Análise de açúcares redutores e dosagem de glicose

Prévia do material em texto

1. Introdução 
Os carboidratos são as moléculas mais abundantes da natureza, presentes na maioria 
dos alimentos e realizando funções energéticas e de reserva, estrutural e reguladora. São 
moléculas à base de carbono ricas em grupos hidroxila. Com efeito, a fórmula empírica de 
muitos carboidratos é (CH​2​O)​n​ – ou seja, são literalmente hidratos de carbono. 
Uma das formas de classificá-los é em relação ao grupo funcional que se encontra 
presente em sua cadeia. Caso o grupo funcional seja um aldeído, então pode-se classificar o 
carboidrato como uma aldose. Já em relação à presença de uma cetona, este então é 
classificado como uma cetose. O número de carbonos presentes na cadeia também é uma 
forma de classificação. Adota-se o sufixo “-ose” para todos eles e o prefixo é referente à 
quantidade de carbonos. O menor monossacarídeo possui três carbonos, ou seja, denomina-se 
“triose” e o maior possui seis carbonos, ou seja, é uma “hexose”. 
 
Figura 1 – Monossacarídeos representativos: duas trioses: uma aldose e uma cetose. 
 
Fonte: Lehninger, 2014 
 
Em relação ao tamanho, os carboidratos podem ser classificados em três classes: 
monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos. Os monossacarídeos, açúcares mais 
simples, são aldeídos ou cetonas que possuem um ou mais grupos hidroxila na molécula. Os 
átomos de carbono nos quais as hidroxilas estão ligadas são geralmente centros quirais e estes 
originam os numerosos açúcares estereoisômeros encontrados na natureza. Com exceção da 
diidroxiacetona, todos os monossacarídeos contêm um ou mais átomos de carbono 
assimétrico, e assim ocorrem em formas isoméricas opticamente ativas. O número de 
estereoisômeros de um monossacarídeo qualquer é dado pela fórmula 2​n​, onde “n” é 
relacionado à quantidade de carbonos quirais presentes na molécula. 
Para cada um dos comprimentos de cadeia carbônica, os estereoisômeros dos 
monossacarídeos podem ser divididos em dois grupos, os quais diferem quanto à 
configuração do centro quiral mais distante do carbono do carbonil, ou seja, quando o grupo 
hidroxila do carbono de referência está à direita ​(dextro​) em uma fórmula de projeção que 
apresenta o carbono do carbonil no topo, o açúcar é o isômero D; quando está à esquerda 
(​levo​), é o isômero L. Açúcares que somente se diferem na configuração ao redor de um 
único átomo de carbono são chamados de epímeros, como é o caso da D-glicose e a 
D-manose e também da D-glicose com a D-galactose. 
 
Figura 2 - Epímeros. D-Glicose e dois de seus epímeros são mostrados como fórmulas de projeção. Cada 
epímero difere da D-glicose na configuração de um centro quiral. 
 
