AULA 4_ VIRBIOMED_Diagnóstico e Cultivo Celular_2017

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Estácio do Amazonas 30/10/2017
Virologia - Profa Tatiana Pires, MSc. 1
Diagnóstico Laboratorial 
de Viroses
Profa MSc. Tatiana Pires
2017
Estácio do Amazonas
Curso de Biomedicina
Virologia
Diagnóstico em Virologia
• Auxílio no diagnóstico clínico: determinação do agente 
causal em casos de diarreia, infecções respiratórias 
etc.
• Vigilância epidemiológica: dengue  diagnóstico 
clínico de um caso suspeito pode ser confirmado em 
laboratório
• Iniciar tratamento específico  Herpesvirus, HCV, HIV 
etc.
• Triagem de sangues e órgãos  HBV, HIV, HCV
2Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Diagnóstico em Virologia
• Isolamento e Identificação Viral
• Sistemas vivos nos quais os vírus são propagados
• Culturas de células – os mais utilizados
• Observa-se as alterações na aparência das células infectadas
• Sorologia
• Detecção de Ac específicos
• Alterações nos níveis de Acs
• Status imunológico do indivíduo
• Detecção direta do vírus, Ags e genomas 
virais
• M.e, imunoeletromicroscopia, métodos imunoenzimáticos, 
aglutinação, imunofluorescência, imunocitoquímica, Wblot, Sblot, 
híbridização de ácidos nucleicos, PCR etc.
3Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Diagnóstico em Virologia
• Infecção tem etiologia viral?
• Comprovar-se laboratorialmente a presença direta ou indireta 
do vírus no paciente infectado
• Portanto...
• Isolamento e identificação no vírus no espécime
• Detecção de Ac específicos
• Poucas as técnicas tem tanta sensibilidade quanto a do 
isolamento viral  Gold Standard *
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MSc.
Diagnóstico em Virologia
Diagnóstico clínico Diagnóstico laboratorial
Pesquisa do vírion
Pesquisa de Ag
Pesquisa de Ac
5Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Amostras clínicas
• O que coletar.
Depende da suspeita clínica, da fase da doença e do tropismo viral
• Primeiros 5 dias de infecção: Há replicação viral, nenhuma ou
pouca produção de anticorpos  Pesquisa de vírion, Ags ou
genoma viral
• Fase aguda: Pesquisa de IgM
• Fase convalescente: Pesquisa de IgG
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Amostras clínicas
D
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 V
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Local da lesão Para propagação viral Para exame direto
Trato respiratório Lavado de garganta, aspirado 
de nasofaringe em crianças de 
até 2 anos
Aspirado de garganta-ME
Aspirado de nasofaringe – IF
SNC Líquor, sangue(isolamento de 
arbovírus),fezes,swab
retal,lavado de garganta,biópsia 
cerebral
Biópsia cerebral-IF e ME
Sistema cardiovascular Fezes Biópsia de tecido cardíaco, 
líquido pericárdio-IF e ME
Pele Liquido de vesiculas e 
pústulas,raspado de 
úlceras,fezes,swab de garganta
ME,ID(imunodifusão)
Fígado Sangue Soros,fezes
Infecções congênitas Lavado de garganta,placenta Biópsia de tecido fetal-MO
Febres de origem desconhecida Sangue heparinizado,lavado de 
garganta,urina recente
?
7Virologia - Profa Tatiana Pires, 
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Inoculação de virus em sistemas 
hospedeiros
• Inoculação experimental de vírus em sistemas 
hospedeiros
• Sistemas hospedeiros vivos: cultura de células, animal ou ovo 
embrionado
• Provocam modificações fisiológicas, observadas como efeitos 
consequentes da biossíntese viral
• Alteraçõe citopáticas, hemadsorção, hemaglutinação, paralisia, lesões 
degenerativas, morte, são exemplos.
• Propagação de vírus em animais de 
laboratório
• Não é frequente, devido à cultua de células – opção + simples e + prática
• Camundongos – arbovírus, vírus da raiva e alguns Coxsakiesvirus do 
tipo A
• Inoculação intracerebral e intraperitoneal
• Animais de grande porte – praticamente não utilizados
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Propagação de virus em ovos 
embrionados
▪ Até 1950 – sistema hospedeiro de escolha para propagação viral
▪ Hoje: + para isolamento de vírus aviários, influenza e produção de
vacinas
▪ Incubação artificial  temperatura adequada, umidade (+/- 62%) e
circulação de ar importantes para evitar dessecação das cascas
▪ A via de inoculação depende da especificidade do vírus que se quer
isolar
▪ Observação da propagação viral em ovos embrionados 
hemaglutinação ou visualização de pocks (lesões esbranquiçadas ou
hemorrágicas na membrana corioalantóica
▪ Identificação viral  reações sorológicas utilizando-se soros padrões
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Relembrando….
