Podemos observar a execução dessas técnicas nas Figuras 1 e 2 abaixo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Google Imagens 
 
A semeadura também pode ser feita em gotas, dividindo-se a placa de Petri em três regiões, 
depositando-se duas gotas de cada diluição na superfície do meio respeitando as divisões feitas 
na placa, permitindo uma análise de maiores quantidades de diluições em menos placas. 
 
Figura 1 – Esgotamento por estrias 
 
Figura 2 – Técnicas spread plate e pour plate 
 
 
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Figura 3 – Semeadura em gotas 
 
Fonte: Google Imagens 
 
Ainda podemos citar a técnicas da membrana de filtração que permite a análise de grandes 
volumes da amostra, onde a mesma é filtrada por uma membrana de poros muito pequenos 
(entre 0,22 e 0,45 µm de diâmetro) geralmente com auxílio de uma bomba a vácuo conectada 
ao filtro ou uma rolha de silicone para facilitar a passagem da amostra pelos poros da membrana, 
retendo os microrganismos e sendo colocada sobre o meio de cultura sólido após a filtração. As 
bactérias se multiplicam localmente ao ficarem em contato com o meio. 
 
Figura 3 – Membrana Filtrante (placa de Petri evidenciando a presença de E. coli) 
 
Fonte: Google Imagens 
 
Na técnica de espalhamento todas as colônias se desenvolvem na superfície do meio sólido, 
facilitando sua visualização e contagem, além de permitir a fácil distinção entre os 
microrganismos desenvolvidos. Porém, deve-se tomar cuidado com a quantidade de amostra 
colocada sobre o meio, a fim de não encharcar a placa e promover um crescimento exacerbado 
das bactérias presentes. Já a técnica de pour plate permite a inoculação de volumes maiores, 
retendo as colônias dentro do ágar permitindo um crescimento lento e tamanho reduzido das 
colônias 
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Após o cultivo é necessário realizar a quantificação dos microrganismos que se 
desenvolveram, os métodos utilizados para isso variam entre a contagem direta, quantificação 
em tubos múltiplos, contagem em placas de Petri e quantificação pela técnica da membrana 
filtrante. 
A contagem direta no microscópio é feita geralmente com câmaras de Neubauer ou 
similares, que são calibradas, com a superfície de contagem quadriculada e de volume 
conhecido (0,1 mL). Esse volume é colocado na câmara coberta por uma lamínula que é levada 
à um microscópio óptico, onde se realiza a contagem. A quantificação deve ser feita através da 
contagem do número de células nas quatro áreas de maior quadriculado da câmara de Neubauer 
ou no quadrado central que possui mais divisões internas, como podemos ver na Figura 4. 
 
Figura 4 – Área de contagem da Câmara de Neubauer 
 
Fonte: Google Imagens 
 
 Os números de células de cada área são contados separadamente e a quantificação das 
células é dada através da fórmula abaixo: 
 
𝑁° 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 . 𝑚𝐿−1 =
𝑁° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 . 𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 . 10000
𝑁° 𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠
 
 
A contagem realizada nas placas de Petri cultivada
por espalhamento é semelhante à 
realizada naquelas cultivadas por profundidade. Após a incubação a contagem é feita a olho nu, 
com auxílio de uma lupa ou contador de colônias. Ao contar-se o número de colônias visível, 
deve-se multiplicar o mesmo pela diluição com a qual se está trabalhando, sendo o resultado 
final expresso em Unidades Formadoras de Colônia por mL (UFC.mL-1). 
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A quantificação de microrganismos pela técnica da membrana filtrante se dá da mesma 
forma que para as técnicas de espalhamento e de profundidade, com os resultados também 
expressos em UFC.mL-1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. OBJETIVO 
Familiarizar o estudante com uma das técnicas de contagem para avaliação do crescimento 
de bactérias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. MATERIAIS UTILIZADOS 
 Vidrarias e equipamentos: 
– Placas de Petri; 
– Bico de Bunsen; 
– Pipetas graduadas de 1 mL; 
– Estufa; 
– Alças de platina e de Drigalski; 
 
 Meios de cultura utilizados: 
– Ágar Nutriente. 
 
Observação: Os materiais utilizados para cultivo em meio sólido foram os mesmos para as 
técnicas de estriamento, espalhamento e profundidade, o que se alterou foi a alça utilizada nas 
técnicas de estriamento e espalhamento. Sendo utilizada na primeira a alça de platina e na 
segunda, a de Drigalski. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
4.1. Esgotamento por estrias 
 Selecionar uma placa de Petri com a presença de colônias; 
 Esterilizar a alça de platina na chama do Bico de Bunsen; 
 Abrir a placa selecionada próximo à chama e flambar suavemente a parte superior da 
mesma; 
 Resfriar a alça no vidro da placa e pegar cuidadosamente uma colônia presente no 
meio; 
 Fechar a placa de Petri e, com a alça na mão, abrir uma outra Placa de Petri com o 
meio já solidificado, e executar o estriamento como mostrado na Figura 5; 
 Fechar a placa, esterilizar a alça e incubar as placas estriadas invertidas na estufa. 
 
