PRÁTICA 08 MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE SEMEADURA PRÁTICA 09- DILUIÇÃO SERIADA E CONTAGEM DE MICRORGANISMOSbriel Castamann, Juan Lucca, Matheus Labigaline e Vinicius Dekkers

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE TOLEDO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS – CECEENGENHARIA QUÍMICA
PRÁTICA 08 – MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE SEMEADURA
PRÁTICA 09- DILUIÇÃO SERIADA E CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
Junho, 2019
Toledo - PR
GABRIEL CASTAMANN
JUAN LUCCA DE SIQUEIRA REIS
MATHEUS FELLIPE LABIGALINE SANTOS
VINICIUS DEKKERS CARNEIRO
PRÁTICA 08 – MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE SEMEADURA
PRÁTICA 09- DILUIÇÃO SERIADA E CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
	
Relatório de aula prática apresentado à disciplina de Microbiologia Industrial, para obtenção de nota parcial do curso de graduação em Engenharia Química -Universidade Estadual do Oeste do Paraná - UNIOESTE, sob a supervisão da ProfessoraDra. Jacqueline FerandinHonorio.
Junho, 2019
Toledo – PR
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Meios de cultura e técnicas de semeadura
Com o intuído de se estudar ou realizar a identificação de um determinado microorganismo se faz necessário isolá-lo em um composto com características que se apresentam adequadas para o desenvolvimento do mesmo. Tendo isso em vista, os meios de cultura apresentam de nutrientes preparados em laboratório para que se possa ocorrer o crescimento desses microorganismos e sua manutenção in vitro, esses meios de cultura podem ser preparados em placas ou tubos. Apresentados em estados sólidos, semi-sólidos ou liquido.
Assim, o crescimento de microorganismos apresentam crescimento em algum meio de cultura, denomina-se que a formação de um meio de cultura. Para isso ocorrer necessita-se realizar sua transferência para esse meio objetivando-se o estudo do seu crescimento, sendo essa transferência denominada de inoculação. A inoculação pode ser realizada por diferentes técnicas de semeadura, variando-se de acordo com o meio de cultura e associadas com as técnicas assépticas. 
Dentre os meios de cultura podemos citar os meios de enriquecimento, os diferencias e os seletivos. Os meios de enriquecimento geralmente são meios líquidos, com uma composição química contendo uma carga rica de nutrientes, buscando permitir que as bactérias contidas em uma amostra cresçam com facilidade, como exemplo de meio de enriquecimento temos o Caldo Lactosado. Dentre os meios de enriquecimento temos o seletivo que favorece a multiplicação de microorganismos específicos, inibindo parcialmente ou totalmente o crescimento de outros, para esse meio tem-se o exemplo o Caldo Tetrationato. E também tem-se o não seletivo, que apresenta o favorecimento do crescimento da maioria dos microorganismos, tendo como exemplo o Caldo de Infusão de Cérebro e Coração. 
Já o meio seletivo apresenta a finalidade de selecionar as espécies que se deseja isolar e com isso inibir-se o crescimento de outros microorganismos. Isso se da com adição de corantes, antibióticos e outras substâncias com características inibitória, como exemplo podemos citar o Agar Manitol Salgado, o Agar SS e o Ágar MacConkey que inibe o crescimento de bactérias gram-positivas, selecionando assim as bactérias gram-negativas.
E os meios diferenciais são usados para que se possa realizar a diferenciação de microorganismos ou grupos dos mesmo em um meio. A presença de determinados corantes ou demais produtos quimos geral alterações características ou certos padrões de crescimento que são usados para se identificar ou diferencias os microorganismos. O Ágar MacConkey é frequentemente utilizado para diferenciar vários bacilos gram-negativos isolados de amostras de fezes.
Os diferentes tipos de meios não são exclusivos, pois vimos que o ágar MacConkey pode ser empregado tanto em meios seletivos como em meios diferenciais.
Analisando esses meios, quando se tem um material muito contaminado, é possível aplicar meios seletivos ou de enriquecimento para isolar um determinado microrganismo, eliminando aqueles que não são de interesse. Caso este material contenha pouca carga do microrganismo de importância, um meio de enriquecimento é ainda mais adequado uma vez que ampliará a carga até níveis detectáveis
