Resumo 2 Cultura de células e tecidos

Prévia do material em texto

Introdução à cultura de células
Por que cultivar células? Quando se passa de um sistema in vivo (organismo) para um sistema in vitro, há menor complexidade, é mais fácil obter células purificadas, e o sistema é mais simples de se trabalhar.
Aplicações:
Estudo mecanístico da atividade intracelular: replicação, transcrição, metabolismo energético, metabolismo de drogas, ciclo, diferenciação e morte celular;
Tráfego intracelular: processamento do RNA, fluxo de metabólitos, mobilização de cálcio, transdução de sinal, tráfego de membrana.
Farmacologia: ação de drogas, interação receptor-ligante, metabolismo de drogas, resistência a drogas.
Interação célula-célula: morfogênese, controle parácrino, cinética de proliferação celular, cooperação metabólica.
Engenharia de tecidos: desenvolvimento de células-tronco e injeção no paciente.
Imunologia: epítopos de superfície celular, hibridomas, citocinas, sinalização, inflamação.
Produtos celulares: ferramenta biotecnológica para a produção de compostos de interesse;
Interação do ambiente extracelular: nutrição, infecção, cito toxicidade, carcinogênese, ação de drogas e interação receptor-ligante.
Hibridomas: produção de anticorpos monoclonais. Injeta a molécula de interesse no animal, que vai produzir anticorpos. Extrai o soro do animal, onde se tem vários anticorpos de interesse produzidos por células formadoras de anticorpos (soro policlonal). Escolhe uma célula formadora de anticorpo e fusiona com uma célula tumoral (proliferação de forma indefinida): produção do anticorpo de interesse (monoclonal).
Replicação de vírus: parasita intracelular obrigatório, produz vacinas. Faz uma cultura celular, inocula o vírus, e depois extrai (sempre analisando no microscópio a morfologia do vírus).
Pesquisa de câncer.
Como cultivar células: por cultura primária (extrair a célula do órgão) ou linhagens contínuas (comprar a cepa). Alguns problemas do cultivo in vitro:
- Ex: pele: primeiro dissocia as células do tecido (se remover a célula ela perde sua estrutura tridimensional; para tentar evitar isso, utiliza um meio de maior densidade ou com mais mistura de células). A célula deixa de estar em contato com componentes sistêmicos, como a insulina (deve-se suplementar o meio). Ocorrem mudanças metabólicas: o fluxo de oxigênio carregado pela hemoglobina não existe mais, e isso altera o metabolismo energético (deve-se aumentar o fluxo do meio, para maior oxigenação). Redução da capacidade do fluxo de drogas (pode-se induzir a extração de enzimas).
Tipos de cultura:
Cultura de órgão inteiro: tecido em uma interface gás-líquido; conserva a estrutura histológica.
Cultura explante: corta pedaços de 1mm do órgão e insere em uma garrafa com meio de cultivo (tecido na interface sólido-líquido); as células migram para o meio de cultura na superfície. Quando elas se proliferam, pode-se cortar esse pedaço do meio.
Cultura de células dissociadas: cultivadas em uma garrafa. Separa as células de interesse: desagregação dos tecidos; células formam uma monocamada na interface sólido-liquido.
Célula organotípica: placa especial com membranas. Um tipo de célula é adicionado, se prolifera até aderir na placa. Depois é colocado outro tipo de célula (reconstituição do órgão, recria a estrutura e mantém o fenótipo). Células diferentes em cocultura, com ou sem matriz.
Formas de obter células: 
- Cultura primária: extrai o tecido do órgão, e a partir dele cultiva em placas, e depois faz as passagens (repique). Células se multiplicam por um tempo e depois param (senescência replicativa).
- Linhagens celulares contínuas: não entram em senescência replicativa (imortalizadas).
