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APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS DE FITOQUÍMICA Elaboração: Profa. Dra. Fernanda Oliveira de Gaspi - Araras/ 2019 - � �2 Normas de Segurança no Laboratório de Fitoquímica ! ❀ Qualquer laboratório onde se manipule substâncias químicas é potencialmente perigoso. Portanto, tenha o máximo de cautela e atenção ao realizar um experimento, evitando conversas e brincadeiras que dispersem a concentração. ❀ As substâncias químicas, principalmente os solventes, são normalmente, voláteis, corrosivos e combustíveis. Desta forma, o uso de chama deve ser evitado, quando utilizado, deve-se cercar de todas as precauções. ❀ Existe uma regra geral que deve ser seguida no desenvolvimento dos experimentos: toda substância desconhecida é potencialmente perigosa até que se prove o contrário. ❀ A toxicidade das substâncias químicas varia enormemente e nem todas, mesmo as mais comuns, tiveram seus aspectos toxicológicos suficientemente estudados. Por isso, deve-se sempre seguir as normas a fim de evitar acidentes. Abaixo há uma lista de instruções específicas que os alunos devem seguir para a sua segurança e de seus colegas. 1. Não trabalhe sozinho no laboratório. Um companheiro, ao menos, sempre será uma ajuda ou testemunha em caso de acidente. 2. Use o jaleco para proteção. 3. Use sapato fechado (nunca sandálias!) 4. Não fume no laboratório. 5. Evite brincar no laboratório. 6. Se algum ácido ou outro produto químico for derramado, lave o local com bastante água e comunique o professor. 7. Leia com atenção o rótulo dos reagentes para se ter certeza de que pegou o frasco correto. 8. Não jogue material sólido na pia. 9. Observe a limpeza dos materiais antes de utilizá-los. 10.Não gaste reagentes e soluções inutilmente, utilize somente o necessário para o experimento. 11.Nunca pese material diretamente sobre o prato da balança; use béquer, vidro de relógio ou papel toalha. 12.Se houver precipitado ou duas fases em solução a ser utilizada, agite cuidadosamente de modo a homogeneizá-la. Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �3 13.Não ingira ou beba qualquer alimento no laboratório. 14.Não recoloque nos frascos soluções restantes, podem contaminar o conteúdo do recipiente. 15.Quando utilizar soluções e reagentes, certifique-se que o rótulo esteja voltado para cima, evitando que se estrague. 16.Só use água destilada nos experimentos. 17.Não trabalhe com material defeituoso, principalmente o de vidro. 18.Não deixe sobre a mesa a lamparina acesa com chama forte. 19.Não deixe vidro quente em lugar que possam pegá-lo inadvertidamente. 20.Não prove ou engula drogas ou reagentes do laboratório. 21.NUNCA pipete com a boca soluções ou líquidos puros. 22.Não trabalhe com inflamáveis próximos a chamas. 23.Não aqueça tubos de ensaio com a boca virada para si ou para outra pessoa. Habitue-se a aquecer o tubo de ensaio de forma intermitente. 24.Não aqueça substâncias inflamáveis ou voláteis em chama direta, use banho-maria. 25.Feche direito os frascos das soluções e regentes, principalmente os que forem voláteis e inflamáveis. 26.Utilize o descarte para líquidos inflamáveis. Evite jogar na pia. 27.NUNCA adicione água a uma solução de ácido ou base concentrada para diluí-los. Sempre adicione essas soluções concentradas à água. 28.Substâncias como vapores tóxicos tais como: bromo, cloro, ácido clorídrico e nítrico concentrados, solução concentrada de amônia entre outras devem ser manipuladas na capela. 29.Tão importante quanto trabalhar em segurança é trabalhar ordenadamente, com consciência da seqüência a ser realizada. Leia atentamente o procedimento experimental certificando-se de que todos os materiais e reagentes necessários estão disponíveis. Anote os resultados obtidos relacionados à teoria e à prática. 