Precisão analitica

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Medidas em Análise Instrumental
Prof. Dra. Adriana Dantas
Ciência e Tecnologia de Alimentos
UERGS, Caxias do Sul, RS
Validação dos resultados analíticos
Critérios numéricos para selecionar um método analítico de acordo com sua eficiência
Precisão e exatidão de medida
A precisão de uma medida é prontamente determinada pela comparação dos dados de réplicas cuidadosas de experimentos. 
Infelizmente, uma estimativa da exatidão não é tão fácil de ser obtida.
Para determinar a exatidão, temos de conhecer o valor verdadeiro, que geralmente é o que se busca em uma análise.
Os resultados podem ser precisos sem ser exatos e exatos sem ser precisos. 
Precisão
A precisão descreve a reprodutibilidade das medidas – em outras palavras, a proximidade entre os resultados que foram obtidos exatamente da mesma forma. 
A precisão de uma medida é determinada pela repetição da medida em réplicas da amostra.
Três termos são empregados para descrever a precisão de um conjunto de dados de réplicas: 
desvio-padrão, variância e o coeficiente de variação. 
Os três são uma função de quanto um resultado individual xi difere da média, que é denominado desvio em relação à média.
Avaliar a precisão
A precisão é uma medida da reprodutibilidade de um resultado.
Para se estabelecer a precisão de um método analítico que está sendo utilizado para determinar algum parâmetro em uma amostra, é necessária a obtenção de parâmetros estatísticos básicos.
Em análise quantitativa, considera-se uma precisão aceitável quando o CV < 10%. 
A precisão sempre terá distorções de medida, pois envolverá sempre uma variedade de fatores para gerar erros:
- corrente elétrica
- formação de base do analista na forma de operação e interpretação
- reagentes de lotes ou fabricantes diferentes
- estado emocional do analista
- iluminação do ambiente de trabalho
- variabilidade intrínseca do equipamento (estabilidade ou tempo de estabilização)
- necessidade analítica para obter a destreza do primeiro resultado
- diluições, derivações, alíquotas, temperatura ambiente e de armazenamento
- transportes envolvidos até a realização da amostra
- limpeza do material analítico e de coleta
A exatidão
Indica a proximidade da medida do valor verdadeiro, ou aceito, e é expressa pelo erro. 
Observe que a exatidão mede a concordância entre um resultado e o valor aceito. 
A precisão, por outro lado, descreve a concordância entre os vários resultados obtidos medindo as réplicas da amostra.
A exatidão é com frequência mais difícil de ser determinada e é expressa em termos do erro absoluto ou erro relativo.
Avaliar a exatidão
Quanto mais próximo for o valor obtido do valor teórico, mais exato é considerado o método
A checagem da Exatidão (“Validação”) é feita pela análise de materiais certificados de referência (CRMs) ou materiais referencia padrão (descritos anteriormente).
Outros procedimentos sugeridos para avaliar a exatidão de um método analítico incluem:
- avaliação de amostras de concentração conhecida comparando o valor medido com um valor tido como verdadeiro;
- comparação dos resultados do novo método com os resultados de um método já validado;
- recuperação de uma concentração conhecida adicionada na amostra.
Determinação de nitrogênio em dois compostos puros
Os pontos mostram os erros absolutos de réplicas de resultados obtidos por quatro analistas. 
Observe que o analista 1 obteve precisão e exatidão relativamente elevadas. 
O analista 2 teve uma precisão baixa, mas uma exatidão boa. 
O analista 3 a precisão é excelente, mas existe um erro significativo na média numérica dos dados. 
Ambas, a precisão e a exatidão, são baixas nos resultados do analista 4.
Representação da precisão e exatidão
Avaliar a linearidade
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, dentro de uma determinada faixa de concentração
A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta medida e a concentração do analito, através da Curva de Calibração.
A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser determinado na amostra real.
Para isso, se faz o ajuste da reta por regressão linear.
A linearidade é dada pelo valor do Coeficiente de correlação linear (r): indica o quanto a reta se aproxima do modelo ideal r ³ 0,90
A qualidade da curva obtida é avaliada assim: quanto mais o (r) for próximo de 1, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.
A linearidade do gráfico quando é dada pelo coeficiente de correlação da reta obtida, e pode ser classificada em:
Avaliar a sensibilidade
A sensibilidade de um instrumento ou método é uma medida da sua capacidade de diferenciar pequenas variações na concentração do analito.