Cultivo das células por culturas primarias:
Desagregar a célula: existe alta conexão entre a célula e a matriz, o que torna a desagregação mais difícil. Células epiteliais: desfaz desmossomos, junções estreitas, contatos focais, etc. Pode-se usar quelantes (como o EDTA, um detergente que captura vários íons; caderinas sem cálcio ou integrinas sem magnésio, por exemplo, mudam sua conformação), ou enzimas que degradam moléculas da lâmina basal (tripsina, dispase, pancreatina, colagenase). Depois isolar as células.
Simular condições in vivo: temperatura do organismo, pH (regulado pela injeção de CO2), umidade (cultivar em garrafas seladas ou não, em incubadora), adição de nutrientes e fatores (soro animal), regulação da osmolalidade, superfícies para a aderência de células (células recriam uma microarquitetura).
- Meios de cultura: sais que se dissociam e afetam a osmolalidade (número de partículas de soluto osmoticamente ativas por kg de solvente), aminoácidos, vitaminas, fontes de carbono e indicador de pH.
- Fatores: de sobrevivência (molécula sinal pode ativar uma via que inibe a expressão de pró-apoptóticos, ou pode aumentar a expressão de um repressor de apoptose, ou pode diminuir a expressão de pró-apoptóticos: apoptose bloqueada), de crescimento, ou mitógenos (ativa transcrição e síntese de DNA). Utilização de soro bovino como fator: pode vir contaminado com vírus, e não sabemos a composição exata.
- Confluência de células: o quanto elas estão ocupando da superfície do meio, para ver se precisa ou não de passagens.
Congelamento e armazenamento: congelar em DMSO ou betaina, para impedir os cristais de gelo que se formam no congelamento da água no interior da célula (congelamento da água: expansão e danos ou até lise na célula). Centrifuga o meio de cultura, suspende e armazena em nitrogênio líquido (-80°C).
Condições estéreis: esterilização de materiais e soluções em autoclave, estufa e sistemas de filtração; manipulação em ambiente estéril, como a cabine de fluxo laminar. Microambiente: garrafas e placas de cultura, biorreatores. Meio de cultura: filtração, antibióticos e antifúngicos.
Cultivo de células a partir da linhagem contínua: inocular em meio contendo fatores e nutrientes, observar em microscópio; colocar na estufa para proliferar, observar no microscópio; armazenar em nitrogênio líquido ou fazer as passagens.
- Subcultivo (vindo das passagens): passar após 70% de confluência.
Vantagens: maior propagação, homogeneidade, caracterização das amostras e armazenamento por congelamento. 
Desvantagens: seleção das células adaptadas em cultura (acúmulo de mutações), instabilidade genética, maior risco de contaminação cruzada.
Células em cultura: podem ser aderentes, pouco aderentes ou não aderentes (em suspensão).
Aderentes: produzem e secretam moléculas na matriz extracelular, que aderem no substrato (plástico): laminina, colágenos, fibronectina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos. Proliferam até atingir confluência, depois ocorre inibição por contato (células tumorais não são inibidas). Linhagens podem ser contínuas (imortalizadas, geralmente aneuploides e heteroploides) ou não contínuas.
O tipo de célula determina o tipo de MEC (responsável pela adesão e espalhamento), e a MEC determina o comportamento da célula e seu fenótipo.
Contato celular: homotípico e heterotípico. Migração celular: fibroblastos em contato mudam de direção, células epiteliais param de migrar e formam grupos. A interação entre células pode modular funções celulares.
↑ Proliferação x ↓ diferenciação.
Tripsina: cliva proteínas de adesão. Para realizar subcultivo, pode-se raspar a cultura com um rodinho para soltar as células ou colocar tripsina para desaderir as células. Tira o meio e lava com PBS (solução salina) para que a tripsina não quebre proteínas do meio.
Estrutura de uma sala de Cultura Celular
Objetos utilizados descartáveis:
Placas de microtitulação com 24, 96, ou 1500 poços. Plástico tratado para que ocorra adesão celular;
Tubos de centrífuga (falcons);
Placas de Petri ou garrafas de cultura (cria-se um tapete de células);
Rodinho (descolar as células);
Pipetas, ponteiras;
Seringas, unidades filtrantes;
Reagentes;
Suportes permeáveis (membranas semipermeáveis, fibras ocas);
Meios de cultivo.
