Biotecnologia_micropropagação

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Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro 
Instituto de Florestas 
Departamento de Silvicultura 
MICROPROPAGAÇÃO 
Profa Evânia Galvão Mendonça 
evaniafloresta@hotmail.com.br 
Biotecnologia 
 
Biotecnologia é o desenvolvimento de processos biológicos , 
utilizando-se a técnica de DNA recombinante, cultura de 
tecidos e outros. Pode-se ser também o uso industrial de 
processos de fermentação de leveduras para produção de 
álcool ou cultura de tecidos para extração de produtos 
secundários. E ainda um processo tecnológico que permite a 
utilização de material biológico para fins industriais. 
 
Borém, 2001 
Cultura de Tecidos 
É a técnica que consiste em cultivar plantas ou 
parte de plantas em meio apropriado e asséptico. É 
portanto, um termo genérico, englobando as 
técnicas de cultivo de plântulas, embriões, órgãos e 
células “in vitro”. 
 
Totipotência Celular 
 
“Cada célula somática possui o potencial 
genético para reconstituir um organismo 
inteiro”. 
A teoria celular e o início da cultura de tecidos 
Uma única célula seria capaz de se multiplicar e dar origem a novas 
células 
 
“Única célula” deveria ser capaz de regenerar um organismo 
Proliferação de brotos em micropropagação 
Iniciação de calos em dicotiledôneas 
Formação de raízes a partir de calos 
Primeiro estádio da embriogênese 
Iniciação de calos em monocotiledôneas 
Formação de raízes em explantes 
 
Auxina Citocinina 
Alta 
Baixa 
Balanço entre auxina e citocinina influenciando o crescimento 
e morfogênese de plantas in vitro 
Alta 
Baixa 
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO DE CULTURA 
DE TECIDOS DE PLANTAS 
Sala de preparo de meio e solução estoque 
Sala de limpeza 
Área de manipulação asséptica 
Área para incubação de culturas 
Casa de Vegetação 
MEIOS NUTRITIVOS 
Função: Fornecer as substâncias essenciais para o 
crescimento 
Fotossíntese in vitro 
Componentes de Meios Nutritivos: 
 
1) Água – qualidade 
2) Macronutrientes – Amônio e nitrato 
 Amônio máximo 1/3 da quantidade 
MEIOS NUTRITIVOS 
Aminoácidos 
Função do Nitrogênio 
Triptofano 
Ácido 
indolacético 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
 
2) Macronutrientes 
 Fósforo inorgânico ou glicose-6-P; frutose-6-P 
 Potássio 
 Cálcio – absorção dificultada in vitro 
e ex vitro 
 Magnésio – importante de vias metabólicas que 
utilizam ATP 
 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
 
3) Micronutrientes 
o Manganês, Zinco, Boro, Cobre, Cloro e 
Molibidênio, Cobalto e Iodo Cobalto e Iodo 
Molibidênio: leva aumento da concentração de nitrogênio 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
 
4) Carboidratos 
o In vitro CO2; luz e teores de clorofila 
insuficiente 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
 
5) Vitaminas 
Tiamina (Vit B1): essencial na respiração – piruvato 
descarboxilase 
Ácido nicotínico: formação de alcalóides; NADP+ 
 Piridoxina (Vit B6): biossíntese de aminoácidos e 
transaminação de aminoácidos aromáticos - AIA 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
 
6) Mio-inositol 
 Incorpora a moléculas de fosfolipídios; 
conjugação com auxinas 
Ex vitro – formado pela ciclização da glicose 
In vitro – biossíntese limitada 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
7) Hormônios ou Reguladores de Crescimento? 
 Os hormônios são substâncias químicas naturais 
sintetizadas em pequena quantidade que regulam a 
atividade celular e influenciam os processos fisiológicos. 
 
 Reguladores de crescimento: normalmente empregado 
para compostos naturais ou sintéticos que exibem atividade 
no controle do crescimento e desenvolvimento da planta. 
 
 Os hormônios vegetais podem agir nas proximidades do 
local de síntese, mas também há caso de ação a longa 
distância. 
 
 Nos dois casos, as células alvo tem receptores 
específicos para os hormônios. 
 
 Concentração fisiológica- geralmente o local de maior 
concentração é o local de síntese. 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
MEIOS NUTRITIVOS 
Classe de reguladores: 
Auxinas 
Citocininas 
AIA – Ácido-3-indolacético 
ANA- Ácido naftalenoacético 
AIB- Ácido indolbutírico 
2,4-D- Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 
Cinetina- 6-Fururilaminopurina 
BAP- 6-Benzilaminopurina 
2ip- Isopenteniladenina 
Zeatina 
Tidiazuron 
AIA – Ácido-3-indolacético (instável) 
MEIOS NUTRITIVOS 
Classe de reguladores: 
Giberelinas 
Inibidores 
Ácido giberélico (GA3) 
ABA- Ácido abscísico 
Etileno Etileno, Etherphon, Ethrel 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
8) Misturas complexas 
 Água de coco, leite de coco. 
 