Dois fatores limitam a sensibilidade: a inclinação da curva de calibração (a) e a reprodutibilidade ou precisão do sistema de medição.
Para métodos de igual precisão, será mais sensível aquele que ter a maior inclinação da curva de calibração.
O método é mais sensível quando pequenas variações de concentração resultam em maior variação na resposta, ou seja, maior inclinação (valor de a).
Avaliar a seletividade
Parâmetro que indica o quanto o sinal analítico corresponde à espécie química de interesse, sem interferentes. 
Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito também pode depender da concentração
Como avaliar a seletividade?
1) Analisar um branco de reagentes, analisar o padrão, analisar a amostra com e sem o analito de interesse (placebo). 
Caso o placebo não seja disponível fazer acréscimo controlado de padrão sobre a amostra.
2) Avaliar a amostra na presença de interferentes, ou seja, introduzir elementos que provoquem “stress”;
Determinar o Limite de detecção
O limite de detecção (LD) é a menor concentração que pode ser distinguida com um certo nível de confiança. 
Toda técnica analítica tem um limite de detecção.
Fontes de erros
As medidas instrumentais e clássicas invariavelmente envolvem erros e incertezas.
Os erros são causados por padronizações ou calibrações malfeitas ou variações aleatórias e incertezas nos resultados.
Os erros envolvidos nas medidas são uma parte inerente do mundo quantitativo em que vivemos.
É quase que impossível realizar uma análise química que seja totalmente livre de erros ou incertezas. 
Apenas podemos desejar minimizar os erros e estimar sua grandeza com uma exatidão aceitável.
Fontes de erros na análise química
Amostragem 
Preparo de amostras
Preparo de reagentes
Material der eferencia certificado inapropriado (padrão)
Calibração do instrumento
Durante a leitura
Processamento de dados
Apresenraçãod os resultados
Interpretaçãod os resultados
Tipos de Erros
a) Erros determinados ou sistemáticos
b) Erros indeterminados ou aleatórios
Não possuem valor definido, não são mensuráveis e flutuam de um modo aleatório. 
Ex.: resultados de replicatas
Nesses casos, o valor mais provável é a média aritmética de todos os valores.
Erros determinados (sistemáticos) e indeterminados (incertezas) na análise química
Tipos de erros em análise química que afetam a precisão e extidão do método instrumental
O erro absoluto do resultado imediatamente à esquerda do valor verdadeiro de 20,00 ppm é de -0,22 ppm de Fe; 
Observe que mantemos o sinal quando expressamos o erro absoluto. 
O sinal negativo, no primeiro caso, mostra que o resultado experimental é menor que o valor aceito, enquanto o sinal positivo, no segundo caso, indica que o resultado experimental é maior que o valor aceito.
Erro Absoluto
O erro absoluto E. na medida de uma quantidade x, é dado pela equação:
 E= x1 – xn
O erro absoluto de uma medida é a diferença entre o valor medido e o valor verdadeiro.
O sinal de erro absoluto lhediz se o valor em questão é mais alto ou mais baixo.
Se o resultado da medida for menor, o sinal negativo; se for maior, o sinal é positivo.
Erro Relativo
O erro relativo de uma medida é o erro absoluto dividido pelo valor verdadeiro.
Erros relativos podem ser expressos em termos porcentuais, partes por mil ou partes por milhão, dependendo da magnitude do resultado.
Em geral, o erro relativo Er é uma quantidade mais útil que o erro absoluto. 
O erro relativo porcentual é dado pela expressão:
Erro grosseiro
Um terceiro tipo de erro sistemático é o erro grosseiro. 
Os erros grosseiros diferem dos erros indeterminado e determinado. 
Ocorrem, apenas de forma ocasional, resultado de erros humanos.
Por exemplo, se uma parte de um precipitado for perdida antes da pesagem, os resultados analíticos serão mais baixos. 
Tocar um pesa-filtro com os dedos quando sua massa vazia já foi determinada fará a leitura da massa de um sólido pesado no frasco contaminado ser mais alta. 
Os erros grosseiros levam à ocorrência de valores anômalos, resultados que diferem marcadamente de todos os outros dados de um conjunto de réplicas de medidas.
Os erros sistemáticos têm um valor definido e uma causa identificável e são da mesma ordem de grandeza para réplicas de medidas realizadas de maneira semelhante.
