RELÁTORIO DE AULA PRÁTICA INOCULAÇÃO PRONTO

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RELÁTÓRIO DE AULA PRÁTICA
INOCULAÇÃO POR ESTRIAMENTO DE MICRORGANISMOS EM ALIMENTOS
(Aula 1)
Sumário
Introdução.............................................................................................. 1
Objetivo..................................................................................................2
Materiais utilizados............................................................................... 3
Metodologia.......................................................................................... 4
4.1 Diferenciação entre Ágar Nutriente e Ágar MacConkey.................5
Resultados e Discussões................................................................... 6 a 9
Conclusão.............................................................................................10
Referências bibliográficas....................................................................11
Introdução 
A Microbiologia estuda os seres microscópicos em vários pontos de vista como fisiologia, taxonomia, reprodução, morfologia e também a interação com o meio ambiente e com outros seres vivos. Esse grupo de seres microscópicos inclui: bactérias, fungos (leveduras e fungos filamentosos), protozoários, algas microscópicas. Neste grupo também estão incluídos os vírus, organismos acelulares que algumas vezes são considerados a fronteira entre seres vivos e não vivos.
O estudo desses microrganismos requer um isolamento prévio e a identificação dos mesmos, avaliando suas características, para isso são utilizados diversos meios de culturas. Os meios de cultura são uma preparação química, com a mistura de alguns nutrientes essenciais que irão ajudar os microrganismos em seu crescimento e multiplicação.
“É de grande importância ter conhecimento do potencial do crescimento de cada meio de cultura que analisamos e relacionar ao perfil bacteriano esperado para cada tipo de material. Outros tipos de componentes também podem ser encontrados em um determinado meio de cultura para um determinado microrganismo. Cada tipo de meio é indicado para uma função e um microrganismo específico. Alguns meios só tem o objetivo de nutrir e fazer o crescimento do organismo, já outros, inibem um organismo e até indicam o valor do seu pH.” (SILVA et al., 2017)
 Normalmente, os meios de cultura são constituídos de açúcares, fósforos, nitrogênios e outros sais minerais – que são fontes de carbono e energia -. O crescimento e multiplicação de microrganismos nos variados meios de cultura, disponibiliza informações para chegarmos ao reconhecimento desses organismos.
Para isolar o microrganismo e começar sua análise realizamos a inoculação por estriamento simples, um método que realiza a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, ocorre a transferência de um número de organismos de um meio de cultura ou material a ser analisado para outro meio de cultura, com o propósito que os microrganismos ali presentes se desenvolvam e permitam a identificação. Para assegurar que apenas os microrganismos desejados sejam inoculados, são utilizadas técnicas assépticas: procedimentos que devem ser seguidos visando a não contaminação de materiais e meios de culturas.
Objetivo
A realização de inoculações de microrganismos presentes em alimentos coletados na Expofeira. 
Materiais utilizados
 Tubos com tampas de rosca 
 - Continham um meio nutritivo onde os alimentos coletados foram armazenados.
 Placas de Petri 
- Ágar nutriente (4 unidades)
- Ágar MacConkey (2 unidades)
 Swab
Bico de Bunsen 
- Efetuar esterilização de objetos de uso do laboratório e manter o ambiente de trabalho asséptico.
 Álcool 70% e papel toalha 
 - Higienização e desinfecção da bancada e do bico de Bunsen.
Amostras: Camarão, frango do beiju, Batata frita, faca que cortava o acarajé, molho de pimenta e Cenoura
Papel filme
-Embalar as amostras para serem armazenadas.
 Estufa bacteriológica (T°C 37)
 Geladeira
Metodologia
No dia 27 de setembro, nos dirigimos ao laboratório para a realização do método de inoculação dos microrganismos presentes em alimentos utilizando as placas de Petri. Antes de iniciar nossas atividades ocorreu a higienização das mãos – água, sabão e álcool - dos realizadores dos procedimentos. Em seguida houve uma divisão em etapas do processo: A primeira etapa foi a desinfecção e higienização da bancada e do Bico de Bunsen com o álcool 70% e o auxílio do papel toalha. A limpeza ocorria de maneira que o papel toalha não fosse utilizado mais de uma vez no mesmo lado e o sentido da limpeza acontecia com movimentos em linha reta limpando a bancada do centro as extremidades. 