Para se realizar essas analises necessitam-se que se realize o isolamento das diferentes culturas, para se realizar o estudo de uma cultura pura. Com isso, aplica-se técnicas de semeadura, dentre elas a mais empregada é a técnica por esgotamento por meio de estrias, por meio de uma alça de inoculação estéril mergulhada na amostra a ser analisada e transferida para o meio de cultura por meio de estrias apresentadas na figura 01. 
Figura 01- Método de inoculação por esgotamento de estrias 
Porem tense um adendo nessa técnica, onde que as estrias não devem se cruzar, pois o objetivo é realizar a redução da carga microbiana conforme se contamina novas regiões da placa. Deste modo, busca-se gerar colônias isoladas. Podendo-se realizar esse processo com a esterilização da alça por meio de técnicas de assepsia no processo de semeadura dos meios. Ao se buscar a formação de colônias isoladas, a técnica de assepsia mais utilizada é por meio do aquecimento da alça com o calor seco da chama gerada pelo Bico de Busen. Para se obter somente o inoculo do microorganismo desejado devem ser aplicas com precisão as técnicas de assepsia, como a citada anteriormente à assepsia por meio do Bico de Busen, buscando a esterilização de equipamentos de inoculação, deve-se cuidar com a assepsia correta das mãos e dos demais instrumentos utilizados, bem como a realização da inoculação dentro da área de segurança. 
 Sabe-se que alguns microorganismos tem a característica de se proliferarem em qualquer meio, enquanto a outros que se requerem de condições especiais. O crescimento microbiano apresenta a necessidade de presença de energia, presença de carbono no ambiente, nitrogênio e ate mesmo de enxofre e fósforo, e demais compostos que não são sintetizados por eles. Com isso, a composição do exata do meio se é conhecida, bom como as quantidades, sendo esse um meio quimicamente definido. Estes são geralmente utilizados em ensaios microbiológicos e no crescimento de quimioautotróficos e fotoautotróficos. Quando se tem meios sem a composição conhecida, o meio se classifica como complexo. Para esses meios são utilizados compostos de extratos de leveduras, carnes ou plantas presentes no desenvolvimento de seres quimio-heterotróficos. 
Com esses meios e os citados anteriormente observa-se uma grande variedade de meios de cultura para diferentes objetivos e microorganismos de interesse. Pois cada microorganismo apresenta uma necessidade específica para apresentar condição de crescimento, tanto ambientais como de nutrientes, um exemplo de condições de ambiente são o pH, nível de oxigênio e a temperatura. Porém, um mesmo componente pode apresentar inúmeras espécies de microorganismos, que apresentam condições variadas para seu desenvolvimento, neste sentido, busca-se realizar para a correta identificação a inoculação destes em diferentes meios de cultura para que se possa identificar e caracterizar-se o crescimento em cada uma das condições apresentadas, para assim poder realizar sua classificação correta. 
A culturas de microorganismos que sofrem armazenamento por técnicas de resfriamento como a de congelamento e a liofilização, para serem recuperadas sofrem uma hidratação quando estão presentes em meios de culturas altamente nutritivos que favoreça seu crescimento, sendo este meio utilizado no estado líquido, sendo assim, não deve apresentar a presença de Agar em sua composição. Esse meio caracterizado como um caldo, sendo aplicados em outras situações como provas bioquímicas. 
A recuperação em meio líquido dura cerca de 2 horas, enquanto em um meio sólido adequado dura de 4 a 6 horas.
Para se analisar e verificar a legalidade da presença de certos microorganismos em alimentos deve-se consultar a Portaria n° 326, de 30 de julho de 1997 do ministério da Saúde e a Resolução-RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001, que define critérios e padrões microbiológicos para alimentos, indispensáveispara a avaliação das Boas Práticas de Produção de Alimentos e Prestação de Serviços, da aplicação do Sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC/HACCP) e da qualidade microbiológica dos produtos alimentícios, incluindo a elucidação de Doença Transmitida por Alimentos(DTA). Onde se delimita quantidades aceitáveis de microorganismos em uma certa quantidade de amostra sendo essa amostra colhida de modo aleatório. Sendo alguns desses limites apresentados na tabela 01. 
	Tabela 01- Microorganismos e sua tolerância
	Grupo de alimentos
	Microorganismos
	Tolerância Para amostra indicativa
	Frutas e seus derivados
	Coliformes a 45ºC/g
	2x10-3
	
