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Produção de metabólitos secundários de planta
Sistemas de produção por células vegetais e fotossintetizantes
Produção de metabólitos secundários de planta
Diferentes tipos de metabólitos de interesse
Diferentes tipos de culturas: suspensões celulares, raízes transformadas
Estratégias para aumentar a acumulação de metabólitos
Adição de precursores
Elicitação
...
Produção de metabólitos secundários
Coletas de plantas na natureza
Culturas dessas plantas no campo
Abordagem de química sintética (síntese) 
Abordagem biotecnológica 
Cultura de tecidos vegetais
Produção por engenharia genética
Quais são as vantagens de produzir in vitro?
Produção independente de fatores geográficos e climáticos (mudança de clima, secas, pragas, variabilidade na produção, fatores políticos e sociais, etc)  condições controladas
Evitar problemas relacionados com as safras e o armazenamento
Produtos de qualidade e rendimento padronizados e sem precisar do uso de pesticidas
Condições especialmente adaptadas para espécies de acesso difícil ou que crescem lentamente
Outras vantagens...
Permite baixar a pressão sobre o meio ambiente
Para a produção de alguns compostos complexos com C assimétricos, essa via de produção poderia ser mais viável que a síntese química
Estratégias para aumentar a acumulação de metabólitos secundários
Seleção das espécies vegetais apropriadas
Seleção do tipo de cultura mais produtivo
Otimização das condições de cultura
Usar elicitores
Adicionar precursores dos compostos de interesse
Seleção de espécies e do tipo de cultura mais produtivo
Mais fácil quando o metabólito de interesse é visualmente fácil de se observar (ex: pigmento)
Senão, importante contar com métodos de análise rápidos e simples (extração, isolamento/separação, detecção) : espectrofotometria, cromatografia, imunodetecção, radioimunoensaio, ... 
Isolamento biodirigido   isolar produtos naturais guiado por bioensaios
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Culturas de células (não organizadas em tecido) - indiferenciadas
Em células vegetais, estado caracterizado por células de forma isodiamétrica, com pouco ou nenhum vacúolo e núcleo grande.
Grande potencial de 
crescimento e de divisão, 
capacidade de regeneração em orgãos ou embriões
-CALOS
-CÉLULAS isoladas
CALOS
Meio sólido
Desdiferenciação celular
Crescimento anárquico nas três dimensões
Heterogeneidade morfológica e fisiológica
Cana-de-açúcar, Paula Cidade et al (2006) 
Fotografia de calo de Nicotiana tabacum
Produção de calos
EXPLANTE
Condições de iniciação de calos
Assepsia
Meio gelificado, placa de petri (20-25 mL, Ø 9 cm)
Obscuridade
Calor úmido: 25 – 28 °C
Balança hormonal adequada
Suspensões celulares
Meio líquido com agitação
Teoricamente : células livres em suspensão
Na prática : colônias microscopicas ou sub-macroscópicas de 5 a 200 células agregadas
Vacúolo, parede celular fina e arredondada
Células vegetais em um tecido diferenciado
Observação microscópica de suspensões celulares de trigo
Calos e suspensões celulares de Linum scrabelum
crescendo em MS + ANA (0.5 mg/L) e BAP (2 mg/L)
Produção de células em suspensão
Condições de obtenção de suspensões celulares
Meio líquido, erlenmeyer (100 mL/250 mL)
Agitação contínua (110-150 rpm)
Ajustamento do meio de cultura
Ex para células de tabaco : meio MS + 2,4-D 0,5 mg/L
Produção de metabólitos de interesse em raízes transformadas
= sistema alternativo as suspensões celulares, que podem possuir:
Produtividade as vezes baixa
Instabilidade genética
Produção de alguns metabólitos secundários dependendo do nível de diferenciação celular
Raízes transformadas (“hairy roots”)
=infecção provoca um fenótipo particular : grande número de raízes muito finas, alongadas (e ramificadas)
Produção de moléculas de interesse
Estabilidade genética 
Crescimento “rápido”
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Agrobacterium tumefaciens
Galha da coroa
2 tipos de bactérias
Agrobacterium rhizogenes
Síndrome das raízes em cabeleira
Estrutura da região do T-DNA de um plasmídeo Ti
Etapas da infecção:
transferência do T-DNA até 
o genoma nuclear da planta
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Taiz e Zeiger, 5ta ed
No laboratório:
acetoseringona
transferência sobre um meio bacteriostático
Cultura de raízes transformadas vs suspensão celular
Propriedades
Tipo de crescimento
Modelo de crescimento
Tempo de duplicação
Biomassa final
(massa seca/L)
Background genético
Formação inicial de produtos
Meio de crescimento
Localização do produto
Suspensões
Células simples-agrupadas
Desorganizadas : cada célula pode se dividir e se expandir
15 h-dia
30-60 g
Heterogeneidade
Geralmente fraca
Complexo + hormônios e vitaminas
Intracelular- extracelular
Raízes transformadas
Rede de ramificações
Divisão celular localizada; crescimento linear com ramificações laterais
36 h-dia
 30-60 g
Mais estável
Similar à planta mãe
Simples, sais et açúcar
Intra- extra-celular
Exemplos de metabólitos acumulados em raízes transformadas
Género
 