Dando seguimento a segunda etapa, ligou-se o Bico de Bunsen e foi percebido que a chama estava amarelada não possuindo uma temperatura suficiente para o aquecimento - pela falta de oxigênio e presença de impurezas -, para conseguir uma chama com maior temperatura, a entrada de ar deve ser aberta até que a chama fique azul permitindo a entrada de oxigênio, tornando a queima mais eficiente. A utilização do bico de Bunsen tinha o objetivo de flambar a boca dos tubos com tampas de roscas que continham meio nutritivo para o alimento que foi coletado. Este também tinha o objetivo de propiciar um ambiente asséptico ao redor de todo o espaço da bancada onde estávamos trabalhando, diminuindo os riscos de contaminações das amostras pelos microrganismos dispersos no ar. 
Na terceira etapa com o auxílio de um swab, que deve ser aberto do lado oposto a extremidade que possui o algodão, iniciou-se o procedimento. Abriu-se o tubo que continha a amostra – Ex: batata frita -, flambou-se a boca do mesmo, inseriu o swab na amostra fazendo a coleta e flambou-se novamente a boca do tubo para que não ocorresse contaminações e o fechou. Em seguida, com o swab fez a inoculação por estriamento na Placa de Petri que continha o Ágar nutriente ou o Ágar MacConkey, com movimentos em zig-zag, utilizando a superfície da placa da melhor forma possível, respeitando o limite. Logo após fechou-se a placa e o swab foi descartado. Esse processo ocorreu com todas as outras amostras – a faca que cortava o acarajé, molho de pimenta, cenoura, frango do beiju e o camarão -, sempre utilizando um novo swab.
Ao terminar o processo com todas as amostras, as placas de Petri foram embaladas em papel filme e armazenadas na estufa bacteriológica numa temperatura de 37°C simulando a temperatura do corpo humano, durante 24 horas e depois as mesmas foram colocadas na geladeira. A retirada da estufa para a geladeira, tem como objetivo a diminuição da temperatura para reduzir o tempo de geração, já que quanto menor o tempo de geração, maior a quantidade de microrganismos. Os microrganismos que foram inoculados entraram na Fase de Latência “Lag”, onde os mesmos estão se adaptando ao novo meio, a multiplicação pode ou não ocorrer pelo menos em condições de equilíbrio. Durante esse período observasse a produção de compostos que não se encontram no meio de cultura, mas que podem ser essenciais para o crescimento e multiplicação desses organismos.
Diferenciação entre Ágar nutriente e Ágar MacConkey
Os meios de cultura são composições de substâncias nutritivas que permitem o desenvolvimento dos organismos microscópicos. Como exemplo, podemos destacar o Ágar, um hidrocoloide gelatinoso rico em carboidratos, ideal para cultura sólidas, pois permite o crescimento das células formando colônias. 
 A diferença das placas Ágar Macconkey e o Ágar Nutriente é que o Ágar Macconkey caracterizado visualmente pela cor rosa avermelhado, é um meio de cultura destinado ao crescimento de bactérias Gram-negativas. Isso acontece porque ele possui na sua constituição uma substância que inibe o crescimento de microrganismos Gram-positivos: o cristal violeta. A inibição ocorre em especial aos enterococos e estafilococos. Asua concentração de sais de bile é baixa se ocorrer a comparações com outros meios, por isso não é tão seletivo para Gram-negativos. Ainda seleciona cuidadosamente as colônias fermentadoras de lactose, que são visualmente representadas na cor rosa e as colônias não fermentadoras de lactose são incolores.