Vírus: parasitas intracelulares obrigatórios
Célula viva para replicação
Sistemas celulares
Cultura de 
células
Animais de 
laboratório
Ovos 
embrionados
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Isolamento Viral
Isolamento do virus a partir da amostra clínica em
sistemas hospedeiros (vivos) – normalmente Padrão-
ouro
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Isolamento Viral
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CULTURA DE CÉLULAS
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CULTURA DE CÉLULAS
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Histórico – Cultura de células
▪ Século XX – 1907 – Harrison:
• Pioneiro no uso de CC;
• Queria provar que as fibras nervosas eram
formadas a partir de céls nervosas
• Necessidade de observer células for a do
organism
• Trabalhou com tubo medular de anfíbios
• Manteve condições assépticas
• Na M.o.: comprovou sua hipótese
16Virologia - Profa Tatiana Pires, 
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Histórico – Cultura de células
▪ Século XX – 1912 – Alexis Carrel:
• Modelo a partir de células cardíacas de embrião
de galinha;
• Descobriu a necessidade de troca de fontes de
nutrients contidos nos frascos;
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Histórico – Cultura de células
▪ Século XX – 1948 – Keilova:
• Introduziu antimicrobianos em culturas de
células
▪ Século XX – 1952 a 1959 – Eagle, Sanford,
Leibovitz, Dulbecco
• Desenvolvimento de meios básicos para cultivo:
Eagle’s basal medium – EBM
Eagle’s minimum essential medium – EMEM
L15
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM
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Histórico – Cultura de células
▪ Século XX – 1951 – George Grey:
• Cultivou células de tecido tumoral humano,
estabelecendo a linhagem HeLa;
• Hanrietta Lacks, 1920-1951-EUA- Tumor no
colo do útero- nas mãos de Geroge
Grey..células..
19Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Histórico – Cultura de células
▪ Século XX – 1961 – Hayflick e Moorhead:
• Experimentos que utilizavam células de vida finita
20Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Histórico – Cultura de células
▪ Século XX – 1962 – Nakamura e cols.:
• Estabeleceram a linhagem VERO (células de
rim de macaco-verde africano  Cercopithecus
aethiops);
• Aprovada pela OMS para uso em produção de
vacinas
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MSc.
Histórico – Cultura de células
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MSc.
Conceito – Cultura de células
É o processo pelo qual as células são mantidas vivas em em
crescimento fora do seu tecido original, em condições
controladas.
Conjunto de técnicas que permitem cultivar/manter células
isoladas do organismo onde existem, mantendo as
características próprias
Pode-se fazer culturas a partir de tecidos humanos, animais e
vegetais.
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Aplicações – Cultura de 
células
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Cultura de células
• Controle do ambiente
• Homogeneidade da 
amostra
• Economia
• Questões éticas
A proliferação in vitro difere da in vivo
Vantagens em 
relação ao uso de 
animais
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1. Epitelial
Natureza das Células
2. Fibroblástica
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Tipo de Cultivo
▪ Estabelecida a partir do crescimento de células oriundas de um
fragmento de tecido obtido por desagregação mecânica ou
enzimática
▪ Diplóides
▪ Sensíveis à infecções por virus que tem tropismo pelo tecido
que as originou
▪ 3-20 passagens in vitro
▪ Podem ser obtidas de: sangue, rins, fígado, linfonodos, baço,
timo, pancreas e embriões
▪ Cultivo primário é subcultivado (passagem)  cultivo
secundário (células da 1a passagem)
▪ Dificuldade de obtenção em primatas não-humanos 
contaminação por agentes infecciosos
1. Cultura Primária/finita
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▪ Derivam de subculturas das células primárias
▪ Diplóides: devido a numerosos ciclos de divisão
celular
▪ Geralmente derivadas de tecidos animais
▪ População homogênia de um único tipo de célula
que pode se dividir até 100 vezes sem entrar em
senescência
▪ Principal vantagem: podem ser bem caracterizadas e
padronizadas, produção baseada num Sistema de
banco de células
2. Cultura diplóide/finitas
Tipo de Cultivo
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▪ Único tipo celular
▪ Capacidade ilimitada de crescimento
▪ Pode vir a partir de tecidos humanos ou animais