Construção do laboratório: 
Fácil assepsia (cantos das paredes arredondados);
Ar condicionadocom fluxo laminar paralelo ao fluxo de ar;
Balanço de pressão (pressão interna maior que pressão externa);
Área de quarentena;
Pouco tráfego dentro do laboratório (número máximo de pessoas por laboratório);
Filtro de ar.
Equipamentos:
Fluxo laminar classe I: ar estéril na horizontal, da parte de trás para a parte de frente do fluxo. Menor custo, proteção das culturas, mas não do operador, trabalhar com linhagens celulares de não primatas. Manter os materiais ao fundo e não se mover muito para não atrapalhar o fluxo.
Fluxo laminar classe II ou III: fluxo de ar estéril na vertical, possível trabalhar com linhagens de células de primatas, culturas produtoras de vírus, substâncias tóxicas ou perigosas (proteção das culturas e do operador). Trabalho com patógenos humanos: trabalhar com fluxo classe III. O ar externo entra na cabine e chega ao topo, onde passa por um filtro, depois desce verticalmente no fluxo e sai pela grade.
Bomba peristáltica/ de sucção;
Banho-maria, centrífuga, estufa com CO2, cilindros para CO2;
Ultra purificador de água, contêiner de N2 líquido, refrigerador, freezer e ultrafreezer;
Pipeta, microscópio de luz convencional e invertido;
Contador de células (câmara de Neubauer);
Autoclave, micro-ondas, filtros;
Estufa de esterilização e secagem, osmômetro, termociclador;
Agitador magnético, pHmetro, balanças;
Micromanipulador (micro injeção de células);
Frascos de cultura e substratos: 
Culturas dependentes de ancoragem: monocamada (tapete de células: adesão, dependendo da carga elétrica correta);
Culturas independentes de ancoragem: suspensão (agitação em meio semissólido, contendo ágar).
Ancoragem em vidro ou plásticos (estireno: superfície hidrofóbica requer tratamento físico ou químico, há diferença entre os fabricantes);
A escolha do frasco de cultura depende do rendimento das células, trocas gasosas, frequência de amostragem, tipo de análise e custo.
Superfícies tratadas: 1. Por condicionamento (frasco e/ou meio de cultura proveniente de cultura prévia); 2. Pré-tratamento com substratos naturais (interação célula-membrana da matriz extracelular); 3. Matrizes tridimensionais (coágulos de fibrina, coágulos gel, esponja de celulose, inorgânica); 4. Camadas de célula feeder (provisão de metabólitos, fatores de sobrevivência, mitógenos ou de crescimento, condicionamento de substrato, contatos celulares); 5. Substratos não aderentes (ágar, agarose).
Meios de cultura definidos: 
Meios quimicamente definidos e otimizados para determinadas culturas;
Indicador de pH (vermelho de fenol) presente no meio – pH entre 7 e 8;
Pressão parcial de CO2 e bicarbonato controladas: a abertura da tampa da garrafa aumenta o pH, pois o CO2 irá se dissipar no ambiente.
Metabolismo normal controlado pelo pH: uma diminuição no pH significa uma produção de ácido lático (indesejável).
Oxigênio: geralmente baixa demanda de O2 dissolvido no meio (glicose anaeróbica). Um aumento da tensão de O2 aumenta a toxicidade (radicais livres). Soro: tolerância ao O2.
Controle da osmolalidade;
Controle da temperatura (depende da espécie, mas geralmente atura temperaturas bem abaixo da corporal, mas nunca acima);
Controle da viscosidade: aumento da viscosidade com CMC ou PVP diminui o dano celular (importante em baixas concentrações, ausência de soro ou muita agitação);
Tensão superficial e espuma: maior risco de contaminação, desnaturação de proteínas e limita a difusão de gases.
Meios de cultura definidos consumíveis:
Aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos;
Elementos traço;
Bases, nucleotídeos;
Moléculas para o metabolismo energético;
Lipídios e precursores;
Indicadores.