 A classificação de Gram-positivas e Gram-negativas refere-se a parede celular que as bactérias apresentam em sua composição, sendo possível a identificação pelo método de Coloração de Gram, procedimento que realiza retenção de cor baseado nas características apresentadas pela parede celular das mesmas, fazendo com que ocorra diferenciação entre Gram-positivas e Gram-negativas. As bactérias Gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa – dissacarídeos e aminoácidos – do que as Gram-negativas que contém uma camada de lipopolissacarídeo – lipídeos e polissacarídeos – como parte de sua parede celular.
 Já o Ágar Nutriente, possui a cor original branco opalescente, é um meio relativamente simples e tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia. Pode ser utilizado com a finalidade de análises de água, alimentos e leite, como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras. O uso mais frequente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente e observação da esporulação de espécies de bacilos Gram-positivos.
Resultados e discussões 
No dia 4 de outubro, voltamos ao laboratório e fizemos a abertura das placas de Petri que ficaram armazenadas durante 24 horas na estufa bacteriológica numa temperatura de 37°C e depois foram transferidas para a geladeira. No contador de colônias analisarmos as amostras com as seguintes características: Odor- Adocicado, ácido ou podre -, Número de UFC – Unidade de formação de colônia, unidade de medida usada para estimar o número de microrganismos capazes de se multiplicarem -, a coloração e se existiam contaminações. As colônias deveriam estar seguindo a marcação feita pelo swab na técnica de inoculação por estriamento, qualquer colônia que estivesse presente na placa fora do caminho realizado pelo swab, seria uma contaminação externa. Os resultados foram colhidos e tabelados abaixo:
	Amostra 1: Camarão
	Ágar Nutriente
	Odor
	 Podre
	N° de UFC 
	 Indeterminado
	Coloração
	 Amarelada
	Contaminação
	 Três 
 
Interpretação: A amostra apresentava odor forte e podre, com uma quantidade indeterminada de colônias que não conseguimos quantificar. Os microrganismos possuíam cor amarelada e tamanhos diferentes, também era possível perceber a presença de colônias ramificadas que não seguiam o caminho percorrido pelo swab na inoculação por estriamento, o que significa que ocorreram contaminações externas.
Segundo (FAO, 2010) conforme citado por Santiago et al. (2012),
“O pescado pode ser contaminado com o mais amplo e variado grupo de microrganismos, bem como por resíduos de produtos químicos, através de águas contaminadas ou poluídas dos estuários e das bacias pesqueiras. O pescado vivo, por sua vez, apresenta contaminação bacteriana principalmente na pele, brânquias e escamas, passando aos demais tecidos após a morte do animal. Desta forma, a manipulação indevida e a não observância de medidas higiênicas durante o transporte, manuseio e conservação podem facilitar o desenvolvimento dos patógenos, presentes no próprio pescado ou provenientes do ambiente” 
O pescado é um alimento muito susceptível a deterioração devido sua quantidade de água livre, composição química, teor de gorduras que são hidrolisadas facilmente e o pH mais próximo a neutralidade. A contaminação microbiana do pescado é influenciada pela microbiota do próprio peixe ou fruto do mar. Não só as bactérias, mas também os fungos podem contaminar um pescado. 
	Amostra 2: Faca que cortava o acarajé
	Ágar MacConkey
	Odor
	Podre
	N° de UFC
	Indeterminados
	Coloração
	Rosa
	Contaminação
	Não encontrada
Interpretação: Foi observado na amostra um grande número de colônias, que não conseguimos determinar. As colônias foram inoculadas no Ágar MacConkey e tinham coloração rosa, sendo portanto fermentadoras de lactose, apresentavam odor podre e nenhuma contaminação externa foi encontrada.
Os alimentos comercializados em locais públicos, podem oferecer riscos à saúde dos consumidores, devido a problemas como a ausência de uma infraestrutura adequada, más condições de higiene dos equipamentos, falhas higiênico-sanitárias dos vendedores o que pode comprometer a segurança dos alimentos e causar doenças.