Existem três tipos de erros sistemáticos
Erros Instrumentais
Todos os dispositivos de medida são fontes potenciais de erros instrumentais sistemáticos. 
Por exemplo, pipetas, buretas e frascos volumétricos podem conter ou dispensar quantidades levemente diferentes daquelas indicadas em suas graduações.
Os erros podem surgir 
devido ao decréscimo da voltagem de uma bateria, em decorrência do seu tempo de uso. 
se os instrumentos não forem calibrados frequentemente, ou se forem calibrados incorretamente. 
se as variações de temperatura provocam alterações em inúmeros componentes eletrônicos, o que pode levar à ocorrência de modificações nas respostas e a erros. 
Em muitos casos, erros desse tipo são detectáveis e corrigíveis.
Erros de Método
O comportamento químico ou físico não ideal de reagentes e de reações nos quais uma análise está baseada, muitas vezes, introduz erros de método sistemáticos.
Essas fontes de não idealidade incluem a lentidão de algumas reações, a incompletude de outras, a instabilidade de algumas espécies, a falta de especificidade da maioria dos reagentes e a possível ocorrência de reações laterais que interferem no processo de medida. 
Por exemplo, um erro de método comum na análise volumétrica resulta do pequeno excesso de reagente necessário para provocar a mudança de cor do indicador que acusa o final da reação. 
A exatidão dessa análise é então limitada pelo próprio fenômeno que torna a titulação possível.
Erros Pessoais
Muitas medidas demandam julgamentos pessoais. 
Os exemplos incluem a estimativa da posição de um ponteiro entre duas divisões de uma escala, a cor de uma solução no ponto final de uma titulação ou o nível de um líquido em relação à escala graduada de uma pipeta ou bureta. 
Por exemplo, uma pessoa pode estimar a posição de um ponteiro de maneira consistentemente mais alta, outra pode ser ligeiramente lenta no disparo de um cronômetro e uma terceira pode ser menos sensível a mudanças de cor.
Um analista que é insensível a mudanças de cor tende a usar excesso de reagente em uma análise volumétrica. 
A maioria dos erros pessoais pode ser minimizada por meio de cuidado e disciplina. 
Um bom costume consiste em verificar sistematicamente as leituras de instrumentos, os registros no caderno de laboratório e os cálculos em geral. 
Os erros devido a limitações do analista podem ser evitados pela escolha cuidadosa do método analítico.
Viés numérico
Fonte universal de erros pessoais é o prejulgamento, ou tendência. 
A maior parte de nós, não importa quão honestos sejamos, tem a tendência de estimar leituras de escalas na direção da melhoria da precisão em um conjunto de resultados.
Podemos ter uma noção preconcebida do valor verdadeiro de uma medida. 
De forma inconsciente, fazemos que os resultados se mantenham próximos a esse valor.
O viés numérico é outra fonte de erros pessoais que varia consideravelmente de pessoa para pessoa. 
Também é comum o prejulgamento favorecendo números pequenos em relação aos maiores e os números pares, em relação aos ímpares.
Detecção dos erros sistemáticos instrumentais e pessoais
Alguns erros sistemáticos instrumentais podem ser determinados e corrigidos pela calibração.
CALIBRAÇÃO: 
Processo que relaciona o sinal analítico medido (leitura) com a concentração conhecida da substancia em uma solução padrão de referencia.
Calibrações frequentes, padronizações e análises de amostras conhecidas podem ser usadas, algumas vezes, para minimizar todos esses fatores, exceto os erros e as incertezas aleatórios. 
Análise de Amostras Padrão
A melhor maneira de estimar a tendência de um método analítico é pela análise de materiais de referência padrão, ou seja, materiais que contêm um ou mais analitos em níveis de concentração conhecidos. 
Quantidades cuidadosamente medidas dos componentes puros de um material são misturadas de forma que produza uma amostra homogênea cuja composição seja conhecida a partir das quantidades tomadas.
A composição global de um material padrão sintético precisa ser muito próxima da composição da amostra que será analisada. 
Os materiais de referência padrão podem ser adquiridos a partir de inúmeras fontes governamentais e industriais. 
Por exemplo, o Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia norte-americano, o NIST (antigo Bureau Nacional de Padrões) oferece mais de 1.300 materiais de referência padrão, incluindo rochas e minerais, misturas de gases, vidros, misturas de hidrocarbonetos, poeira urbana, água de chuva e sedimentos de rios.