 
Fonte: Lehninger, 2014 
 
Apesar de se usar a representação linear de aldotetroses e de monossacarídeos com 
cinco ou mais átomos de carbono, em soluções aquosas estes ocorrem predominantemente 
como estruturas cíclicas, ocasionadas por uma ligação covalente entre o grupo carbonila com 
um oxigênio de um grupo hidroxila ao longo da cadeia, formando derivados chamados 
hemiacetais. No processo de ciclização dos monossacarídeos, o carbono 1 torna-se quiral – 
carbono anomérico -, e estas estruturas podem assumir configuração do tipo furanose, que 
consiste na reação entre o grupo carbonila com o grupo hidroxila presente no carbono 4, ou 
do tipo piranose, onde o grupo carbonila reage com o grupo hidroxila presente no carbono 5. 
A hidroxila presente no derivado hemiacetal é chamada de hidroxila anomérica e essa pode 
ser classificada quanto sua posição, servindo, então, como identificação para os isômeros. 
Quando a hidroxila estiver voltada para baixo do plano da molécula, está será o isômero-α, e 
quando a hidroxila estiver voltada para cima do plano, este será o isômero-β. 
Outra característica dos monossacarídeos é o poder redutor que eles possuem. Os 
açúcares com essa propriedade têm seu grupamento carbonila oxidado a ácido carboxílico na 
presença de íons férrico (Fe​3+​) e cúprico (Cu​2+​). Tal propriedade é muito importante para a 
análise de açúcares, pois através da medida de agente oxidado pela solução de açúcar é 
possível se estimar a concentração de açúcar no meio. Um dos métodos de determinação de 
glicose em amostras líquidas mais utilizados no mundo é o do ácido di-nitro salicílico (DNS). 
O método do DNS é baseado na dosagem de açúcares redutores, onde ocorre a 
oxidação do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ácido dinitrosalicílico; sal 
de Rochelle, (solução de tártaro de sódio de potássio) que serve para prevenir o reagente da 
ação do oxigênio dissolvido; fenol, que é utilizado para aumentar a quantidade de cor 
produzida; bissulfito, que é um estabilizante da cor obtida na presença do fenol; hidróxido de 
sódio, que é o redutor da ação da glicose sobre o ácido dinitro-salicílico. Nesse método 
ocorre a seguinte reação de oxidação: a redução do ácido 3,5-di-nitrosalicilico (de cor 
amarelo forte) e a oxidação do monossacarídeo, formando o 3-amino-5nitro-salicilato (de cor 
laranja-marrom forte), na proporção estequiométrica. Portanto, pela determinação da luz 
absorvida a 540nm pelo 3-amino-5nitrosalicilato, pode-se determinar a concentração de 
açúcar redutor presente na solução. 
Um outro método que serve como forma de analisar a presença ou não de açúcares 
redutores é através da utilização do azul de metileno. Esse reagente possui uma coloração- 
como o próprio nome já diz- bastante azulada, e na presença de um açúcar que o faça reduzir, 
é formado um enediol. Geralmente, na presença de um açúcar com essa propriedade, a 
coloração da solução se torna incolor, ou seja, o azul de metileno ali presente foi reduzido. 
Os dissacarídeos são constituídos por duas moléculas de monossacarídeos unidas 
covalentemente entre si por uma ligação glicosídica. Essa ligação é formada quando o grupo 
hidroxila de uma molécula de açúcar reage com o átomo de carbono anomérico de outra 
molécula de açúcar. Essa reação forma um acetal a partir de um hemiacetal e um álcool e 
libera água no seu processo. Quando um carbono anomérico participa de uma ligação 
glicosídica, este não pode mais ser oxidado por um íon cúprico ou férrico; portanto, esse 
açúcar não pode mais existir na forma linear e seu poder redutor é perdido. 
Um dissacarídeo que exemplifica a ausência de poder redutor é a sacarose. Esta 
molécula é um dissacarídeo formado pela junção glicosídica ​de uma α-D-glicose e uma de 
β-D-frutose​. No entanto, a ligação formada entre essas duas moléculas é do tipo α (1→2), o 
que caracteriza uma ligação entre hidroxilas anoméricas. Como os grupamentos estão de certa 
forma travados nessa ligação, a sacarose não é capaz de agir como agente redutora. Esse fato 
não ocorre com a maltose e com a lactose, por exemplo; a maltose, formada por ​duas 
moléculas de α-D-glicose ligadas por uma ligação glicosídica α (1​→​4)​, e a lactose, formada 
por uma molécula de β-D-galactose e uma α-D-glicose através de uma ligação β (1→​4) 
atuam como agente redutoras por manterem, mesmo realizando uma ligação glicosídica,uma 
hidroxila anomérica livre. 
 
 Figura 3 - Dissacarídeos comuns. Estruturas representativas da sacarose, lactose e maltose. 
 
Fonte: Stryer, 2014. 
 
Quando mais de dez unidades de monossacarídeos se ligam entre si, são formadas 
grandes moléculas denominadas polissacarídeos. Essas moléculas podem ser formadas por 
apenas um tipo de monossacarídeo, denominadas homopolissacarídeos, ou podem ser 
formadas pela junção de vários monossacarídeos diferentes, os heteropolissacarídeos; além 
disso, podem assumir forma linear ou ramificada. Exemplos de polissacarídeos de glicose 
seriam a celulose, formada por ligações do tipo β (1→​4) , o amido, formado por amilose - 
ligações ​α (1​→​4) - e amilopectina - ligações α (1​→ ​6), e também o glicogênio, que possui em 
sua estrutura ligações do tipo α (1 ​→​4) e α (1​→​6). Destes, apenas a celulose não é absorvida 
pelo organismo devido à falta da enzima celulase, capaz de quebrar as ligações ​β (1→​4) 
presentes na estrutura. 
 
2. Objetivos 
Calcular a concentração de uma solução de glicose desconhecida através do método 
DNS e observar a atuação de açúcares redutores em soluções na presença de solução 
alcoólica de azul de metileno. 
 