Suplementos:
Glutamina ou glutamax;
Fatores de crescimento e mitógenos;
Hormônios;
Antibióticos: reduzem o risco de contaminação, mas induzem resistência bacteriana, causam contaminação crítica e efeitos anti-metabólicos, além de encorajar assepsia pobre (o pesquisador fica mais desleixado).
Soro animal: pode ser usado bovino fetal, bovino adulto, de cavalo e de humano. Possui mitógenos e fatores de adesão na sua composição. Tem atividade anti tripsina (degrada proteínas), e possui albumina (carreadora de lipídios), globulinas, fibronectina, transferrina e fetuína (adesão) na composição. Possui minerais, lipídios e hormônios (insulina, IGF, hidrocortisona). Deve ser feita a inativação do soro por calor, que remove anticorpos e complementos reduzindo a toxicidade do meio. Desvantagens: difícil saber a composição precisa, variabilidade fisiológica do animal doador, os lotes podem variar, difícil controle de qualidade, risco de contaminação por vírus e micoplasma, difícil padronizar, podem ter inibidores de crescimento.
Meios livres de soro: padronizados em laboratórios, podem induzir a proliferação de tipos específicos de células (meios seletivos), regulam a proliferação e diferenciação. Desvantagens: multiplicidade de meios, seletividade, pureza dos reagentes, proliferação celular mais lenta, muito caro. Componentes necessários:	
- Fatores de adesão;
- Inibidores de tripsinas e outras proteases;
- Hormônios;
- Fatores de crescimento/mitógenos e citocinas;
- Nutrientes, minerais, precursores de lipídios e lipídios;
- Proteínas e poliaminas;
- Matriz de fibronectina ou polilisina.
- Deve-se adaptar as culturas no meio sem soro! Seleção de subpopulações.
Técnicas de Esterilização
Boas práticas de laboratório: usar EPIs, planejar seu experimento, lavar as mãos antes e depois dos procedimentos, não comer, beber ou fumar, não usar maquiagem e joias, prender o cabelo, utilizar de forma correta os equipamentos, descartar adequadamente o material biológico.
Reduzir o risco de contaminação das culturas: 
Ambiente limpo, organizado e com pouco tráfego, sem corrente de ar sem animais e culturas no laboratório;
Operador sempre estar usando EPIs, conhecer os potenciais riscos, técnica asséptica; 
Uso, manutenção e limpeza dos equipamentos: checar o filtro do fluxo laminar duas vezes ao ano, limpar a estufa todo mês, usar fungicidas.
Material estéril certificado para cultura, manter linhagens importadas em quarentena;
Materiais reutilizáveis: manter uso exclusivo para uma cultura celular para evitar contaminação química na lavagem e esterilização.
Técnica asséptica: conjunto de procedimentos seguidos por todos os usuários do laboratório que visam diminuir o risco de contaminação. Contaminação restrita: na sua cultura. Contaminação generalizada: em várias culturas do laboratório. Para minimizar catástrofes (contaminações generalizadas):
Visualizar culturas sob microscópio sempre que há manipulação delas;
Manutenção de culturas sem antibiótico para evitar contaminação crítica;
Checar a esterilidade dos reagentes;
Não compartilhar frascos com meio de cultura e outros reagentes entre diferentes culturas;
Sempre utilizar a técnica asséptica.
Elementos do ambiente asséptico: área quieta, superfície de trabalho livre, higiene pessoal (usar luvas e máscara quando precisar), manipulação asséptica, cuidado no manuseio dos reagentes e meio de cultura, evitar usar chama dentro do fluxo laminar (pois a chama atrapalha o fluxo de ar).
Esterilização:
Vidraria: lavar com hipoclorito, depois detergente neutro, depois água corrente, depois água destilada, e secar em posição invertida. Esterilizar com calor seco ou autoclave (nunca esterilizar materiais graduados com temperaturas elevadas).
Plásticos (ponteiras, garrafas, falcons): se forem termoestáveis colocar na autoclave. Se forem sensíveis ao calor, usar radiação gama, óxido de etileno, etanol e secagem sob UV.
