Gráficos de Cinética Enzimática - Levedura Invertase

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Cinética Enzimática – Levedura Invertase
Tabela 1: Curva Padrão
	Tubos
	Sol.Padrão Redutora 12 mM (mL)
	Tampão pH 4,77 (mL)
	Reagente DNS (mL)
	Sacarose Hidrolisada (µmoles/mL)
	Abs (540 nm)
	Branco
	-----------
	2
	2
	0
	0
	1
	0,2
	1,8
	2
	0,06
	0,123
	2
	0,4
	1,6
	2
	0,12
	0,223
	3
	0,6
	1,4
	2
	0,18
	0,373
	4
	0,8
	1,2
	2
	0,24
	0,421
	5
	1
	1
	2
	0,3
	0,555
Gráfico 1
Para se calcular a quantidade de sacarose hidrolisada em cada tubo utilizou-se a formula:
C1 x V1 = C2 x V2
Por tanto para o TUBO 1, utilizando os dados da tabela 1:
C1 = 6 mM (ml) da solução padrão redutora, uma vez que a proporção utilizada no experimento foi de 1 sacarose produzindo 2 açucares redutores.
V1 = 0,02 ml da solução padrão redutora adicionada ao tubo 1.
C2 = ? Sacarose hidrolisada que será calculada.
V2 = 20ml, volume presente no tubo 1 após a adição de todos os demais produtos.
Sendo assim:
C1 x V1 = C2 x V2
6 x 0,02 = C2 x 20ml
C2 = (1,2 / 20)
C2 = 0,06 µmoles/mL
O mesmo princípio foi utilizado para calcular os tubos de 2 a 5, podendo se observar os dados na Tabela 1. 
Tabela 2: Efeito da concentração de substrato na atividade enzimática
	Tubos
	Sacarose 100 mM em tampão (mL)
	Tampão PH 4,77 (mL)
	Sol. Enzima (8g/mL)
	Abs (540 nm)
	Sacarose Hidrolisada (moles/mL)
	Sacarose inicial (mM)
	Velocidade da reação (umoles/mL/min)
	1/[S] (1/mM)
	1/Vmáx (1/(mM/mL/min))
	Branco
	------------
	1,9
	0,1
	 
	 
	 
	 
	 
	 
	1
	0,05
	1,85
	0,1
	0,049
	0,016158192
	0,250
	0,003
	4,000
	309,441
	2
	0,1
	1,8
	0,1
	0,071
	0,028587571
	0,500
	0,006
	2,000
	174,901
	3
	0,3
	1,6
	0,1
	0,118
	0,055141243
	1,500
	0,011
	0,667
	90,676
	4
	0,5
	1,4
	0,1
	0,202
	0,10259887
	2,500
	0,021
	0,400
	48,733
	5
	0,7
	1,2
	0,1
	0,323
	0,170960452
	3,500
	0,034
	0,286
	29,247
	6
	1
	0,9
	0,1
	0,477
	0,257966102
	5,000
	0,052
	0,200
	19,382
	7
	1,5
	0,4
	0,1
	0,531
	0,288474576
	7,500
	0,058
	0,133
	17,333
	8
	1,9
	-----------
	0,1
	0,676
	0,37039548
	9,500
	0,074
	0,105
	13,499
Utilizando a os valores de absorbância obtidos no comprimento de onda de 540 nm para os tubos de 1 a 8 e a equação da reta obtida no gráfico 1 – Curva padrão, foi calculada as concentrações de Sacarose Hidrolisada (moles/mL) para os tubos de 1 a 8, da seguinte forma, utilizando o TUBO 1 como exemplo:
X = concentrações de Sacarose Hidrolisada (moles/mL)
Y = Absorbância no comprimento de onda 540nm
Substituindo na equação da reta no gráfico 1 – Curva Padrão
y = 1,77x + 0,0204
0,049 – 1,77X + 0,0204
1,77x = 0,049 – 0,0204
x = (0,049 – 0,0204) / 1,77
x = 0,016158192
Para calcular a velocidade inicial de reação nos tubos de 1 a 8 dividiu-se os valores de concentrações de Sacarose Hidrolisada (moles/mL) por 5 (considerando o tempo de reação a 37°C (5 min)).
Gráfico 2
Estimando Vmax e Km:
De acordo com o gráfico o Vmax = aproximadamente 0,075 umoles/mL/min.
Uma vez que Km equivale a 50% do valor de Vmax, então Km = 4,00 mM.
Gráfico 3
Com a equação da reta de Lineweaver Burk calculamos o Vmáx e o Km da seguinte forma:
Y = 75,841 X + 14,042 onde:
Y = temos:
Para o cálculo de Vmáx:
= então
Vmáx = 0,0712
Como achamos o Vmáx agora substituímos em 
= 75,841
Km = 0,0712 x 75,841
Km = 5,4