Enzimas - Bioquímica Relatório

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FACULDADES OSWALDO CRUZ
BIOQUÍMICA
ENZIMAS
Anna Carolina Rodrigues RA: 4018056
Giovanna dos Santos RA: 4018063
Stefani Bolani RA: 4018144
INTRODUÇÃO
Enzimas são, na maioria das vezes, proteínas que agem como catalisadores nas reações bioquímicas que ocorrem em organismos vivos. Elas possuem a função de diminuir a energia de ativação empregada em uma ocorrer uma determinada reação. As enzimas são altamente específicas para certos reagentes, denominados substratos, e esses substratos reagem nos sítios ativos da enzima. Esse sítio ativo possui características determinantes para a alta especificidade de uma enzima, como tamanho, formato e composição química. Uma reação enzimática pode ser representada simplificadamente a seguir: 
E + S ES E + P,
onde E significa enzima, S representa o substrato e P o produto. 
Alguns fatores influenciam na ação enzimática como temperatura, pH, concentração do substrato, e a presença de inibidores ou ativadores da enzima. A alteração na temperatura e no pH influenciam a atividade enzimática pois tem o poder de desnaturar proteínas, e assim, ela perde sua função, que no caso é a de catalisar reações. Os inibidores de enzimas podem atuar de forma competitiva ou não competitiva, onde os competitivos agem diretamente no sítio de ligação com o substrato e os não competitivos se ligam a outro sítio de ligação, apenas inibindo a ação da enzima. 
Outro fator que determina a ação das enzimas são as coenzimas. As coenzimas são um conjunto de cofatores que ativam uma enzima ou auxiliam as mesmas a atuarem numa condição ótima. 
Das inúmeras enzimas existentes, duas estão presentes neste experimento, que são a invertase e a amilase salivar. A enzima invertase catalisa a hidrólise da sacarose, que é convertida em glicose e frutose, e é conhecida desta forma pois inverte a rotação óptica quando o meio reacional é analisado em um polarímetro, devido ao aparecimento da frutose.
Figura 1 – quebra da sacarose através da ação da enzima invertase.
 A amilase salivar, presente na saliva e produzida predominantemente pelas glândulas parótidas, catalisa a hidrólise de carboidratos como o amido e tem seu funcionamento ótimo em pH 6.8 e a 37ºC. O amido é quebrado dando origem a glicose, maltose, maltotriose e dextrina.
OBJETIVOS
Observar as ações das enzimas invertase e amilase salivar, quanto a sua especificidade, testar sua atividade quanto à temperatura e pH, bem como na presença de inibidores. 
MATERIAIS E REAGENTES 
 MATERIAIS
Tubos de ensaio
Pipetas graduadas
Erlenmeyer
Banho de gelo
Incubadora
Béquer
Tripé de ferro
Tela de amianto
Bico de Bunsen 
Copo plástico 
Pipeta de Pasteur
 Reagentes 
Enzima invertase
H2O
Sacarose 
Amido 0,5%
Albumina
Reagente de Benedict
Amilase salivar 1:10
Solução salina/fisiológica
HCl 2,0N
Glucobay (1 comp./5,0mL Salina)
Reagente de Lugol 
PROCEDIMENTO
No primeiro experimento realizado foram preparados quatro tubos de ensaio diferentes contendo respectivamente 2,0mL de água, sacarose, amido e albumina. Em cada um dos tubos foram adicionados 2,0mL da enzima invertase, preparada anteriormente pelos técnicos e mantida em banho de gelo. Os tubos foram colocados em uma incubadora a 37ºC por 15 minutos, após, foi adicionado 1,0mL de reagente de Benedict em cada um dos tubos e mantido em banho maria por 05 minutos. 
O segundo experimento foi realizado através da preparação de uma solução de amilase salivar. Foram coletados aproximadamente 1,0mL de saliva que foi posteriormente diluída em 10,0mL de solução salina. Foram preparados quatro tubos de ensaio, onde em três deles foram adicionados 1,0mL de amilase salivar, porém o segundo desses foi colocado em banho maria por 10 minutos e no terceiro foram adicionadas 5 gotas de HCl. O quarto tubo de ensaio possuía 1,0mL de água. Em todos eles foram adicionados 2,0mL de amido e foram colocados em incubadora a 37ºC por 15 minutos. Após sair da incubadora, foram adicionados 1,0mL de reagente de Benedict e mantidos em banho maria por 05 minutos. 
No terceiro experimento também foi utilizado a solução de amilase salivar preparada. Foram preparados 03 tubos de ensaio, onde todos continham 1,0mL de amido, porém no primeiro tubo foi adicionado apenas 3,0mL de solução salina, no segundo 1,5mL de solução saliva mais 1,5mL de amilase salivar, enquanto que no terceiro foi adicionado 0,5mL de solução salina, 1,5mL de amilase salivar e 1,0mL de Glucobay. Os três tubos foram incubados por 15 minutos, após, foram adicionados 1,0mL de reagente de Benedict e mantidos em banho maria por 05 minutos. Após análise dos resultados, em cada um dos tubos foram adicionadas aproximadamente 03 gotas de Lugol.