▪ Frequentemente apresentam morfologia/número
anormal de cromossomos (aneuplóides)
▪ São derivadas de:
a. Subcultivo seriado ou primário de células tumorais humanas ou de animais
(ex: HeLa)
b. Transformação de célula normal com tempo de vida finito, com um oncogene
viral (ex. Linf. B transformado pelo EBV)
c. Transformação de célula normal através de um agente químico mutagênico
d. Subcultivo seriado de uma população de células normais originando
espontaneamente células com tempo de vida infinito
e. Fusão entre célula de mieloma com linfócito B produtor de Ac
3. Linhagens Contínuas/Permanentes/imortais
Tipo de Cultivo
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▪ Tem sido bastante utilizadas como alternativa para
produção de produtos biológicos por tempo
indefinido, baseado em células bem padronizadas e
caracterizadas;
3. Linhagens Contínuas/Permanentes/imortais
Tipo de Cultivo
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▪ Origem na seleção clonal (estabelecimento
de uma população de células a partir de uma
única célula);
▪ Os clones podem derivar  linhagens de
células contínuas ou de linhagens primárias;
▪ Propósito do clone  minimizer o grau de
variação genética e fenotípica dentro de uma
população de células
4. Culturas clonadas/clones
Tipo de Cultivo
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Fonte: UFMG
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▪ São oriundas de tecidos duros e, por isso, são
dependentes de ancoragem, necessitando de
adesão a uma superfície de contato para que
possam proliferar;
▪ As garrafas de cultura devem possuir superfície
negativa  carga medeia a produção de proteínas
de adesão e proteoglicanos que iniciarão a adesão
celular
▪ Em cultura: se espalham por todo o fundo da garrafa
 monocamada celular
Células Aderentes
Natureza das Células
33Virologia - Profa Tatiana Pires, 
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▪ São derivadas de tecidos que não necessitam de
ancoragem para proliferar e sobreviver;
▪ Podem ser cultivadas em suspensão no meio;
▪ Capacidade restrita às células hematopoiéticas, às
linhagens transformadas ou às células de tecido
tumoral
Células Não Aderentes
Natureza das Células
34Virologia - Profa Tatiana Pires, 
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▪ A escolha do meio de cultivo depende do tipo celular
que se deseja cultivar
Meios de Cultura
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Meios de Cultura
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Meios de Cultura
Fonte:FIOCRUZ
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Meios de Cultura
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Meios de Cultura
1. Água
2. Sais inorgânicos (oligoelementos): mantêm o potencial da 
membrana, são cofatores de diversas reações enzimáticas, 
fatores de adesão.
Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, HCO3
-
3. Sistemas tampão : para compensar a liberação de CO2, 
liberado pelas células e devido à produção de ácido láctico 
devido ao metabolism da glicose
Bicarbonato/ fosfato
4. Hidrocarbonetos: glicose, maltose, sacarose, fructose e 
galactose
5. Indicadores de pH: para indicar quaisquer mudanças no pH 
devido ao metabolism cellular
Vermelho de fenol
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Meios de Cultura
6. Vitaminas: intervenientes em processos metabólicos das 
células.
Ácido paraminobenzóico, biotina, ácido fólico, ácido nicotínico, 
riboflavin, tiamina, inositol, vitamina B12, vitamina A e vitamin 
E
7. Aminoácidos essenciais:
Arginina, cisteína, prolina, L-glutamine etc.
8. Lipídios: um dos components oferecidos pelo soro 
Colesterol, ácidos linolenico e linoleico, ácido palmítico etc.
40Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Meios de Cultura
9. Suplementos: 
I. Hormônios
II. Soro
III. Proteínas e peptídeos para meios sem soro (alfaglobulina, 
fibronectina, albumina e transferrina)
IV. Antibióticos e antifúngicos: 
- Mantêm a esterilidade do meio, mas em escala insdutrial não é 
possível utilize-los.
- Devem ser de amplo espectro, induzindo o mínimo de 
resistência
- Não podem ser citotóxicos
Gentamicina (50ug/mL), Penicilina (100UI)/estreptomicina 
(50ug/mL), anfotericina B (fungizona)
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Meios de Cultura
DMEM – Dulbecco/Vogt modified Eagle’s (Harry Eagle) 
Minimal Essential Medium
- Difere do meio original MEM cerca de 4 vezes + vitaminas e os
aminoácidos do que as presentes na fórmula original;e alguns de
2-4 vezes + glicose.