9) Carvão ativado 
 Estimula enraizamento, diminuir intoxicação e 
Adsorção de substâncias tóxicas. 
 
MEIOS NUTRITIVOS 
Componentes de Meios Nutritivos: 
10) Ágar e semelhantes 
 Agente gelificante 
 
 PH e outras características dos Meios 
Queda de 1,3 unidades durante autoclavagem 
 Estocagem acidifica 
 Acidificação influencia na absorção de nutrientes 
Formulação do meio de cultura MS 
(Murashige e Skoog, 1962) 
Fatores que afetam o cultivo in vitro 
 
• Genótipo 
 
• Fonte de Explantes 
 
• Condição da Cultura 
 
Cultivar 
Espécie 
Variedade 
Tecido Utilizado 
Maturidade 
Estado Fisiológico 
Meio de Cultura – nutrientes, C, reguladores 
Luz – intensidade, fotoperíodo, qualidade 
Temperatura 
Vasilhame – tamanho, trocas gasosas 
Cultura de Tecido Vegetal 
Explante 
 
 Idade 
 Nutrição 
 Estado fitossanitário 
 
Assepsia dos Explante 
 Hipoclorito de Sódio (NaOCl) 
 Hipoclorito de Cálcio (CaOCl2) 
 Tween 20 
 Benlate 
 Claforam 
 
Fluorescente – 680 nm 
 
Incandescente – 450-550 nm 
Espectro de absorção para LEDs 
Micropropagação 
 A micropropagação, ou propagação vegetativa in vitro, é 
uma das mais utilizadas aplicações da cultura de tecidos; 
 
 Utilizada principalmente à espécies de difícil propagação 
pelos métodos convencionais, permitindo a obtenção de 
grande número de plantas sadias e geneticamente 
uniformes em curto período de tempo; 
 
 
 
Micropropagação 
Estabilização 
Multiplicação 
Enraizamento 
Aclimatização 
Etapas e Vias de Regeneração in vitro 
Explantes 
Meristemáticos 
Direta 
(Adventícia) 
Desenvolvimento 
direto de 
explante 
Indireta 
Calo* 
Brotos ou 
raízes 
Explante 
Micropropagação 
Micropropagação - Direta 
Micropropagação - Indireta 
Micropropagação - Biorreator 
Micropropagação - Biorreator 
Micropropagação - Biorreator 
Micropropagação - Biorreator 
Micropropagação - Biorreator 
Desinfestação em 
paraformoldeído por 40 min 
MS (Murashige e Skoog, 1962) 
Viveiro 
1° Subcultivo - 
(G1) 
G1 (6 - 8 semanas) 
Meio de Multiplicação 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Meio de Multiplicação 
1° Subcultivo - (G1) 
2° Subcultivo - (G2) repetido (G3, G4 ...) 
Enraizamento 
30 dias 
1° Subcultivo - (G1) 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Meio 
Enraizamento 
1° Subcultivo - (G1) 
Aclimatização - casa de vegetação (21 dias) 
 - casa de sombra (7 dias) 
 
Minijardim Clonal do viveiro 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Enraizamento - realizado 
mensalmente 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Viveiro 
(VM 02 e VM 
04) 
Geração 1 Geração 2 Geração 3 .... 
Subcultivos in vitro 
Enraizamento in vitro 
Aclimatização 
Enraizamento das 
gerações de 
subcultivo 
Enraizamento ex vitro (VM 02) 
Viveiro G1 G2 G3 G4 Viveiro G1 G2 G3 G4 
A B 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Enraizamento ex vitro (VM 04) 
Viveiro G1 G2 G3 Viveiro G1 G2 G3 
A B 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Micropropagação - Rejuvenescimento 
Micropropagação- Organogênese 
Calo- grupo ou massa de células de 
crescimento desordenado. 
Torres et al., 2000 
Via de desenvolvimento na qual órgãos vegetais (brotos, raízes) são 
induzidos a diferenciação a partir de uma ou várias células. 
Micropropagação - Embriogênese 
Via de desenvolvimento na qual a formação de embriões é induzida 
de células somáticas 
Direto Indireto 
Representação esquemática das várias fases de desenvolvimento do 
embrião zigótico. Adaptado de West e Harada, 1993 e Capron et al. (2009). 
Mano, 2013 
Mano, 2013 
Células embriogênicas e não embriogênicas de eucalipto 
Micropropagação - Embriogênese 
PERSPECTIVAS 
ECS Desenvolvimento dos embriões 
Germinação dos embriões Regeneração de plantas 
Semente Sintética