3. Material e métodos 
3.1. Material 
- Solução padrão de glicose 10 mM; 
- Solução de DNS (DNS 1% p/v, Tartarato duplo Na/K 30% p/v em NaOH 0,4 
mol/L); 
- Solução de glicose com concentração desconhecida; 
- Solução de NaOH 2% p/v 
- Solução de sacarose 1% p/v 
- Solução de glicose 1% p/v 
- Solução alcoólica de azul de metileno 0,1% p/v 
- Água destilada; 
- Banho-maria (100°C); 
- Leitor de ELISA; 
- 7 tubos de ensaio grandes 
- 4 pipetas de 2 mL; 
- 4 pipetas de 5 mL 
- 1 pipeta de 10 mL; 
- 1 pipeta pasteur com 1 pêra pequena; 
- Pró-pipetes; 
- 3 beckers; 
- Placa de 96 poços; 
- Pedaços de parafilm; 
 
3.2. Métodos 
3.2.1. Dosagem de glicose 
Com o auxílio de pipetas e pró-pipetes, foram transferidas alíquotas das 
soluções reagentes para os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela 
abaixo: 
Tabela 1 - tubos e suas respectivas alíquotas para cada solução 
Tubo 
 n° 
Água 
destilada 
(mL) 
Sol. padrão 
de glicose 10 
mM (mL) 
Sol. de glicose 
[?] 
desconhecida 
(mL) 
Sol. 
DNS 
(mL) 
B 1,0 - - 1,0 
1 0,8 0,2 - 1,0 
2 0,6 0,4 - 1,0 
3 0,4 0,6 - 1,0 
4 0,2 0,8 - 1,0 
5 - - - 1,0 
6 - - 1,0 1,0 
Fonte: Protocolo da prática de análise qualitativa e quantitativa de açúcares. 
 
Assim que cada solução foi devidamente transferida para seus respectivos 
tubos, estes foram homogeneizados e transferidos para o banho-maria à temperatura 
de 100° C e lá permaneceram pelo tempo de 5 minutos. 
Após isso, os tubos foram trazidos novamente para a bancada, e após o 
resfriamento dos tubos, foram adicionados 10 mL de água destilada a cada um. Uma 
vez que a água foi transferida, foram utilizados pedaços de parafilm a fim de vedar os 
tubos e realizar uma nova homogeneização. Em seguida, os conteúdos dos tubos 
foram transferidos para uma placa de 96 poços e esta foi levada ao leitor de ELISA. 
Neste aparelho foi realizada a leitura da absorbância a 540 nm de cada um dos tubos, 
utilizando o tubo branco (B) como referência de calibração. 
 
3.2.2. Análise de açúcares redutores 
Com o auxílio de pipetas e pró-pipetes, foram transferidas alíquotas das 
soluções reagentes para os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela 
abaixo: 
Tabela 2 - tubos e suas respectivas alíquotas para cada solução 
Tubo 
n° 
Sol. NaOH 
1% p/v 
(mL) 
Sol. de 
glicose 1% 
p/v (mL) 
Sol. de 
sacarose 
1% p/v 
(mL) 
Água 
destilada 
(mL) 
Sol. de azul 
de 
metileno 
(gota) 
1 3,0 3,0 - - 1 
2 3,0 - 3,0 - 1 
3 - 3,0 - 3,0 1 
4 3,0 - - 3,0 1 
Fonte: Protocolo da prática de análise qualitativa e quantitativa de açúcares. 
 
Assim que cada solução foi devidamente transferida para seus respectivos 
tubos, estes foram homogeneizados com o auxílio de pedaços de parafilm e incubados 
em temperatura ambiente a fim de se analisar os resultados obtidos. 
 
 
 
4. Resultados 
4.1. Dosagem de glicose 
Após o procedimento, a solução em cada tubo possuía o seguinte aspecto: 
 
Foto 1 - Tubo branco e soluções com concentrações crescentes de glicose. Da esquerda para a direita, tubos 1 a 
5 respectivamente e solução desconhecida de glicose no tubo 6. 
 
Fonte: Elaborada pelo autor. 
A tabela abaixo indica a concentração final referente a cada tubo e seus respectivos 
valores de absorbância registrados no espectrofotômetro e devidamente corrigidos. A 
concentração de cada solução foi calculada para um volume de 12,0mL (volume final de 
todas as soluções preparadas): 
 
Tabela 3: Concentrações e absorbância das soluções de glicose. 
Tubo Concentração (mM) Absorbância (540nm) 
1 0,167 0,076 
2 0,333 0,21 
3 0,500 0,338 
4 0,667 0,459 
5 0,833 0,601 
6 ? 0,213 
Fonte: Elaborado pelo autor. 
 
