separação por técnicas cromatograficas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SEPARAÇÃO DE PRODUTOS NATURAIS POR TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lucas Renan de Souza Gomes RA: 99525 
Lucas Gabriel de Paula RA: 108874 
Débora Figueiredo Uhdre RA: 104895 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Maringá, maio de 2019 
 
 
 
1.INTRODUÇÃO 
 
Desenvolvida por Mikhail Semenovich Tswett, botânico russo, em 1900, a primeira técnica 
cromatográfica consistiu em separar pigmentos de plantas através de uma coluna de 
absorção contendo carbonato de cálcio. Posteriormente em 1941, os pesquisadores Archer 
John Martin e Richard Laurence Millington Synge, desenvolveram o método cromatográfico 
utilizado atualmente que emprega duas fases líquidas. 
Em linhas gerais a cromatografia é uma técnica analítica de separação e purificação que 
ocorre quando determinado líquido (mistura de interesse para separar) passa por duas 
fases: uma estacionária e outra móvel. De acordo com interações e afinidade molecular os 
componentes da mistura se dissociam entre si quando o líquido passa por essas duas 
fases, haja vista a interação entre os componentes e as fases. É importante ressaltar as 
definições de fase móvel e fase estacionária, uma vez que são termos essenciais para o 
entendimento das técnicas cromatográficas. 
A fase móvel é um líquido ou um gás a qual “arrasta” as substâncias que queremos isolar 
por interação molecular, os componentes que queremos isolar apresentam mais afinidade 
com a fase móvel. Já a fase estacionária ou como também é chamada, fase fixa, a 
substância que está sendo separada fixa-se na superfície de um material adequado para 
visualização, como um papel filtro por exemplo. Todos os tipos de técnicas cromatográficas 
se diferem pelo comportamento da mistura a ser separada entre a fase móvel e a fase fixa. 
Podemos exemplificar este conceito pensando em uma mistura entre pó de ferro e pó de 
basalto sobre a superfície de uma mesa, se aproximarmos um imã sobre toda a extensão 
da mistura, grande parte do ferro será atraído ao superfície do imã. Analogamente, 
podemos associar o ímã como sendo a fase móvel e a superfície da mesa a fase fixa. 
Existem vários tipos de técnicas cromatográficas que se diferenciam de acordo com o 
sistema cromatográfico: coluna e planar, quanto o tipo da fase fixa e móvel: gasosa ou 
líquida, e também de acordo com o tipo de separação: afinidade, adsorção e etc. 
Para a prática realizada, é interessante ressaltarmos a cromatografia em camada delgada 
pois foi esta utilizada para separação da mistura. Coloca-se na fase fixa (placa de sílica) a 
mistura a ser separada, 1 cm mais ou menos da borda da placa. Dentro de uma cuba 
contendo o líquido que irá atuar como fase móvel, o papel é posicionado de modo que a 
mistura colocada não toque o líquido que irá realizar o “arraste” . Conforme a fase móvel 
sobe no papel por capilaridade percebe-se que as substâncias vão seguindo o líquido, por 
interação. 
Dependendo da força entre a interação substância – fase móvel, a “corrida” é mais lenta 
quando essa interação for forte e rápida quando fraca. Podemos definir a partir dessas 
informações o conceito de Rf (fator de retenção). Ao final da corrida cromatográfica, tem-se 
a distância total percorrida pela fase móvel e vários pontos obtidos na fase fixa, que dizem 
respeitos aos diferentes compostos da mistura inicial. A razão entre a distância percorrida 
pelo componente e a distância total percorrida pela fase móvel é chamada de fator de 
retenção. 
Rf = Dc/Dfm 
Dc = distância percorrida pelo componente 
Dfm = distância percorrida pela fase móvel 
Quanto maior for o fator de retenção, maior a distância percorrida pelo componente, logo 
mais fraca a interação com a fase móvel, e vice-versa. 
 
 
 
1.2 PROPRIEDADES DOS COMPOSTOS 
 
HEXANO 
 
Massa molecular: 86,14 g/mol 
Ponto de ebulição: 68,7°C 
Ponto de Fusão: -94°C 
Densidade: 3,0 
Solubilidade: Solúvel em água 
 
 
 
ACETONA 
 
Massa molecular: 58,08 g/mol 
Ponto de Ebulição: 56,1°C 
Ponto de fusão: -94,6°C 
 
 
 
 
 
CLOROFÓRMIO 
 
Ponto de fusão: -63°C 
Ponto de ebulição: 61,5°C 
Toxicidade: Aguda, pode causar danos graves se inalado. 
Fórmula molecular: CHCl3 
 
 
 
 
 
SULFATO DE SÓDIO ANIDRO 
 
Massa molar: 142,04 g/mol 
Densidade: 2,68 g/cm3 
Ponto de fusão: 884°C 
Solubilidade em água: 4,76g/100mg 
 
 
 
 
 
3. OBJETIVOS 
A prática tem como objetivo realizar a separação de compostos presentes em algumas 
folhas, utilizando o método de cromatografia em camada delgada. 
 