	Amostra 3: Molho de pimenta
	Ágar Nutriente
	Odor
	Adocicado
	N° de UFC
	Indeterminado
	Coloração
	Branco
	Contaminação
	 Não encontrado
Interpretação: A amostra apresentou odor adocicado, coloração esbranquiçada de tamanhos diferentes. Com várias colônias no caminho percorrido pelo swab e sem contaminações. 
	Amostra 4: Batata frita
	Ágar Nutriente
	Odor
	Ácido
	N° de UFC
	Uma média de 10 a 20 colônias
	Coloração
	Esbranquiçada
	Contaminação
	Não encontrada
Interpretação: Observou-se o crescimento em média de 10 a 20 colônias no caminho percorrido pelo swab na placa de Petri, não sendo encontradas contaminações. Possuía coloração esbranquiçada e um odor ácido.
	Amostra 5: Cenoura
	Ágar MacConkey
	Odor
	Podre
	N° de UFC
	Indeterminado
	Coloração
	Amarelada
	Contaminação
	Indeterminadas
Interpretação: A amostra apresentou odor podre, com grande número de colônias, sendo consideradas incontáveis, pois tomou toda a extensão da placa de Petri, percebemos assim que ocorreram contaminações externas. As colônias eram amareladas e de tamanhos diferentes.
Os vegetais em sua maioria possuem pH ácido – 5,0 a 7,0 -, o que favorece o aparecimento de infecções bacterianas. A maioria dos microrganismos presentes nos vegetais são saprófitos – seres que obtém seus nutrientes a partir de tecidos mortos ou em decomposição -. 
	Amostra 6: Frango do beiju
	Ágar Nutriente
	Odor
	Adocicado
	N° de UFC
	Indeterminado
	Coloração
	Esbranquiçada
	Contaminação
	Não encontrado
Interpretação: Ao ser observado, identifica-se um número incontável de colônias com um odor adocicado e coloração esbranquiçada e de tamanhos diferentes, sem contaminações.
As carnes bovinas e a carne do frango, são contaminadas por microrganismos quando: possuem contato com a pele, água, materiais utilizados no abate e no armazenamento desses alimentos que serão ingeridos. É importante que esse tipo de alimento seja armazenado em refrigeradores, em temperaturas baixas que irão inibir o crescimento de boa parte dos microrganismos contaminadores.
Conclusão
Com a realização do processo de inoculação, a análise e as discussões dos resultados foi percebido que todas as amostras coletadas na nossa visita a Expofeira possuíam contaminações e que ocorreram falhas na segurança desses alimentos, como por exemplo na higiene dos manipuladores, a exposição dos alimentos a diversos tipos de contaminações vinda do ar, água e dos ambientes e falhas no armazenamento. A depender dos microrganismos encontrados existia a possibilidade de causar doenças nos seus consumidores. A técnica de inoculação por estriamento tem como objetivo a contaminação proposital de um novo meio de cultura para promover o isolamento desses microrganismos para a verificação do seu crescimento, uma avaliação de suas características e a identificação e reconhecimento dos mesmos.
 Durante nossa prática, observamos o crescimento das colônias, avaliamos suas características de acordo com seu odor, número de colônias, coloração e se existiam contaminações externas vindas do ambiente.
Referências bibliográficas 
SILVA, Mariana deCamargo et al. PREPARAÇÃO DE MEIO DE CULTURA, PROCESSO DE INOCULAÇÃO PELO PROCESSO DE SWAB, CRESCIMENTO DE MICROORGANISMOS DENTRO DA INCUBADORA, CONTAGEM DE MICRORGANISMOS. TatuÍ, Sp, 2017. 29 p. Disponível em: <https://pt.scribd.com/document/361615637/Microbiologia-Meio-de-Cultura-Inoculacao-Crescimento-de-Microrganismos>. Acesso em: 15 nov. 2018.
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