Para determinar os valores da concentração final dos tubos 1 a 5 foi aplicada a 
fórmula ​10.V1 = C2.12​ onde: 
10 = concentração inicial de 10mM; 
V1 = volume inicial de cada solução (presentes na Tabela 1); 
C2 = concentração final a ser descoberta em mM; 
12 = volume final em mL. 
 
Em seguida, o valor de absorbância do tubo branco foi subtraído dos valores de 
absorbância aferidos de cada tubo e assim, organizando esses resultados com as 
concentrações finais determinadas, a tabela pôde ser gerada. 
A partir destes resultados, gerou-se a seguinte curva padrão onde o eixo X representa 
as concentrações da solução de glicose em cada tubo (em mM) e o eixo Y, as respectivas 
absorbâncias em 540nm: 
 
 
Gráfico 1: Curva padrão das concentrações das soluções de glicose em relação à absorbância 
 
Fonte: Elaborado pelo autor 
 
O cálculo do R² foi mostrado no mesmo para que se informe o quanto o modelo 
(gráfico) se adequa a amostra (experimento). Um valor de 0,9995 indica que o modelo 
consegue explicar a amostra em 99,95%. 
Para determinar o valor da concentração da solução desconhecida de glicose, foram 
feitos os seguintes cálculos: 
1. Do gráfico, extraiu-se a equação da reta ​y = 0,7794x - 0,0529; 
2. O valor de y foi substituído pela absorbância do tubo 6 gerando a seguinte 
expressão: ​0,213 = 0,7794x - 0,0529, onde o valor de X refere-se à 
concentração desconhecida da solução em um volume de 12mL; 
3. Calculada a expressão, têm-se que ​x = 0,341mM​. 
Descoberto o valor da concentração em 12mL, há a necessidade de correção do 
mesmo para um volume de 1mL, pois este foi o volume inicial da solução antes da adição do 
DNS: 
C1 x V1 = C2 x V2 
C2 x 1,0 = 0,341 x 12,0 
C1 = 4,092 mM 
 
De acordo com os resultados obtidos e considerando margens de erro têm-se que a 
concentração da solução desconhecida de glicose é de aproximadamente 4,092mM. 
 
4.2. Análise de açúcares redutores 
Após preparar as soluções e deixá-las incubando à temperatura ambiente, observou-se 
o seguinte resultado: 
 
Foto 2: Aspecto final das soluções 1 a 4 após incubação à temperatura ambiente. 
 
Fonte: Elaborada pelo autor 
 
A solução do tubo 1, contendo NaOH e glicose, tornou-se incolor com uma pequena 
região azul onde a solução está em contatocom o ar. 
A solução do tubo 2, contendo NaOH e sacarose apresentou uma coloração azul muito 
escura. 
A solução do tubo 3, contendo glicose e água apresentou a coloração azul mais clara 
dentre todas as soluções. 
A solução do tubo 4, contendo NaOH e água apresentou uma coloração azul 
levemente mais escura que a anterior. 
 
5. Discussão 
5.1. Dosagem de glicose 
Esse método baseia-se no poder redutor de alguns carboidratos, neste caso, da glicose. 
Para que um açúcar seja capaz de se reduzir, é necessário que o mesmo esteja em sua forma 
linear (que mantém um equilíbrio com a forma cíclica). Essa alteração entre as duas formas 
só é possível quando o carbono anomérico não está envolvido em uma ligação glicosídica e, 
quando uma aldose é oxidada é produzido ácido aldônico. 
Em uma solução de glicose com DNS, o último se reduz para que o primeiro possa se 
oxidar. Nessa reação, o ácido 3,5-dinitro salicílico (de coloração amarelada) é reduzido em 
ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de coloração alaranjada) conforme a reação abaixo: 
 
 
Figura 4: Redução do ácido aldônico com um açúcar redutor genérico. 
 
Fonte: NASCIMENTO, 2003, p. 2. 
 
Como a reação ocorreu em meio a uma solução com glicose, o ácido formado pela 
oxidação da mesma será um ácido glicônico. 
É possível observar que à medida que a concentração da solução de glicose aumenta 
em cada tubo (nesse caso, entre os tubos 1 e 5), a cor da solução se torna mais alaranjada, isso 
acontece pois haverá uma maior formação de ácido 3-amino-5-nitrosalicílico. 
A solução do tubo 6, por possuir um valor de concentração um pouco maior que a 
solução 2 mas consideravelmente menor que a solução 3, obteve uma coloração levemente 
mais alaranjada que a solução 2. 
A partir desse método, uma solução normal de sacarose não poderia ser dosada, pois 
como seus monômeros de glicose e frutose formam a ligação glicosídica por seus carbonos 
anoméricos, não haverá nenhum livre para conferir um potencial redutor ao carboidrato. 
Porém, é possível dosar soluções de sacarose através desse método se uma hidrólise da 
ligação glicosídica do dissacarídeo ocorrer, esse procedimento pode ser feito com um ácido 
forte ou com o uso de enzimas, como a invertase, no caso da sacarose. 
 