	Salmonella SP/25g
	Não dever conter
	
	Bolores e leveduras/g
	10-4
	Carnes e Produtos Cárneos
	Salmonella SP/25g
	Não deve conter
	
	Coliformes a 45°C/g
	10-4 a 10-2
	
	Estaf.coag.positiva/g
	5x10-3 a 5x10-1
	Leite de bovinos e outros mamíferos
	Coliformes a 45°C/g
	5x10-3 a 5x10-2
	
	Salmonella SP/25ml
	Não deve conter
	
	Estaf.coag.positiva./g
	10-3 a 5x10-2
	
	L.monocytogenes/25g
	Não deve conter
MÉTODOS
Meios de cultura e técnicas de semeadura
Para essa parte da pratica usou-se a alça para realizar a inoculação dos microorganismos, o bico de Busen para se realizar a assepsia da mesma e para delimitar a zona de segurança, tubos com ágar para se realizar analise de colônias em tubos e placas Petri com diferentes meios de cultura. 
Realização de cultura em caldo nutriente
 Essa primeira parte realizou-se a cultura bacteriana de E. coli em caldo nutriente, fazendo-se a inoculação da bactéria por meio de difusão em tubos que continha o caldo. Após isso se usou essa mesma cultura, e inoculou-se com o auxilio da alça em tubos que continham ágar inclinado, realizando-se o procedimento da técnica de esgotamento por estrias e a técnica de estria reta. Após as inoculações foram tiradas fotografias de ambos os tubos para posteriores comparações. A mesma cultura foi inoculada pela técnica de esgotamento em estrias em placa de Petri contendo ágar nutriente. Os tubos foram incubados em estufa por 48 horas a 37°C.
Plaqueamentto seletivo ou diferencial
 Nesta parte, usou-se uma cultura mista, que continha vários microorganismos como E. coli, Salmonella sp., Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Staphylococcus aureus. Sendo essa cultura inoculada em diferentes meios, entre eles Plate Count Ágar (PCA), meio de Ágar McConkey, meio de Ágar Manitol sal, meio Ágar Rappaport e maio Ágar Patotato-dextrose (PDA) acidificado. Para a inoculação desses meios de cultura usou-se o método de esgotamento por estrias. 
RESULTADOS E DISCUSSÕES
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Quais são os tipos de meio de cultura?. Disponível em: https://www.prolab.com.br/blog/equipamentos-aplicacoes/quais-sao-os-tipos-de-meios-de-cultura/. Acessado em 29 de maio de 2019.
TORTORA, G.J; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 10° ed. Porto Alegre, Artmed, 2012.
Técnicas de semeaduras. Disponível em: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/09/tecnicas-de-semeadura.html. Acessado em 29 de maio de 2019.
Boas práticas da OMS para laboratórios de microbiologia farmacêutica. Disponível em: https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2013/Red-PARF-No11-Port.pdf. Acessado em 29 de maio de 2019.
Meios de Cultura – Como diferenciar meio enriquecido, seletivo e diferencial. Disponível em: https://kasvi.com.br/meios-de-cultura-diferenca/. Acessado em 29 de maio de 2019.
RESOLUÇÃO-RDC Nº 12, DE 02 DE JANEIRO DE 2001. Disponível em :http://portal.anvisa.gov.br/documents/33880/2568070/RDC_12_2001.pdf/15ffddf6-3767-4527-bfac-740a0400829b. Acessado em 29 de maio de 2019.
Portaria n° 326. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/svs1/1997/prt0326_30_07_1997.html. Acessado em 29 de maio de 2019.