1 Extração de DNA bacteriano CTAB

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Ano / Semestre: 2019.1 
Disciplina: Biotecnologia 
Curso: Biomedicina 
Professora: Natália F. Romão 
 
Roteiro de aula prática 1: Extração de DNA bacteriano – Método CTAB 
(Método: OLIVEIRA, 2002) 
 
 Materiais: 
 
- Solução CTAB 
- NaCl 5M 
- Etanol absoluto gelado 
- Cloforormio: álcool isoamilico (24:1) 
- TE (Tris-HCl 10 Mm, Edta 1mM, pH 8,0) 
 
 Preparo das Soluções 
 
Solução CTAB/NaCl Qtd 
CTAB (Hexadecylytrimetil 
ammonium bromide) 
10g 
NaCl 4,1 g 
Água destilada ± 80 mL 
Volume final 100 mL 
 
Adicionar lentamente o CTAB e aquecer a 65º C para dissolver. Ajustar o volume p/ 100 Ml. 
 
 
Tampão TE 
Reagente Qtd 
Tris base 0,121g 
EDTA 3,72g 
Volume final 1000mL 
 
- Dissolver o Tris e o EDTA em banho-maria com agitação em 800 mL de H2O destilada. 
Aquecer para melhor dissolução dos cristais 
- verter a solução em um balão volumétrico e completar para 1000 mL com água destilada. 
- Ajustar o pH para 8,0 
- Autoclavar 
- Distribuir em frascos para utilização. 
 
NaCl 5M 
Reagente Qtd 
NaCl 7,3g 
Volume final 25mL 
 
 Procedimento: 
 
1. Tranferir 250 µl da amostra líquida para um tubo. 
 
 
2. Adicionar 100 µl de NaCl 5 M e 100 µl de CTAB pré-aquecido a 65ºC. 
3. A suspensão é agitada por 10 segundos até obter um aspecto leitoso. 
4. Incubar a 65ºC por 10 min 
5. Adicionar 750 µL de clorofórmio-álcool-isoamílico (24:1), agitando-se por dez segundos com 
movimentos leves. 
6. Centrifugar por 6 min a 10000 rpm cinco minutos, a 16.000 rpm. 
7. Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar 450 µL de etanol absoluto a -20°C, 
8. Incubar durante dez minutos a -20°C. 
9. Em seguida centrifugar durante vinte minutos a 10.000 rpm, eliminando-se o álcool e 
acrescentando-se 500 µL de etanol a 70% em temperatura ambiente, seguindo-se o mesmo 
procedimento de centrifugação anteriormente citado. 
10. O álcool foi eliminado novamente e o microtubo contendo o pellet submeter a secagem a 56 
°C no banho seco. 
11. Após a completa secagem do pellet, adicionaram-se 50 µL de tampão de diluição (10 mM 
Tris-HCL, 1 mM EDTA) pH 8,0 previamente aquecido a 56°C. 
12. Manter as amostras de DNA em temperatura ambiente por vinte minutos e posteriormente 
armazenadas à temperatura de -20°C até sua utilização na PCR. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referência 
OLIVEIRA, D. E. Infecção pelo vírus de Epstein-Barr (EBV) e vírus do papiloma humano (HPV), 
expressão da proteína p53 e proliferação celular em carcinomas de nasofaringe e laringe. 2002. 
117 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2002. 
Disponível em: <http://www.athena.biblioteca.unesp.br/exlibris/bd/bbo/33004064056P5/2002/oliveira 
_de_dr_botfm_prot.pdf.>. Acesso em: março 2008.