Determinação do “Branco”
Sinal do instrumento para matriz na ausência do analito geralmente é água destilada ou o solvente utilizado em maior quantidade na amostra + reagentes que foram adicionados na amostra (indicadores, soluções extratoras, ácidos, álcalis, etc.).
O sinal analítico (leitura) deverá corresponder a ZERO.
Um branco contém os reagentes e solventes usados na determinação, mas não o analito. 
Em uma determinação em branco, todas as etapas da análise são desenvolvidas no material denominado branco. 
Os resultados são então aplicados na correção das medidas feitas com a amostra.
Determinações em branco revelam erros que ocorrem devido a interferentes presentes nos reagentes e frascos usados na análise. 
Calibração em análise instrumental
A calibração é uma operação comum na análise instrumental, onde se relacionam concentrações conhecidas da substância a ser determinada e os correspondentes sinais analíticos (leitura do instrumento).
Essas concentrações conhecidas devem ser fornecidas por SOLUÇÕES PADRÃO.
Curva analítica ou curva de calibração
PADRÃO OU SOLUÇÃO PADRÃO: 
Solução preparada em laboratório de concentração exatamente conhecida da substância que se quer analisar na amostra.
Contém todos os reagentes adicionados na amostra.
A forma mais usual de se executar a calibração de um instrumento é através da curva analítica (ou curva de calibração), 
Consiste em preparar padrões com concentrações conhecidas do analito e matriz (amostra menos o analito) o mais próximo da realidade da amostra em estudo. 
Na maioria das vezes, existirá uma relação linear entre concentração do analito e sinal de resposta do equipamento.
Preparação dos Padrões
Uma série de soluções-padrão da substância a analisar pode ser preparada de várias maneiras. 
Provavelmente a mais comum é por meio de várias diluições de uma solução padrão de reserva (solução estoque).
A série de padrões é então preparada por diluição de vários volumes da solução estoque a um volume menor, em balões volumétricos. 
Essas diluições exigem técnicas corretas de transferência, utilizando pipetas graduadas e calibradas para minimizar os errosindeterminados. 
Qual é a dimensão quantitativa da análise instrumental?
Pode ser em escala de macro, meso, micro e ultramicroanálise, dependendo da concentração detectável no instrumento ou técnica.
 Veja na figura ao lado a diferença entre essas escalas analíticas:
Tipos de calibração:
Calibração convencional ou com padrão externo:
Nesse tipo de calibração, prepara-se uma serie de soluções padrões (mínimo 5), cujo intervalo de concentração da substância inclui a concentração presente na amostra.
Construção da curva de calibração:
- Preparo de uma série de soluções-padrão (contêm a concentração conhecida do analito)
- Medida dos sinais dos padrões e do “branco” no equipamento (leitura do branco e dos padrões)
- Construção da Curva de Calibração eixo x = concentração dos padrões; eixo y = leitura dos padrões.
Curva de calibração
Podemos determinar a concentração de uma analito comparando a leitura (absorbância) de uma solução padrão (concentração conhecida) com a leitura de uma amostra cuja concentração se pretende determinar.
A questão é que podemos ter mais de um padrão analítico numa análise, no intuito de minimizar o erro analítico.
Podemos fazer a comparação de vários padrões com a amostra utilizando o artifício matemático chamado Método dos Mínimos Quadrados. 
Calibração com adição de padrão:
Nesse método, a amostra é “contaminada” com uma quantidade ou quantidades conhecidas de uma solução padrão contendo o analito.
No método das adições de padrão, uma quantidade conhecida da solução padrão contendo o analito é adicionada a uma porção da amostra. 
As respostas antes e depois da adição são medidas e posteriormente usadas para obter a concentração do analito.
Alternativamente, as múltiplas adições são feitas a diversas porções da amostra.
A adição de padrão considera uma resposta linear.
Isso deve ser sempre confirmado ou o método das adições múltiplas deve ser empregado para se verificar a linearidade.
Método do Padrão Interno
Um padrão interno é uma espécie de referência, química ou fisicamente similar ao analito, que é adicionada a amostras, padrões e brancos. 
A razão entre as respostas do analito e a do padrão interno é representada em um gráfico versus a concentração do analito.