30. Consulte o professor quando tiver dúvidas e avise-o de qualquer acidente que ocorra por menor que pareça. 31.Lave bem as mãos ao deixar o laboratório. ! Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �4 1) EXTRAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO GENÉRICA DE FLAVONOIDES E TANINOS EXTRAÇÃO FLAVONOIDES ❀ Pesar 2g do material vegetal em um erlenmeyer. ❀ Adicionar 20mL de solução etanol:água 70%. ❀ Ferver por cerca de 5 minutos em chapa elétrica. ❀ Deixar amornar e filtrar por algodão. ❀ Distribuir o filtrado em 5 tubos de ensaio identificados, sendo que o tubo n° 5 será o branco. ❀ Executar as reações de identificação A, B, D, G. EXTRAÇÃO TANINOS ❀ Pesar 1g do material vegetal em um béquer. ❀ Adicionar 30mL de água destilada. ❀ Ferver por cerca de 5 minutos em chapa elétrica. ❀ Deixar amornar e filtrar por algodão. ❀ Distribuir o filtrado em 5 tubos de ensaio identificados, sendo que o tubo n° 5 será o branco. ❀ Executar as reações de identificação B, E, F, H. REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO A. REAÇÃO DE SHINODA (Cianidina) ➢ Colocar 2 mL do extrato em tubo de ensaio. ➢ Adicionar 0,5 mL de HCl concentrado. ➢ Adicionar um fragmento de magnésio metálico. ➢ Observar se após o desprendimento de hidrogênio há o aparecimento de coloração. B. REAÇÃO DO CLORETO FÉRRICO ➢ Colocar 1 mL do extrato em tubo de ensaio. ➢ Adicionar 4 mL de água destilada. ➢ Adicionar 1-2 gotas de FeCl3 2%. ➢ Observar se há o aparecimento de coloração e/ou precipitação. C. REAÇÃO DO CLORETO DE ALUMÍNIO ➢ Em um papel de filtro aplicar duas gotas do extrato em duas áreas. ➢ Colocar sobre uma das manchas uma gota da solução etanólica de cloreto de alumínio 5%. ➢ Após a evaporação do solvente, comparar a fluorescência sob luz ultravioleta. D. REAÇÃO COM ÁCIDO SULFÚRICO ➢ Colocar 1 mL do extrato em tubo de ensaio. ➢ Adicionar 3 gotas de Ácido sulfúrico. ➢ Observar se há o aparecimento de coloração. E. REAÇÃO DE STIASNY ➢ Colocar 1 mL do extrato em tubo de ensaio. ➢ Adicionar 3 gotas de formol e 2 gotas de Ácido clorídrico. ➢ Observar se há precipitação. F. REAÇÃO COM ACETATO ÁCIDO DE CHUMBO ➢ Colocar 2 mL do extrato em tubo de ensaio. ➢ Adicionar 4 mL ácido acético glacial. ➢ Adicionar 2 mL solução de acetato de chumbo 10%. ➢ Observar se há precipitação. Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �5 G. REAÇÃO COM HIDRÓXIDOS ALCALINOS ➢ Colocar 1 mL do extrato em tubo de ensaio. ➢ Adicionar 4 mL de água destilada. ➢ Adicionar 15 gotas de NaOH 1N. ➢ Observar se há o aparecimento de coloração. H. REAÇÃO COM GELATINA ➢ 2 ml do extrato + 2 gotas de HCl diluído + solução de gelatina a 2,5% gota a gota. ➢ Se ocorrer formação de precipitado: reação positiva para taninos. Tabela 1: Resultados para os respectivos testes de caracterização de flavonoides e taninos. Cores apresentadas em caso de resultado positivo. REAÇÃO FLAVONA FLAVONOL FLAVANONAS DERIVADOS ANTOCIÂNICOS CHALCONAS ISOFLAVONAS TANINOS A SHINODA Amarelo Laranja Vermelha Violácea Vermelha rosa - - - B CLORETO FÉRRICO Verde Verde- acastanhado Verde- acastanhado - Amarela Verde Precipitado Azul (hidr) verde (condens) C CLORETO DE ALUMÍNIO Fl. Amarela esverdeada Fl.Amarela Fl. Azul-esverdeada - Fl.Amarela Fl.Amarelo- acastanhado- D ÁCIDO SULFÚRICO Amarelo intenso Amarelo intenso Laranja – vermelho - Vermelho – carmim Vermelho - carmim - E STIASNY - - - - - Precipitado (condens.) F ACETATO ÁCIDO DE CHUMBO Precipitado (hidrolis.) G HIDRÓXIDOS ALCALINOS Amarelo - flavonoides Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �6 2) ALCALOIDES 2.1 – EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO PROCESSO A (Análise direta em meio ácido) Colocar cerca de 2g da droga pulverizada em um tubo de ensaio. Adicionar 40 mL de solução aquosa de ácido clorídrico a 2%. Aquecer a mistura em chapa elétrica por 3 minutos. Deixar esfriar e filtrar em algodão. Dividir o filtrado em duas porções : A e B Distribuir a porção A em 6 tubos de ensaio. Colocar 2 gotas dos reativos de precipitação: Branco, Mayer, Bertrand, Dragendorff, Bouchardart e Sonnenschein (Tabela 1). PROCESSO B Alcalinizar a porção B com solução de hidróxido de amônio a 10% até pH 9-10. Efetuar extrações em funil de separação com 20 mL de clorofórmio. Extrair cautelosamente. Decantar a camada clorofórmica e separá-la. Separar 10mL para a reação da murexida (item 2.2). Evaporar o clorofórmio da fase orgânica restante em banho-maria (=levar à secura). Ressuspender o resíduo resultante em 5 mL de solução de ácido clorídrico 2%. Distribuir o material em 6 tubos de ensaio e em cada tubo colocar uma gota dos reativos de precipitação: Branco, Mayer, Bertrand, Dragendorff, e Bouchardart, ácido fosfomolibidico. Anotar os resultados. 2.2 – REAÇÃO DE MUREXIDA Colocar o extrato clorofórmico reservado em cápsula de porcelana e evaporar o solvente em banho- maria até a secura. Adicionar ao resíduo 0,5mL de ácido clorídrico 6N, 2 gotas de clorato de potássio 0,1N e homogeneizar com auxílio de um bastão de vidro. Evaporar o solvente novamente em banho-maria. Adicionar ao resíduo 3 gotas de hidróxido de amônio. Observar a coloração. Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �7 RGA Composição Cor do precipitado Dragendorff Iodo bismutato de potássio Alaranjado Mayer Iodo mercurato de potássio Branco Bertrand Ácido sílico-túngstico Branco Bouchardat/Wagner Iodo-iodeto de potássio Marrom Sonnenschein Ácido fosfomolíbdico Branco Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �8 3) EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE HETEROSÍDEOS CARDIOATIVOS 3.1 EXTRAÇÃO ! Pesar cerca de 10g das folhas frescas da planta e triturar. ! Colocar em um erlenmeyer e adicionar 40mL de etanol 50%. ! Ferver em chapa elétrica por 15 minutos. ! Após resfriar, adicionar 15mL de solução saturada de acetato de chumbo e misturar devagar. ! Após a precipitação, filtrar. ! Transferir o filtrado para um funil de separação e extrair duas vezes com 20mL de clorofórmio (Não agitar com força para evitar a formação de emulsão). ! Reunir as frações orgânicas e agitar com pequena porção de sulfato de sódio anidro. Filtrar em algodão e evaporar até metade do volume. Com cada uma, efetuar as reações abaixo: 3.2) REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO A) REAÇÃO DE KELLER-KILLIANI ! Evaporar 2mL do extrato clorofórmico em um tubo de ensaio. ! Dissolver o resíduo em 1mL de ácido acético glacial. ! Adicionar 2 gotas de cloreto férrico 2%. ! Transferir CUIDADOSAMENTE o conteúdo deste tubo para outro com 2mL de ácido sulfúrico concentrado. NÃO AGITAR. Observar a coloração. Cor da formação do anel → vermelhado acastanhado → reação + Cor da fase acética → azul-esverdeado. B) REAÇÃO DE LIBERMANN-BURCHARD ! Evaporar 2mL do extrato clorofórmico em um tubo de ensaio. ! Adicionar ao resíduo 1 mL de anidrido acético. ! Adicionar 1mL de ácido sulfúrico concentrado (SEM AGITAR). ! Observar a coloração. Cor azul ou verde → provavelmente núcleo esteroidal. Cor vermelha, rosa, púrpura ou violeta → provavelmente núcleo terpênico. C) REAÇÃO DE KEDDE ! Evaporar 2mL do extrato clorofórmico em um tubo de ensaio. ! Adicionar ao resíduo 6 gotas de reagente de Kedde e 3 gotas de hidróxido de potássio 1N. ! Observar a coloração. Cor → castanho avermelhado a vermelho-violeta → reação positiva. Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �9 D) REAÇÃO DE BALJET ! Evaporar 2mL do extrato clorofórmico em um tubo de ensaio. ! Adicionar ao resíduo 5 gotas de solução aquosa de ácido pícrico 5% e 2 gotas de hidróxido de potássio 1N. Observar a coloração. Cor → amarelo → reação positiva. Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �10 4) ÓLEOS VOLÁTEIS E MÉTODOS EXTRATIVOS 4.1 CARACTERES ORGANALÉPTICOS ! Separar pequena amostra da droga a ser analisada, triturar e esfregar entre os dedos. ! Observar o odor característico. ! No caso de amostras de óleo essencial puro, abrir o recipiente e deixar que seu odor disperse pelo ar. Observar a sua cor e aspecto oleoso em tubo de ensaio. 4.2 MICRODESTILAÇÃO ! Adicionar em um tubo de ensaio cerca de 0,5g da droga devidamente triturada ou pulverizada, umedecendo-a em seguida com água destilada. ! Colocar o tubo em banho-maria com auxílio de garras de madeira e a seguir, coloque na boca deste, uma lâmina de microscopia. ! Observar que após alguns minutos a lâmina irá conter, em sua parte inferior, vapores condensados provenientes do interior do tubo. Realizar duas coletas diferentes. ! Verificar o odor do condensado. ! Em seguida, cobrir a primeira lâmina com lamínula e colocá-la em microscópio óptico, a fim de visualizar as gotículas de óleo essencial dispersas em água. ! Adicionar uma gota de Sudam III no condensado da segunda lâmina, cobrir com lamínula e colocar o conjunto no microscópio. Observar a coloração. 4.3 CONTROLE DE QUALIDADE (Testes qualitativos) A) PRESENÇA DE ÓLEO FIXO ! Adicionar, com auxílio de pipeta de Pasteur, 4 gotas de óleo essencial e 2 gotas de éter dietílico em um tubo de ensaio. ! Agitar em seguida para misturar os componentes. ! Colocar uma gota da mistura em 3 regiões diferentes de um papel de filtro. ! Identificar as manchas no papel e deixá-lo por cerca de 15-20 minutos em estufa a 100oC. A presença de mancha gordurosa translúcida após a evaporação do óleo essencial e do éter indica a presença de óleo fixo. B) PRESENÇA DE ÁLCOOL ! Em uma proveta graduada de 10mL, com auxílio de pipeta volumétrica, adicionar 2mL de óleo essencial a igual volume de uma solução de água glicerinada (água + glicerina 1:1). Observar cuidadosamente o menisco no momento das duas adições, pois os volumes têm que ser EXATOS e IDÊNTICOS. Se necessário, efetuar os devidos acertos com pipeta Pasteur. ! Misturar cuidadosamente os componentes da proveta e deixar em repouso por cerca de 10-15 minutos. A contração do volume da essência, indica a presença de álcool. Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi ��11 4.4) EXTRAÇÃO DE ÓLEOS VOLÁTEIS POR HIDRODESTILAÇÃO Colocar a droga vegetal ou a planta fresca adequadamente rasurada ou moída no balão de destilação de boca esmerilhada. Adicionar água quente de modo a ocupar pouco mais da metade do volume do balão. Acoplar o aparelho de Clevenger e preencher com água fria a parte do tubo graduado e tubo de retorno. Promover o aquecimento do balão até a fervura da água, controlando a ebulição. Medir no tubo graduado a quantidade de óleo obtida. Calcular a porcentagem em relação à droga. ! 4.5) EXTRAÇÃO EM APARELHO DE SOXHLET ❀ Pesar 20 g de folhas frescas. ❀ Acondicionar no cartucho próprio para aparelho de Soxhlet. ❀ Colocar cerca de 200mL de clorofórmio no balão de fundo redondo. ❀ Submeter a aquecimento por cerca de 40 minutos. ❀ Retirar o extrato obtido. ❀ Concentrar em rotaevaporador. ❀ Envasar em vidro âmbar e rotular. Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �12 5) CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ❀ Preparar as cubas cromatográficas com a seguinte fase móvel (FM): ✴ Tolueno: Acetato de etila (93:7). ❀ Preparar a placa cromatográfica conforme a figura abaixo: ! ❀ Aplicar as amostras e os padrões nos respectivos pontos de partida com o auxílio de um capilar. ❀ Amostras: soluções metanólicas dos óleos voláteis ou extratos a 1%. ❀ Padrões: soluções metanólicas dos compostos puros presentes nos óleos voláteis ou extratos a 0,5%. ❀ Colocar a placa na cuba cromatográfica e aguardar o desenvolvimento (LF =10 cm). ❀ Retirar da cuba e esperar evaporar o solvente. ❀ Observar a placa diretamente e na luz UV. ❀ Aspergir de maneira uniforme sobre a camada de sílica, cerca de 10,0 mL dos reveladores específicos. ❀ Após a nebulização, aquecer a placa cromatográfica em estufa a 105ºC por 10 minutos. ❀ Anotar os resultados obtidos: número de manchas, seqüência, valores de Rf, cor, forma e intensidade das mesmas, comparando com os padrões. LF=10 cm Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi Linha do solvente Linha de frente 1 cm 1 cm 1 cm ✴ Fase fixa: Silicagel G. ✴ Desenvolvimento: simples ascendente. � �13 6) SAPONINAS: Técnicas de identificação e doseamento A) Teste de espuma (qualitativo) -Colocar 1 g da droga em pó ou fragmentada em um Becker. -Adicionar 10 ml de água destilada. -Ferver por 3 minutos. -Filtrar e transferir para um tubo de ensaio. -Resfriar e agitar energicamente por 15 segundos. -Observar se ocorre a formação de espuma persistente por mais de 15 minutos. -Adicionar 1mL de solução de HCl 2 mol/L. Observar. B) Determinação do Índice de Espuma ou Afrosimétrico (Análise Semi-Quantitativa) Definição: maior diluição do extrato aquoso, referindo-se a 1g do fármaco vegetal, capaz de formar 1 cm de altura de espuma persistente, decorridos 15 minutos depois de agitados. Preparo do extrato aquoso da droga -Colocar 1,0 g da droga vegetal em erlenmeyer contendo cerca de 50 mL de água destilada. -Manter sob fervura por 10 minutos. -Resfriar e Filtrar em algodão. Obs.: Se necessário, adicione à solução filtrada e fria certa quantidade de uma solução de carbonato de sódio até que ela se torne neutra (monitore com papel tornassol). -Completar o volume para 100 mL com água destilada (em balão volumétrico). - Preparar a série de diluições conforme a tabela abaixo. -Para facilitar as medições e observações, os tubos devem ter o mesmo diâmetro e a mesma altura. Marque todos os tubos de ensaio com duas marcações, sendo a primeira correspondente ao volume de 10 mL e a segunda igual a 1cm acima desse nível. Tabela 1: Diluições das Soluções extrativas -Agitar energicamente cada tubo, vedando com o dedo polegar, durante 15 segundos. Deixe-os em repouso por 15 minutos. -Observar qual tubo apresenta anel de espuma de aproximadamente 1 cm de altura. -Adicionar em cada tubo 1 mL de solução de ácido clorídrico 2 mol/L. - Se a altura da espuma de todos os tubos for inferior a 1 cm, o índice de espuma é menor do que 100. Caso, em qualquer um dos tubos, a altura da espuma permanecer igual ou superior a 1 cm, calcular o índice conforme a equação: TUBOS I II III IV V VI VII VIII IX X Solução extrativa (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Água destilada (mL) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 - Volume total (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �14 IE = 1000/A (volume em mL do decocto) Apostila de Fitoquímica/2019 Profa. Dra. Fernanda de Gaspi � �15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRUNETON, J. Pharmacognosy, phytochemistry, medicinal plants. 2ªed. Paris : Lavoisier Publishing, 1999. COSTA, A. F. Farmacognosia. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 3v, todas edições. CUNHA, A.P. 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