Reagentes e meios de cultura: se forem termoestáveis colocar na autoclave (manter selado ou completar o volume com água estéril). Se forem sensíveis ao calor, usar filtro com bomba a vácuo ou microfiltração.
Água: deve ter alto grau de pureza. Esterilização por osmose reversa ou destilação, filtração em carbono, desionização, filtração em microporo e autoclave ou filtração. Pode ser reciclada, mas não deve ser armazenada. Monitoramento da purezapor condutividade.
Soluções salinas: autoclave ou filtração.
Meio de cultura: se não veio pronto (em pó), cuidar com o preparo: checar o pH a 37°C, emprego de uma concentração de bicarbonato em função da pCO2 e pH requerido, ver se há precipitação dos constituintes, checar a esterilidade do meio após diluição, evitar exposição à luz UV e luz fluorescente. Glutamax: glutamina com tempo de meia vida maior. Esterilizar por filtração ou autoclave, armazenar no máximo 9 meses a 4°C. Se for soro, filtração (não elimina vírus) e armazenamento por no máximo um ano a -20°C.
Testes de esterilidade:
Bubble point: rompimento da membrana filtrante em pressão negativa. Testa-se a passagem de ar pelo filtro, se formar bolhas então a membrana foi rompida;
Incubação: verificar contaminações após uma semana de incubação a 37°C. Retirar amostras de meio, e passar por uma membrana filtrante em sistemas com duas membranas.
Teste em cultura: verificar a degradação de algum componente do meio ou contaminação química. Eficiência de plaqueamento: redução da concentração do soro para metade da usual, ver a curva de crescimento, ver se é expressão da função específica.
Contaminações químicas ou biológicas: falhas na esterilização, pó/esporos de fungos no ar, falhas na manutenção de incubadoras e refrigeradores, defeitos no fluxo laminar, importação de culturas contaminadas, lapsos na técnica asséptica. Tipos de contaminação microbiana:
Bactérias, micoplasmas, leveduras, fungos, bolores e protozoários; é importante identificar o tipo da contaminação, e localizar onde a cultura foi manipulada e o nome do operador. Contaminação com microrganismos rápida ou crítica. Pode-se usar antibióticos para evitar isso.
Monitoramento:
Checar se há contaminação ao olho nu ou microscópio, a cada manipulação;
Se houver suspeita, verificar com lâmina em microscópio de contraste de fase;
Registrar a natureza da contaminação.
Se a contaminação foi nova e não se espalhou, descartar todo o material usado na cultura.
Se a contaminação foi recorrente ou espalhada, checar os estoques, procedimentos de esterilização, etc. Nunca tentar descontaminar culturas, só se forem insubstituíveis.
Contaminação visível: por mudanças no pH (se por bactérias, pH abaixa, se por fungos, pH aumenta, se por leveduras, pH se mantém), meio turvo, ver microrganismos estranhos no microscópio (algumas vezes pode-se confundir contaminação por bactérias com precipitados de proteínas e restos celulares).
Contaminação por micoplasma: visível em microscópio de fluorescência, PCR, ELISA, imunomarcação, autorradiografia. Geralmente não tem sinais evidentes no meio de cultura, mas altera o metabolismo das células, diminui a taxa de proliferação celular, há aglutinação durante crescimento em suspensão e insucesso na produção de anticorpos.
Contaminação por vírus: vindos de produtos de origem animal (exemplo: soro). Visível por ELISA, PCR e imunomarcação.
Bactérias, leveduras e fungos: visíveis em microscópio de contraste de fase, cultivo de meios.
Erradicação:
Descartar a cultura. A descontaminação é difícil e há seleção de organismos resistentes.
Contaminação cruzada entre linhagens: 
Verificação por Fingerprint, cariótipo e análise de isoenzimas.
Boas práticas:
Banco de células com validação ou autenticado pelo pesquisador;
Não abrir garrafas de diferentes culturas simultaneamente;
Manipular células de rápida proliferação após as demais;
Não compartilhar materiais entre culturas;
Adicionar meio e reagentes nas garrafas antes das células;
Checar características da cultura regularmente.