- Contém ferro e outros adicionais.
- A maioria dos tipos de células humanas, de macaco, de hamster,
de rato e galinha crescem bem neste meio
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MSc.
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Meios de Cultura
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Soro - Suplemento
Primeiro uso em cultura de células  ~1950
Fornece elementos essenciais de forma empírica, não há como ter
controle total das concentrações dos elementos
▪ Fatores de crescimento/coagulação: estimulam e acelaram
crescimento e diferenciação celular; previnem processos de 
apoptose
- EGF, IL-6, PDGF, Insulina
▪ Albumina: liga-se a íons tóxicos; é uma carreadora de vitaminas
lipossolúveis e esteróides; um dos fatores de proteção contra 
choques físicos (ex. Pipetagem)
▪ Fatores de adesão celular
- Fibronectina, Laminina, Fetuína
▪ Transportador de íon Fe3+: complex transferrina/Fe3+ 
essencial para os receptors celulares
- Transferrina
▪ Antiproteases: previne a degradação proteolítica das células
- Alfa1-antitripsina e alfa2-macroglobulina
44Virologia - Profa Tatiana Pires, 
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Tipos de soro
SFB – soro fetal bovino/Fetal bovine sera (FBS)
SRNV – soro de recém nascido de vitela
Usa-se entre 10% (maioria das linhagens) a 20% (linhagens mais
exigentes)
45Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Tipos de soro
O ideal seria, sempre que possível, não
utilizer soro nos meios de cultura:
▪ É empírico  elementos não
quantificados▪ Não pode ser usado na fabricação de
produtos biofarmacêuticos
▪ Podem transportar vírus ou fatores de
inibição
46Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Isolamento de virus em células
• Fatores fundamentais para escolha da linhagem 
celular:
a. Permissividade
b. Velocidade de replicação
Vírus Célula
Enterovírus MA-104, GMK
Rotavírus MA-104, Vero
Adenovírus HeLa, HEp-2, A549, KB, MRC-5
Alfavírus Vero, A549, MRC-5
Herpes simplex virus Vero, HEp-2, MRC-5, HeLa, WI-38
Influenza virus MDCK, HuH17, IMR-32, GBM8401
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Isolamento de virus em 
células
Célula Fonte
MA-104 Rim de macaco-verde-africano
GMK Rim de macaco-verde-africano
Vero Rim de macaco verde
HeLa Carcinoma de cervix uterino humano
HEp-2 Carcinoma de laringe humana
A549 Carcinoma de pulmão humano
KB Carcinoma epidermóide humano
MRC-5 Pulmão de embrião humano
WI-38 Pulmão de embrião humano
MDCK Rim de cachorro
HuH7 Hepatocarcinoma humano
GMB8401 Glioblastoma humano
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MSc.
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Isolamento viral – Detecção da presença do 
virus em cultura
▪ Efeito citopático – presença de alguns virus pode ser revelada
pelas alterações degenerativas que eles induzem nas células
infectadas. Tais alterações podem ser visualizadas em M.o. 
ECP/CPE
▪ Hemadsorção – alguns virus alteram a superfície da célula
infectada conferindo-lhe afinidade por eritrócitos (ex. Influenza
virus)
▪ Interferência viral – certos virus que não induzem CPE são postos
em evidência recorrendo a sua capacidade de interferer com a
replicação de um segundo virus (virus indicador), o qual possui
um CPE característico (ex. Vírus da rubéola + CoxsaKie A9)
▪ Hemaglutinação – alguns virus produzem proteínas
hemaglutinantes que podem ser colocadas em evidência
adicionando-se suspensão de hemácias de uma espécie adequada
(humana, galinha, pinto etc.) Ex: virus da rubéola, virus da
influenza, vírus da parainfluenza 49Virologia - Profa Tatiana Pires, 
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Efeito Citopático – ECP/CPE
▪ Enterovirus:
- Arredondamento das células;
- Inclusão eosinófila citoplasmática com compressão do núcleo;
- Nas fases mais avançadas o núcleo deformado aparece mais
escuro e a célula diminui de volume.
▪ HSV:
- Arredondamento das células;
- Fases avançadas: sincícios
- Inclusão eosinófila difusa intranuclear
50Virologia - Profa Tatiana Pires, 
MSc.