No método do padrão interno, uma quantidade conhecida da espécie que atua como referência é adicionada a todas as amostras, padrões e brancos.
Então o sinal de resposta não é aquele do próprio analito, mas sim da razão entre o sinal do analito e o da espécie de referência.
É preparada, como de maneira usual, uma curva de calibração na qual o eixo y é a razão entre as respostas e o eixo x, a concentração do analito nos padrões. 
Ilustração do método do padrão interno.
Uma quantidade fixa da espécie contida no padrão interno é adicionada a amostras, padrões e brancos. 
Os gráficos da curva de calibração contêm a razão entre o sinal do analito e o do padrão interno contra a concentração do analito
Regressão linear
Regressão linear é um método estatístico para estimar a condicional (valor esperado) de uma variável y, dados os valores da variável x.
A regressão linear é assim chamada porque se considera que a relação da resposta às variáveis é uma função linear de alguns parâmetros. 
Os modelos de regressão que não são uma função linear dos parâmetros se chamam modelos de regressão não linear.
Para estimar o valor esperado:
Usa-se a equação de reta, que determina a relação entre as variáveis x e y:
					y = mx + b
onde y é a variável dependente (como absorbância, emissão etc.),
b é uma constante que representa a interceptação da reta com o eixo vertical (conhecida como coeficiente linear da reta), 
m é uma outra constante, que representa o declive da reta (também chamado de coeficiente linear da reta) e
 x é a variável explicativa (independente), que representa o fator explicativo na equação (como a concentração, por exemplo).
Gráfico de dispersão dos pontos
A leitura correspondente de cada solução é relacionada com a concentração da substancia no padrão através de um gráfico de dispersão (xy). 
Esse gráfico é ajustado pela regressão linear, e uma equação da reta é produzida (y = ax + b), que estabelece uma relação linear entre o sinal e a concentração.
Regressão linear no Excel® passo a passo
1º - Obtenção dos dados
Os dados abaixo representam os resultados encontrados numa análise do dinucleotídeo da nicotinamida adenina (NADH), uma coenzima fluorescente.
2º - Entrada dos dados no Excel®
Considerando os padrões em μmol L-1 e que a intensidade de fluorescência (medida instrumental) é proporcional à concentração, digite os dados em planilha Excel. 
Não se esqueça, porém, de usar ponto no lugar da vírgula, a não ser que seu software esteja configurado para tal).
3º - Gráfico
Selecione os dados de X (concentração) e Y (leitura instrumental)
e clique no ícone Assistente de gráfico
4º - Assistente de Gráfico
Selecione Dispersão (XY) e Subtipo de gráfico conforme indicado na figura abaixo e clique em Concluir.
Ao clicar em Concluir, aparecerá o gráfico abaixo.
5º - Adicionando a Equação de Reta
Clique com o botão direito do mouse em cima de um dos pontos no gráfico, depois selecione Adicionar linha de tendência.
Tipo de Tendência ou regressão
Selecione o tipo de tendência ou regressão que melhor descreve sua amostra. 
Se você estiver com dúvida quanto ao tipo de regressão que deve selecionar, é só observar o formato do seu gráfico (figura acima) e a imagem que descreve o tipo de regressão. 
No caso, trata-se de uma reta, pois os dados estão alinhados.
Assim, a regressão que melhor descreve este comportamento é a linear (regressão linear).
Exibir equação no gráfico e Exibir valor de R-quadrado no gráfico.
Após selecionar a Regressão Linear, clique no item Opções e selecione Exibir equação no gráfico e Exibir valor de R-quadrado no gráfico. 
Ao selecionar essas duas opções, serão apresentados no gráfico a equação de reta e o valor de R2, que indica a linearidade de seus dados.
No modelo de regressão linear, quanto mais próximo de um estiver o valor de R2, melhor é a correlação. 
Clique em OK para confirmar as opções e gerar as informações no gráfico.
Resultado do gráfico de regressão linear 
Nele, consta a relação entre a leitura de fluorescência (Y) e a concentração (X), além da equação de reta e o valor de R2.
6º - Formatação do gráfico
Apague a legenda, quando esta não for necessária. 
Para isso, clique com o botão direito do mouse sobre a legenda e selecione Limpar.
 
 
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 fill:#4472C4; 
}
.MsftOfcThm_Accent1_Stroke {
 stroke:#4472C4; 
}