Culturas primárias e linhagens celulares
Cultura primária: preparada diretamente dos tecidos de um organismo, cujo subcultivo leva a geração de linhagens. As linhagens celulares são finitas e contínuas, e as células sofrem senescência replicativa. 
- Culture shock: super expressão de mitógenos: causa a senescência replicativa (linhagem finita).
- Células mais heterogêneas, fenótipo mais parecido com células in vivo.
- Suprimento limitado.
- Etapas:
1. obtenção de autorização do comitê de ética (amostras humanas são mais difíceis que amostras animais);
2. obtenção da amostra do órgão ou tecido (tecidos de embriões têm resultados melhores);
3. obtenção de células via explante ou desagregação. 
- Explante: simples, mas consegue poucas células. Coloca um pedaço do órgão em um meio de cultura e espera as células migrarem. As células que saem têm propriedades migratórias e replicativas, células sem essas capacidades não conseguem ser analisadas no explante. Utilização de instrumentos bem afiados.
- Desagregação: quebrar junções celulares. Pode ser mecânica, onde o órgão é picotado em um meio, esse meio é forçado contra uma tela, e com uma seringa ou pipeta o meio é puxado e solto para soltar as células (baixo rendimento); com quelante de cálcio EDTA, onde o Ca muda a conformação/interação das caderinas e integrinas, responsáveis pelas junções celulares, e isso solta as células; enzimática: colocar tripsina morna ou gelada no meio (enzima que cliva tudo), que cliva as proteínas de membrana, ou outras enzimas mais especificas (colagenase, lipase). Alto grau de pureza, porém baixa eficiência de desagregação. Deve-se remover as enzimas rapidamente por centrifugação para não degradar a célula.
- Perfusão: colocar um cano em veias ou artérias do órgão e fazer um liquido contendo quelante ou enzima circular.
4. Cultivo: separação das células ou co-cultura.
- Co-cultura de células: por contato indireto, onde se utiliza um meio de cultivo condicionado, passando o meio de uma cultura para outra (faz-se camadas separadas que não entram em contato uma com a outra), ou cultivo direto, onde as monocamadas de culturas crescem uma sobre a outra.
- Separação de células: baseada em densidade e tamanho (separa por sedimentação e centrifugação em meio albumina de soro ou outros), em afinidade de anticorpos (adiciona-se um anticorpo específico para uma proteína de superfície das células com um fluoróforo ligado, e assim marca as células de interesse com o anticorpo; passa a solução em um citômetro de fluxo e adiciona carga de acordo com a fluorescência, depois faz a separação magnética e separa as células positivas das negativas), dispersão de luz/fluorescência, eletroforese ou cromatografia de afinidade.
5. Subcultivo: aumento da homogeneidade da cultura. Quanto menor o número de passagens (quantidade passada para o próximo), maior o número de gerações (multiplicação celular). O excesso de estímulo por mitógenos (culture shock) leva à apoptose das células. Mecanismos protetores. Ocorre a troca de meio no crescimento exponencial (fase log) antes que os nutrientes se esgotem, e antes de atingir 100% de confluência (plateau) faz a subcultura. A manipulação de várias linhagens aumenta o risco de contaminação cruzada.
- Linhagem não contínua: após alguns ciclos celulares ocorre senescência replicativa, geralmente pela redução dos telômeros (as vezes algumas células sofrem transformação e sobrevivem à senescência). Quanto mais passagens maior a senescência celular, pois durante as divisões os cromossomos podem se quebrar e se separar de forma errada.
- Em uma camada de células confluentes, remove o meio e adiciona tripsina ou EDTA. As células se desprendem, ressuspende essas células em soro bovino, centrifuga para retirar a tripsina e depois coloca em novo meio de cultivo. Quando as células se soltam, ficam em formato arredondado.
- Ciclo de proliferação: geração da cultura. Subcultivo: passagem. Razão de subcultivo: tempo entre as passagens. Número de gerações inverso ao número de passagens: se passar 1/3 das células, a cada passagem haverá 3 ciclos.