4. Procedimento Experimental 
 
4.1 Preparação do extrato: 
Para preparação do extrato utilizado na análise foi necessário algumas folhas de uma planta 
qualquer, essas folhas foram postas em um almofariz e com o auxílio de um pistilo 
amassamos as folhas junto a uma mistura de hexano com acetona, após triturar bem essa 
mistura, a mesma foi filtrada, para isso utilizamos um papel filtro e um funil, a mistura filtrada 
foi diretamente para um funil de separação líquido-líquido, onde junto a essa mistura foi 
adicionado 10 ml de água, fez se a separação, descartou se a fase aquosa e repetiu o 
processo com mais 10 ml de água, a fase orgânica que permaneceu no funil de separação, 
foi transferida para um Erlenmeyer onde foi adicionado sulfato de sódio anidro, agente 
secante que auxilia na retirada de água, após alguns instantes, o sulfato de sódio fez seu 
papel, então a substância foi submetida a uma nova filtração, onde a fase orgânica foi 
captada em um balão de fundo redondo que se encaixa perfeitamente no aparelho 
rotaevaporador que há no laboratório, a substância ebuli mais rápido e a uma temperatura 
mais baixa devido ao vácuo que a máquina proporciona, e após alguns minutos a 
substância se reduz e fica mais concentrada, que é o objetivo. 
 
 
 
 4.2 Desenvolvimento do cromatograma: 
Após a evaporação, preparou-se uma cuba, utilizando um béquer e um papel filtro. 
Dentro da mesma, foram colocados cerca de 30 mL de clorofórmio, tapamos o sistema 
com um vidro de relógio e reservou até o preparo da placa. 
Para a montagem da placa utiliza-se um tubo capilar para fazer a aplicação da substância 
na fase estacionária, a substância foi aplicada em três pontos da placa com diferentes 
concentrações, e em seguida a placa foi posta dentro da cuba tomando o cuidado para que 
o solvente não ultrapassasse os pontos. Ao final da corrida, a placa foi retirada e a 
frente do solvente foi marcada. O solvente na placa evaporou e então observamos as 
manchas resultantes, feito isso, preparou-se outra cuba, agora contendo uma mistura de 
clorofórmio e acetona devidamente preparada seguindo as proporções propostas (9:1) e 
então repetimos o processo com a mesma placa. 
4.3 Cromatografia da cafeína: 
Primeiramente, montamos uma cuba do mesmo modo que o experimento anterior, 
Adicionou-se uma pequena quantidade de clorofórmio nos frascos contendo a cafeína 
padrão, a cafeína extraída no experimento da aula anterior e acafeína proveniente de 
um analgésico comprimido. Aplicou-as com um capilar na placa de sílica. Ao término 
da corrida, removeu-se a placa e utilizou-se o revelador Dragendorff para tornar os 
compostos visíveis. 
 
 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Houve a aplicação de três pontos sobre a placa de sílica (polar), sendo a primeira 
em menor concentração, a segunda em concentração intermediária e, a terceira em 
maior concentração. Porém só calculamos o Fator de Retenção (Rf) apenas para o 
ponto em que a presença dos componentes da planta foi percebida com maior 
facilidade, facilitando na mensuração da distância percorrida por cada componente. 
Através da cromatografia foi possível notar a presença de xxx principais pigmentos 
presentes na planta, os quais estão dispostos na tabela 1 a seguir: 
 
Tabela 01. Pigmentos identificados no processo de extração 
 
PIGMENTOS COR 
B-caroteno Amarelo-laranja 
Feofitina A Cinza 
Feofitina B Cinza claro 
Clorofila A Verde-azulado 
Clorofila B Verde 
Xantofilas Amarelo 
 
5.2 Cromatograma com a utilização de clorofórmio como eluente: 
 
 
Ao término da primeira corrida, foi possível observar que a amostra de B-caroteno 
que apareceu como uma mancha alaranjada, interagiu mais com o eluente, percorrendo 
uma distância maior em relação às demais na placa de sílica. Logo, podemos 
afirmar que o Betacaroteno é o pigmento mais apolar dos seis observados. Em 
contrapartida, as amostras de xantofilas que aparecem como manchas amarelas e 
clorofila a e b, como manchas verdes, interagiram mais com a fase estacionária, 
percorrendo uma menor distância na placa. Dessa forma, foi possível inferir que o 
caráter polar é maior, em ordem decrescente, nos pigmentos de xantofila, clorofila b e 
clorofila a. Os pigmentos de feofitina a e b ficaram posicionados entre a clorofila a e o 
B-caroteno. Portanto, ambos apresentam caráter polar maior que o B-caroteno e 
menor que a clorofila a, sendo que a feofitina a é menos polar que a feofitina b, pois 
percorreu uma distância menor na placa. 
 