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Especificidade enzimática da invertase: 
Esse experimento tratava-se da observação da hidrólise da sacarose, devido à presença da enzima invertase. 
Em quatro tubos de ensaio foram adicionados 2 ml da solução de enzima invertase, preparada pelos técnicos da faculdade. Em seguida, foram adicionadas soluções diferentes em cada tubo, sendo possível analisar em qual delas ocorreu à reação de hidrólise. A adição de 1 ml de reagente de Benedict em cada tubo auxiliou na observação dos resultados. 
O reagente de Benedict tem a função de detectar a presença de açucares e açucares redutores, como por exemplo, glicose, maltose, lactose, entre outros. 
	Tubo de ensaio
	Resultado
	H20
	Marrom claro
	Sacarose
	Marrom escuro
	Amido
	Marrom claro
	Albumina
	Marrom claro
O tubo 2, onde possuía a sacarose, foi o único tubo que apresentou reação positiva. A sacarose é formada por uma molécula de glicose e uma molécula de frutose, sendo assim, possível de reagir com o reagente de Benedict, e também, ser hidrolisada pela enzima invertase. 
Foto 1: Resultados obtidos no laboratório
Desnaturação:
Esse experimento tratava-se da observação da hidrólise do amido.
Em quatro tubos de ensaio foram adicionados 2,0 ml de amido e em três tubos de ensaio, 1 ml de amilase salivar, e no quarto tubo foram adicionados 1 ml de água. 
	Tubo de ensaio
	Resultado
	Amilase salivar “in natura”
	Ocorreu
	Amilase salivar + aquecimento
	Não ocorreu
	Amilase salivar + HCL
	Não ocorreu
	H20
	Não ocorreu
A desnaturação é um processo que ocorre a quebra da proteína, ou seja, ela perde sua estrutura secundária e/ou terciária, fazendo com que ela perca sua função biológica. O tubo 2, tubo 3 e tubo 4 sofreram desnaturação, devido aos seguintes fatores:
Tubo 2: o aquecimento de 10 minutos no banho-maria.
Tubo 3: a adição do ácido HCl, alterou o pH da proteína. 
Tubo 4: água não sofre reação. 
O único tubo que apresentou reação positiva foi o tubo 1, pois a proteína não sofreu desnaturação da amilase salivar e devido a adição do reagente de Benedict, que detecta a presença de açúcares e açúcares redutores, foi possível ocorrer a reação de hidrólise do amido.
Foto 2: Resultados obtidos no laboratório
O tubo com coloração laranja é o que representa o tubo 1, onde ocorreu a hidrolise do amido.
Inibição da atividade enzimática: inibição da amilase salivar
O experimento 4 tinha como objetivo observar a reação das soluções com o Glucobay, um composto que tem como principal função inibir as enzimas gastrointestinais.
Foram preparados 3 tubos de ensaios, como mostrado na tabela abaixo:
	Tubos
	Amido
	Amilase 1:10
	Glucobay
	Solução Salina
	Resultados
	1
	1 mL
	-
	-
	3 mL
	Não reagiu
	2
	1 mL
	1,5 mL
	-
	1,5 mL
	Reagiu (límpido)
	3
	1 mL
	1,5 mL
	1 mL
	0,5 mL
	Reagiu
O Glucobay retarda a absorção de amido e carboidratos pela glicosidase-α, tem como princípio ativo a acarbose que é um pseudo tetrassacarídeo de origem microbiana, utilizado no tratamento da Diabetes II, ele tem a função de inibir as enzimas gastrointestinais envolvidas na degradação de dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. A função do lugol é identificar a presença de amido, caso omesmo tivesse sido usado no experimento, os resultados seriam o inverso, uma vez que no tubo 1 há presença de amido, e não houve reação nenhuma ao adicionar o Glucobay, por exemplo. 
CONCLUSÃO
A partir dos experimentos realizados, foi possível observar a identificação de enzimas por diferentes meios, além da influência de diversos fatores sobre a mesma. No experimento 2 pode-se analisar a hidrólise da sacarose pela enzima invertase. No terceiro experimento, observou-se a desnaturação das enzimas por diversos fatores, sendo eles: submeter a enzima a uma temperatura elevada; alterar o pH do meio, o objetivo desse experimento era verificar a hidrólise do amido, que foi identificado como tubo 1, uma vez que ao adicionar o reagente de Benedict, o mesmo identificou a presença de carbonos redutores. Após a realização do último experimento, foi possível entender didaticamente a ação da acarbose, que retarda a digestão de carboidratos e inibe enzimas gastrointestinais, sendo utilizado no tratamento da Diabetes tipo II. 
REFERÊNCIAS
SANTOS, A. F. dos, Imobilização de invertase comercial e de Saccharomyces cerevisiae em sabugo de milho e bagaço de cana-de-açucar. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição. 2010
Energia e enzimas. Disponível em https://pt.khanacademy.org/science/biology/energy-and-enzymes Acesso em 15 de Setembro de 2019.
Acarbose. Disponível em: http://institutobioquimico.blogspot.com/2010/07/acarbose.html. Acesso em 15 de Setembro de 2019