- Sempre verificar a morfologia celular (manutenção de rotina): controle do pH pela cor do meio contendo indicador (pH baixo significa contaminação ou excesso de células), ver a profundidade do meio (se o volume do meio é alto deve ter agitação para facilitar a troca gasosa). Células em proliferação e células diferenciadas têmmorfologias diferentes: a concentração de soro deve ser menor em células diferenciadas, e maior em células em proliferação.
6. Clonagem e seleção: feita para reduzir culturas heterogêneas, pois em culturas homogêneas é mais fácil reproduzir dados. Em uma cultura 90% pura, se os 10% contaminados tiverem um crescimento mais rápido que a cultura de interesse, após algum tempo a contaminação vai dominar.
- Isolar colônias de interesse em placas de Petri, garrafas, etc (em células em suspensão o meio deve ter maior densidade celular). Desaderir as células, ressuspender e plaquear, depois pegar as colônias. Ou usar microplacas (uma célula por poço). Para isolar as colônias devemos ter um meio com baixa densidade, mas isso abaixa a eficiência. Para aumentar a eficiência: usar meio rico ou otimizado, soro fetal bovino, hormônios, metabolitos intermediários, tripsina purificada, ou condicionar o meio com um mesmo tipo celular ou tipos diferentes. Para diminuir o risco de contaminação cruzada, fazer centrifugação, congelamento e filtração. Camada feeder também aumenta a eficiência: cultiva as células até a confluência, para a proliferação celular com irradiação ou compostos químicos, e faz a co-cultura: coloca uma cultura para crescer em cima dela.
- Clonagem em suspensão: usar ágar mais denso para as células não chegarem ao fundo.
- Isolamento de clones: colocar anéis de clonagem sobre as colônias e jogar tripsina só na colônia (proteção da colônia e irradiação das demais). Isolamento com inibidor seletivo (antibióticos, nutrientes ou fatores que favorecem a sobrevivência e proliferação de células de interesse, eliminando as demais), adesão/desadesão seletiva (células diferentes têm tempos de adesão diferentes), camadas feeder seletivas.
7. Senescência replicativa e imortalização: imortalização é diferente de transformação. Faz a transfecção com o gene que expressa a telomerase, e outra garrafa controle. Vê se houve imortalização.
8. Caracterização: ver se não há contaminação cruzada na sua linhagem, confirmar a espécie, correlação com o tecido de origem (ver se é célula diferenciada ou se é célula tronco), determinar se a linhagem é normal ou transformada (se além de ser imortalizada não sofre inibição por contato, tem malignidade, ou seja, potencial tumorogênico, crescimento aberrante em suspensão, ter anormalidade genética), ver se é propensa à instabilidade genética e variação fenotípica (pode se tornar heterogênea com o tempo).
- Caracterização com identificação da espécie por cariotipagem ou eletroforese de isoenzimas (marcadores celulares presentes só nas células de interesse, como antígenos de superfície e filamentos intermediários do citoesqueleto, ou funções e produtos específicos da linhagem). Os marcadores podem ser enzimas (as vezes precisa induzir a expressão da enzima) ou marcadores únicos (aberrações cromossômicas especificas).
- Morfologia celular: analisar no microscópio invertido a forma da célula, sinais de contaminação, debris. Coloração policromática (giemsa) ou monocromática (cristal violeta).
- Bandeamento cromossômico: prepara o cariótipo, cora e observa a localização das bandas. Cariótipo (conteúdo cromossômico): diferenciação das células normais e transformadas. Adiciona uma substância que não deixa chegar na anáfase, faz uma suspensão de células na metáfase, dilui, fragiliza a membrana plasmática e observa numa lâmina (cromossomos se espalham). Cora a gota da lâmina. 
- Chromossome painting: hibridizar com sondas fluorescentes.
