Cinética enzimática

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Relatório: Cinética enzimática
Guilherme Yudi Sagawa, Mairon Oliveira de Lima, Pedro Henrique Gurgel
9 de setembro de 2019
Introdução
Enzimas são compostos proteicos que desempenham função catalisadora de reações relacionadas ao me-
tabolismo biológico, diminuindo a energia de ativação e aumentando a velocidade das reações. Desse modo,
estudos de cinética química exploram a atuação das enzimas nos sistemas biológicos e como elas afetam a
velocidade de conversão do substrato em produto.
Um dos métodos para se abordar a cinética química de uma enzima na reação são os gráficos propostos
por Leonor Michelis e Maud Menten, que consistem em, a partir de um gráfico V (velocidade de reação) em
função de [S] (concentração de substrato), extrair a Vmax e oKm (constante de Michaelis-Menten). Contudo,
a linearização desse método é mais utilizada, pois facilita a interpretação dos dados obtidos. A esse método
se dá o nome de gráfico de Lineweaver-Burk, que se baseia na construção de um gráfico da recíproca da
velocidade (1/V) em função da recíproca da concentração de substrato (1/[S]).
Objetivos
Estudar as influências das concentrações de enzima (invertase de levedura) e substrato (sacarose) nas ve-
locidades de uma reação enzimática, examinar as curvas obtidas experimentalmente e calcular os parâmetros
cinéticos.
Materiais e métodos
– Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS; 40,0 mL; 14 g/L)
– Banho maria (35 ◦C e 100 ◦C)
– Cronômetro
– Espectrofotômetro
– Invertase de levedura (3,5 mL; 20 mg/L e 3,0 mL; 40 mg/L)
– Gelo
– Sacarose 5% (10,6 mL)
– Solução padrão redutora (SPR; 3,0 mL; glicose 6 mM e frutose 6 mM)
– Tampão acetato pH 4,77 (19,8 mL; 0,02 M)
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Resultados e discussões
Pelos dados obtidos no experimento A, foi possível construir a curva-padrão (Figura 1) da absorbância
a 540 nm em função do número de mols de solução padrão redutora (SPR), a partir do qual será obtido o
número de mols de sacarose hidrolisada para cada um dos experimentos subsequentes.
Figura 1: Gráfico da absorbância a 540 nm em função da quantidade de SPR, que é diretamente proporcional à
quantidade de sacarose hidrosada numa relação 1:1.
A absorbância no eixo y corresponde à corrigida, isto é, à absorbância medida subtraída pela absorbância
do tubo branco. Nos casos em que o valor resultante é negativo, foi considerado que a absorbância corrigida
é igual à do tubo branco, uma vez que não faria sentido uma mistura absorver algo negativamente. O mesmo
tratamento foi feito para os demais gráficos.
A curva de tendência utilizada para regressão foi linear (lei de Lambert-Beer), porém ajustada para que
esta intercepte o eixo y na origem. Com a equação da reta obtida, é possível calcular o número de mols
de sacarose hidrolisada para os demais experimentos a partir da absorbância corrigida para cada tubo de
ensaio, o que permite calcular a velocidade da reação como número de µmol dividido pelo tempo em que a
reação ocorreu.
Para o experimento B, no qual foi variada a concentração da enzima invertase em cada tubo, a velocidade
da reação foi obtida levando-se em conta a absorbância medida e o tempo de reação (5 minutos). A curva
de tendência para o gráfico da velocidade em função da concentração de enzima (Figura 2) foi obtida pela
regressão linear dos pontos com intercepto na origem, visto que a velocidade de reação aumenta linearmente
com a concentração de enzima enquanto houver substrato em excesso. O coeficiente de determinação (R2)
observado para a curva foi menor que o observado para a curva-padrão, o que pode ter sido causado pelo
outlier de 18 µg/L.
No experimento C, foi utilizada a concentração percentual de 5% fornecida no rótulo para fazer um gráfico
(Figura 3) análogo ao do experimento B, devido ao fato de não constar no protocolo se a porcentagem
em questão se referia a massa por volume, massa por massa ou volume por volume. Como sabemos que a
velocidade da reação aumenta exponencialmente com a concentração de substrato ([S], %) até que se atinja
a saturação enzimática, a curva de tendência aproximada foi logarítmica em vez de linear e, portanto, não
foi possível interceptá-la na origem, pois não existe log(0).
A partir dos dados obtidos no experimento C, é possível construir o gráfico de Lineweaver-Burk, também
chamado de dupla recíproca (Figura 4), que nos permite encontrar os valores para a constante de Michaelis-
Menten (Km, %) e a velocidade máxima (Vmax, µmol/min):
1
V
=
km
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
2
Figura 2: Gráfico da velocidade da reação em função da concentração de massa de enzima.
Figura 3: Gráfico da velocidade da reação em função da concentração percentual de sacarose.
Como dois pontos tiveram velocidade de reação considerada 0 (absorbância corrigida igual ao do branco),
eles tiveram de ser ignorados para a construção do gráfico, pois não existe divisão por 0. Pela equação da
reta obtida, encontraram-se Vmax = 8, 69× 10−1 µmol/min e Km = 7, 5%.
Conclusões
Pelos experimentos realizados, pudemos perceber as diferentes maneiras pela qual a velocidade de reação
pode ser variada com as concentrações no meio reacional, bem como sua velocidade máxima e constante de
Michaelis-Menten (Km) associadas ao processo. Verificou-se que a velocidade da reação varia proporcional-
mente à concentração de enzimas, no entanto tende a uma assíntota horizontal à medida que se concentra
substrato no meio. Tal fenômeno se deve ao fato de, em menor quantidade, as enzimas atuarem apenas
sobre parte do substrato.
Por outro lado, os experimentos realizados talvez possam não ser suficientes para atestar os resultados
encontrados. No experimento B, por exemplo, foi possível ver como a curva de tendência aproximada não
coincidia satisfatoriamente com os pontos obtidos, enquanto no gráfico da dupla recíproca foi necessário
descartar dois dos seis pontos devido à inexistência de divisão por 0 (absorbância igual ou menor à da
solução branca).
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Figura 4: Gráfico do inverso da velocidade da reação em função do inverso da concentração percentual de sacarose.
Para o cálculo da concentração da sacarose, foi utilizado o valor percentual por conta da indisponibilidade
da concentração em matéria, o que afetou a unidade doKm encontrado e impossibilita sua comparação com a
literatura. Ademais, teria sido necessário utilizar uma concentração maior de sacarose para que a velocidade
máxima na saturação enzimática pudesse ser visualizada na Figura 3, o que novamente sugere que os tubos
de ensaio preparados foram insuficientes.
Referências
[1] Lineweaver, H; Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. Journal of the American
Chemical Society. 56 (3): 658666. doi:10.1021/ja01318a036, 1934
[2] Transformações de Unidades de Concentração. Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Unicamp.
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	Referências