Ao preparar uma mistura de clorofórmio e acetona, aumentamos a polaridade da substância 
a qual submetemos novamente a placa para uma nova corrida, isso proporcionou às 
xantofilas, clorofilas a e b e feofitinas a e b uma maior interação com a fase móvel, 
assim, estas substâncias apresentaram uma melhor distribuição na placa, em 
comparação com a distribuição obtida na primeira corrida, visto que foi possível 
diferenciar as clorofilas e as feofitinas. 
Considerando que a distância percorrida pela frente do solvente foi de 
aproximadamente 7,3 cm, calculamos a distância de cada substância presente na 
aplicação de maior concentração através do fator de retenção (Rf) , cujos dados 
estão dispostos na tabela 2 abaixo. 
Tabela 2 – Fator de retenção dos pigmentos observados na cromatografia com eluente 
clorofórmio. 
 
 
PIGMENTOS FATOR DE RETENÇÃO (cm) 
B-caroteno 0,79 
Feofitina a 0,54 
Feofitina b 0,52 
Clorofila a 0,32 
Clorofila b 0,20 
Xantofilas 0,13 
 
Observando os dados obtidos é possível ver que procede a informação de que a fase 
estacionária por ter caráter mais polar, retém substâncias polares, assim como também é 
possível constatar que a fase móvel por ser Apolar leva consigo as substâncias apolares 
que tem mais dificuldade para se associar a placa fazendo com que a mesma percorra um 
caminho maior, e vemos isso no fator de retenção, compostos mais polares ficam mais 
retidos n a placa e apresentam menores valores de Rf, enquanto os menos polares 
 
 
(ou mais apolares) percorrem maiores distâncias e apresentam maiores valores de Rf. A 
adição de clorofórmio e acetona a o meio também proporcionou uma melhor 
redistribuição dos componentes que haviam interagido pouco com a fase móvel, os 
quais são, as xantofilas, clorofilas a e b e feofitinas a e b. 
 
 5.3 Cromatografía de cafeína 
Como a amostra de cafeína estava em estado sólido, utilizamos cetona para solubilizar as 
amostras que eram, uma amostra padrão, uma amostra proveniente de uma pílula de 
analgésico e a amostra proveniente do produto de aulas passadas. 
Após diluir todas as amostras, com o auxílio de um tubo capilar, foi disposta em uma placa 
placa de sílica uma quantidade de cada uma das substâncias contendo a cafeína, essa 
placa foi colocada dentro de uma cuba com solvente para realizar a corrida. Após o término 
da corrida, foi muito difícil notar a separação, pois havia ficado incolor, e em razão disso, 
foi necessária a utilização do revelador Dragendorff. 
Quando o cromatograma foi disposto em uma câmara na presença do revelador 
Dragendorff, notou-se a mudança de coloração das três amostras, as quais alteraram 
para uma coloração predominantemente amarronzada. Além disso, por ter possibilitado 
a revelação da amostra pura, tem -se que este revelador também proporciona a 
identificação de pureza da substância. Sendo assim, para a revelação de alcalóides, por 
exemplo, a cafeína, é indicada a utilização do revelador Dragendorff. 
 
 
 
6. CONCLUSÃO 
Com este experimento, pode-se afirmar que através da cromatografia em camada 
delgada é possível visualizar e identificar alguns pigmentos presente na planta, como 
o betacaroteno, as feofitinas, as clorofilas e as xantofilas. Além disso foi possível 
conferir a utilização da cromatografia em camada delgada para determinar a pureza 
dos compostos isolados como no caso da cafeína. Como também a necessidade de 
utilização de reveladores em substâncias incolores. 
 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
1- Degani, A. L. G.; Class, Q. B.; Vieira, P. C. – Cromatografia um breve ensaio. 
Química Nova na Escola, nº 7, p. 21-25 Maio 1998. 
2 -Silva, V. A., Almeida, T. S., d e Oliveira, J. E., Milagre, H. M., Nascim ento, I. R. 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA. UNESP, 2013 
 3-http://www.iq.usp.br/wjbaader/qfl2343/Coloquio_CCD_2013.pdf 
4-Bonafé, C.; Oliveira, C.; Lima, G. Z.; Cavagni, G.; Rodrigues, J .; Mistura, C. M., 
Hermes, T . A. R. Produção de tintas com a utilização de pigmentos vegetais: 
favorecendo a abordagem interdisciplinar no ensino de Química. EDEQ n. 33, 2013 
5-N. M.; Canterle, L. P .; Can to, M. W .; Hecktheuer, L. H. H. As clorofilas. Ciência 
Rural, Santa Maria, v.35, n.3, p.748-755, mai -jun, 2005 
6-Flavonóides. Disponível em: <http://www.infoescola.com/bioquimica/flavonoides/>.