Efeito Citopático – ECP/CPE
▪ Reovirus:
- Nas células não coradas é difícil a visualização de CPE;
- Inclusão eosinófila citoplasmática rodeando o núcleo sem o
deformer.
▪ Adenovirus:
- Inclusão intranuclear compartimentada;
- Núcleo intacto
▪ HIV/ VSR:
- Formação de sincícios.
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MSc.
Efeito Citopático – ECP/CPE
Localização de corpúsculos de inclusão produzidos por alguns virus
VÍRUS NUCLEAR CITOPLASMÁTICA
HSV X
VZV X
CMV X
Adenovírus X
JC e BK (Poliovirus) X
PB19 X
Poxvirus X X
Vírus do Sarampo X X
Parainfluenza virus X
Vírus da raiva X
YFV X X
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MSc.
Identificação do virus em cultura
▪ Imunofluorescência direta (IFD):
- Usa-se Ac marcados com fluorocromos (FITC)
▪ Imunoperoxidase direta:
- Usa-se Ac marcados com peroxidase (enzima)
▪ Neutralização:
- Baseia-se na perda de infecciosidade de um
virus devido à interação com Ac específico
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Identificação do virus em cultura
▪ Microscopia eletrônica: 1939  1o ME
Vantagens Desvantagens
Visualização direta da partícula viral Baixa sensibilidade, exige que na
amostra clínica existam partículas
virais em qtde suficiente 105-106/mL
Alto poder de resolução Técnica dispendiosa, pessoal
devidamente treinado, manutenção
intense etc.
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Microscopia eletrônica
▪ Microscopia eletrônica: 1939  1o ME
MEV1942
▪ Microcópio eletrônico de varredura: utiliza um feixe de elétrons ao
invés de fótons utilizados em um microscópio óptico
convencional (2.000)
▪ Aumenta muito a resolução (>300.000), já que não usa luz branca;
▪ 1 a 5 nm de comprimento são observáveis por ME
▪ Imagem tridimensionalVantagens Desvantagens
Visualização direta da partícula viral Baixa sensibilidade, exige que na
amostra clínica existam partículas
virais em qtde suficiente 105-106/mL
Alto poder de resolução Técnica dispendiosa, pessoal
devidamente treinado, manutenção
intense etc.
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Microscópio eletrônico de varredura
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Varredura x Transmissão
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Varredura x Transmissão
MET MEV
Aumento: até 1 milhão de vezes Aumento: até 300.000 vezes
Imagens planas Imagens tridimensionais 
Morfologia celular interna, DNA, 
RNA, proteínas.
Morfologia externa
Observação das amostras: Cortes ultrafinos. Observação das amostras : Otimização por 
contraste com metais pesados. 
Amostras devem ter em média 1nm Amostras devem ter em média 1nm
Dificuldade: preparação da amostra tem que ser 
ultrafina, sendo de difícil execução. Além de ser 
um processo demorado e com baixo volume de 
amostras. 
Dificuldade: O animal tem que está em boa 
condição de fixação para permitir a observação.
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Varredura x Transmissão
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Varredura x Transmissão
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Diagnóstico sorológico
▪ Finalidade em virologia
▪ Diagnosticar uma enfermidade
▪ Identificar novos vírus
▪ Epidemiologia
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Diagnóstico sorológico
• Como? Por quê?
• Quando o agente infeccioso é de difícil isolamento ou
identificação
• Quando espécimes clínicos apropriados para cultura ou
detecção do agente são de difícil obtenção
• Quando o vírus foi isolado, mas seu papel na infecção é
duvidoso
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Diagnóstico sorológico
• Teste de Neutralização (TN)
• Teste de Inibição da Hemaglutinação (HI)
• Teste de Fixação do Complemento (FC)
• Imunofluorescência (IF): direta/indireta
• Aglutinação Passiva
• Teste de Imunoperoxidase
• Teste Imunoenzimático (EIA ou ELISA)
• Immunoblotting – Western Blotting (WB)
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Diagnóstico Molecular
• PCR – Polymerase Chain Reaction
• Hibridização de Ácidos nucleicos
• Southern Blotting
• Northern Blotting
• Eletroforeses
• RFLP/Enzimas de restrição
• Real-Time PCR – qPCR
• Sequenciamento nucleotídico
• Nucleic Acid Specific Based Amplification –NASBA
• Captura Híbrida
• Branched DNA – Ensaio de DNA ramificado
• PCR-ELISA
• Single Stranded Conformation Polymorphism - SSCP
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