Figura 5 – Detalhes da técnica de estriamento e placas de Petri com crescimento de culturas 
por essa técnica 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Google Imagens 
 
4.2. Técnica de spread plate ou espalhamento 
 Nessa técnica precisamos, primeiramente, colocar o meio de cultura na placa de Petri 
e esperar o mesmo solidificar; 
 Feito isso, com uma pipeta estéril, retirar uma alíquota de 1 mL da amostra já 
homogeneizada, e colocar sobre a superfície do meio; 
 Esterilizar a alça de Drigalski na chama, esperar esfriar e espalhar a alíquota sobre 
toda a superfície do meio; 
 Fechar a placa e incubar em posição invertida na estufa. 
4.3. Técnica de pour plate ou profundidade 
 
 
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 Com uma pipeta estéril, transferir para uma placa de Petri também estéril 1 mL da 
amostra; 
 Depositar o meio fundido na placa e misturar à amostra, agitando nos sentidos horário 
e anti-horário; 
 Esperar solidificar e incubar em posição invertida na estufa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5. EXPERIMENTO PRÁTICO 
5.1. Esgotamento por estrias 
Seguindo os passos descritos no item 4.1., foram selecionadas placas de Petri que 
apresentaram crescimento de colônias de bactérias a serem isoladas. 
Com a alça de platina devidamente flambada, retirou-se uma quantidade suficiente de 
colônias dessa primeira placa e transferiu-se para uma segunda, já com o meio Ágar Nutriente 
solidificado. 
O estriamento foi realizado cuidadosamente para evitar rasgar o meio e em toda sua 
superfície. 
 
5.2. Técnica de spread plate ou espalhamento 
Utilizando como amostra a água bruta coletada em poços próximos ao aterro sanitário de 
Campina Grande – PB que está sendo utilizada como objeto de estudo por uma das 
pesquisadoras do laboratório, realizamos os passos descritos no item 4.2.. 
Foi colocado sobre a superfície do meio Ágar Nutriente já solidificado uma alíquota de 1 
mL da amostra, sendo espalhada com auxílio de uma alça de Drigalski devidamente esterilizada 
na chama do Bico de Bunsen. 
 
5.3. Técnica de pour plate ou profundidade 
Realizado com a mesma amostra da técnica anterior, foi-se colocada uma alíquota de 1 mL 
com uma pipeta estéril, numa placa de Petri também esterilizada e sem meio de cultura. Logo 
após isso foi-se colocado cerca de 15 mL do meio de cultura Ágar Nutriente na placa, 
misturando-o com a amostra. 
 Esperou-se esfriar para ocorrer a solidificação do meio. 
 
Observação: Nenhuma das placas inoculadas foram incubadas na estufa, pois a mesma estava 
em uso e não poderia ter sua temperatura alterada, já que se encontrava secando a biomassa de 
microalgas a uma temperatura de 55°C e para o cultivo de bactérias em geral utiliza-se 
temperaturas entre 35 e 36°C. 
 
 
 
 
 
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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Em um laboratório é necessário realizar o cultivo, isolamento e contagem de 
microrganismos. Nessa aula pudemos aprender técnicas utilizadas na realização dessas 
atividades. 
Para isolar culturas, realizamos a técnica de esgotamento com estrias, onde, através de uma 
cultura obtida de uma placa de Petri, esgotamos a mesma sobre a superfície do meio de cultura 
sólido em uma segunda placa com auxílio de uma alça de platina. 
Já as técnicas de cultivo em meio sólido exploradas na aula prática foram as de 
espalhamento e de profundidade. Na primeira, uma alíquota da amostra foi colocada sobre o 
meio e espalhada com a alça de Drigalski a fim de obter culturas com crescimento na superfície 
do meio. Na segunda técnica a alíquota foi colocada antes do meio de cultura, que já se 
encontrava preparado e fundido, o mesmo foi colocado sobre a amostra e misturado. As culturas 
obtidas por essa técnica crescem tanto na superfície quanto dentro do próprio meio. 
Não realizamos as contagens de microrganismos, pois a incubação na temperatura correta 
não foi possível, uma vez que a estufa estava em uso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Referências 
 
BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde – Funasa. Manual Prático de 
Análise de Água. Brasília: Funasa, 2013. 
 
BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde – Funasa. Manual do Controle de 
Qualidade da Água para Técnicos que Trabalham em ETA’s. Brasília: Funasa, 2014. 
 
CEBALLOS, B. S. O., DINIZ, C. R. Técnicas de Microbiologia Sanitária e Ambiental. 
Campina Grande: EDUEPB, 2017.