5.2. Análise de açúcares redutores 
Açúcares redutores são aqueles que possuem um carbono anomérico livre e em 
soluções alcalinas são capazes de reduzir sais de cobre e prata. Esse mecanismo de óxido 
redução está associado à formação de um enediol (onde duas hidroxilas se ligam a uma dupla 
ligação entre carbonos), uma função altamente redutora e que interconverte aldoses e cetoses. 
No caso da glicose utilizada neste experimento, em meio alcalino, se transforma rapidamente 
em enediol levando à formação de frutose e manose. 
 
 
Figura 5: Formação de enediol a partir da glicose formando uma frutose. 
 
Fonte: ​https://www.slideshare.net/vidhuvishwa/chemistry-of-carbohydrate-for-first-year-students 
 
No tubo 1, contendo glicose e NaOH ocorre alta formação de enediol, reduzindo o 
azul de metileno de cor azulada e o transformando em azul de leucometileno, que é incolor. A 
região da solução em contato com o ar possui coloração azul pois o oxigênio presente no 
mesmo a oxida, deixando-a azulada. Quando agitada, esse mesmo oxigênio se mistura à 
solução tornando-a novamente azulada, porém, após poucos minutos, ela volta a ser incolor. 
 
Figura 6: Redução do azul de metileno formando azul de leucometileno. 
 
Fonte: Santos e Mól, 2013 
 
No tubo 2 a solução permanece intensamente azulada após a adição do azul de metileno. Isso 
ocorre pois a sacarose não possui um carbono anomérico livre pois ambos os carbonos 
anoméricos da glicose e da frutose fazem parte da ligação glicosídica, e, portanto, não possui 
poder redutor. Por isso, mesmo com a presença de NaOH alcalinizando o meio, não ocorre 
formação de enediol e o azul de metileno não é reduzido, mantendo a sua cor azul forte. 
No tubo 3, mesmo contendo glicose não ocorrerá formação considerável de enediol, 
pois não foi adicionado NaOH para conferir uma basicidade à solução. Porém, a solução 
apresenta-se com uma coloração azulada mais clara pois a glicose possui um potencial de 
redução próprio, que, mesmo sendo inferior ao do enediol é capaz de reduzir um pouco do 
azul de metileno. 
A solução no tubo 4 foi feita apenas com NaOH e água, sem qualquer carboidrato, 
para que seu resultado pudesse ser comparado com a solução do tubo 3 e pudesse ser 
percebido o potencial de redução da própria glicose, mencionado anteriormente. É devido a 
isso que a coloração do tubo 3 se apresenta ligeiramente mais clara que a coloração do tubo 4. 
 
6. Referências bibliográficas 
1. NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de Bioquímica de 
Lehninger. São Paulo: ARTMED EDITORA LTDA, 2014. 
2. MORAES, Guilherme. ​Comparação de Métodos para Determinação de 
Açúcares Redutores e Não-Redutores. ​Porto Alegre, julho de 16. 
3. TORQUATO, José. ​ et al.​ ​Interferência do ácido ascórbico na determinação 
de açúcares redutores pelo método de Lane e Eynon. ​Quím. Nova vol.33 no.4 
São Paulo 2010. 
4. https://www.slideshare.net/vidhuvishwa/chemistry-of-carbohydrate-for-first-y
ear-students 
5. MOTTIN, Ivo.​ et al. ​Determinação de Açúcares Redutores e Totais em 
Alimentos. Comparação Entre Método Colorimétrico e Titulométrico. 
PUBLICATIO UEPG - Ciências Exatas e da Terra, C. Agrárias e Engenharias, 
8 (1): 65 - 78, 2002. 
6. https://pt.slideshare.net/ravikiran35977897/chemistry-of-carbohydrates 
7. https://educador.brasilescola.uol.com.br/estrategias-ensino/experimento-garraf
a-azul.htm 
8. COSTA, Antonio. ​et al. ​Educação Ambiental Através dos Conceitos de 
Equilíbrio Químico no 2º Ano do Ensino Médio de Uma Escola Pública na 
Cidade de Campina. ​ENID UEPB. V. 1, 2017. 
9. BERG, Jeremy M.; STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L. Bioquímica. 7. 
ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014