Nicotiana
Catharanthus
Cinchona
Duboisia
Datura
 
Beta
Lippia
Artemisia
Coreopsis, Bidens
Tagetes
Digitalis
Cassia
Panax
Chaenactis
Podophyllum
Linum
Lithospermum
Solanum
Metabólito
Alcaloide
Alcaloides piridínicos
Indoles
 
Tropano
 
Outros
Betalaina 
Sesquiterpenos
 
Poliacetilenos
Tiofenos
Glicósidos cardioactivos
Antraquinonas
Saponinas
Polyines
Lignanos
 
Naftoquinonas
Esteroides
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Algumas estratégias para aumentar a acumulação de metabólitos secundários
Otimizar a composição do meio
Fonte de carbono
Limitação em nitrogênio
Limitação em fosfato (Ex: Catharanthus)
Concentração em hormônios 
Otimizar outros fatores ambientais
	 luz, temperatura, pH, aeração
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4. Usar a elicitação (ESTRESSE)
Exploração de um mecanismo de defesa das plantas 
respondem ao ataque por fungos ou bactérias através da produção de fitoalexinas
Fatores para elicitação:
 	- homogeneizado de fungo
	- ácido araquidônico 	
	
	- Metil jasmonato
Elicitação das culturas in vitro para estimular a produção de metabólitos de interesse
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 Enhanced astragaloside production and transcriptional responses of biosynthetic genes in Astragalus membranaceus hairy root cultures by elicitation with methyl jasmonate
Biochemical Engineering Journal, Volume 105, Part B, 2016, 339–346
Elicitação de culturas de raízes transformadas de Astragalus membranaceus com metil jasmonato (MJ), ácido salicílico (SA) e ácido acetilsalicílico (ASA) foi conduzido para aumentar a biossíntese de astragalosídeo (AG)
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5. Adição de precursores
 	accessíveis, não tóxicos, não competidores
Ex: ornitina no meio de cultura de suspensões célulares de Datura innoxia (Solanácea)  maiores quantidades de escopolamina
Ex: igual para suspensões de Coffea arabica que convertem teobromina em cafeína
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Finalmente ....
Sequência na
optimização de um processo para a produção de metabólitos secundários
Seleção da planta por seu conteúdo de metabólitos secundários para iniciar cultivos in vitro 
Estabelecimento dos cultivos in vitro 
Optimização do meio de cultivo para produção
(por desenho fatorial por exemplo): nutrientes, precursores, elicitação, etc
Optimização em biorreatores: escalamento
Extração e purificação do produto
Produção viável comercialmente ?
3 exemplos clássicos de produção de metabólitos secundários in vitro :
As saponinas do ginseng
A siconina (naftoquinona) 
A berberina
Sucesso depende da alta produtividade (i.e. siconina) ou do alto valor do mercado (i.e. paclitaxel). 
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Bibliografia
LIVROS:
Taiz e Zeiger – 2013- Cap 13
Simões, C. M. O. Farmacognosia: do produto natural ao medicamento. Porto Alegre: Artmed, 2017
Proença da Cunha (Coordenador). Farmacognosia e Fitoquímica. Fundação Calouste Gulbenkian. 3a ed. Lisboa, 2010