- DNA fingerprint: analisa sequências repetitivas (sequências satélite). Quando há uma sequência de bases repetidas, a DNA polimerase erra várias vezes na replicação. Como essas áreas não expressam nada, elas variam muito de indivíduo para indivíduo, então é possível amplificar estas regiões e confirmar a identidade da célula e exclusão de contaminação cruzada. Faz eletroforese e PCR.
- DNA profiling: identifica e quantifica repetições em tandem curtas em loci específicos.
- Expressão de RNA e proteínas vista por northern blotting, microarranjo de DNA e géis bidimensionais.
- Isoenzimas: catalisam a mesma reação, mas não têm a mesma origem. Avaliar se é isoenzima por eletroforese e substratos cromogênicos.
- Isoformas de enzima: sequência de aminoácidos diferentes com uma mesma origem evolutiva.
9. Diferenciação:
- desdiferenciação: perda de propriedades fenotípicas associadas com células maduras. Para de expressar características especificas da célula. É reversível.
- Quanto maior a proliferação, menor a expressão de genes de diferenciação. Geralmente a síntese de produtos específicos aumenta com a parada da divisão celular.
- Para manter o fenótipo diferenciado: manter uma densidade celular adequada, fatores sistêmicos, interação célula-matriz, formato da polaridade celular (existem três domínios: o basal, apical e lateral. Para manter esta conformação, colocar água na parte apical e meio na parte basal, já que o domínio basal suga os nutrientes), tensão de oxigênio.
Ensaios com células
- Analisar morfologia e ultraestrutura celular: microscopia de luz em campo claro (fixa as células induzindo ligações covalentes entre as moléculas, depois cora com Giemsa).
- Microscópio de contraste de fase: não precisa corar. Observa células vivas e não fixadas em microscópio invertido.
- Microscopia de fluorescência: possível ver mais detalhes. Fixação, bloqueio (impede a fluorescência de outras coisas que não células), imunomarcação e montagem. Possível observar células vivas e ver a estrutura interna.
- Microscopia eletrônica de varredura (em baixo vácuo): fixação, desidratação, colocar em CO2 liquido (ponto crítico), recobrir o material com ouro (metalização). Alto detalhamento das células.
- Microscopia eletrônica de transmissão: fixação, pós fixação para manter a estrutura, inclusão e emblocagem, corte em lâminas ultrafinas, contrastação. 
- Microscopia eletrônica de superresolução: chega a um limite de detecção de 0,010 ɥm.
- Analisar viabilidade e citotoxicidade: 
- Azul de tripan: desadere as células, incuba com corante, coloca na câmara de Neubauer e conta as células (mede a integridade da membrana plasmática: células coradas em azul não são viáveis (membrana lesionada), pois o corante, que é hidrofílico e não passa pela membrana plasmática, entrou).
- Vermelho neutro: incuba as células com o corante, lava com PBS para extrair o corante e lê a absorbância – quantidade do corante presa. Mede integridade do sistema endossomal: o corante atravessa a membrana plasmática e quando entra em compartimentos com pH baixo (endossomo) vira um íon e não consegue sair do compartimento celular.
- MTT: incuba as células com corante, lava com PBS para remover o MTT não internalizado, solubiliza formazan com DMSO (extrai) e mede a absorbância. Corante pode ser convertido em formazan por meio de enzimas dentro das células: mede a capacidade metabólica (enzimática) das células. MTT danifica as células (diminui a viabilidade) porque forma cristais de formazan.
- Iodeto de propídio, DAPI, sytox: só atravessa a membrana se ela estiver íntegra (mede a integridade da membrana plasmática). Citômetro de fluxo: fluoróforo excitado emite fluorescência; mede muito mais células, por isso tem maior precisão.
- LDH: integridade da membrana e ação enzimática (quantificação em meio de cultura). Mede a atividade da lactato desidrogenase, só em processos de necrose (apoptose não libera LDH). Quanto maior a quantidade de LDH, maior a morte celular.
- Proliferação celular:
- Joga H-timidina, durante a síntese de DNA e vê o quanto ela foi incorporada. Quanto maior a incorporação de timidina, maior a síntese de DNA. Mede com radiação. Ou joga BrdU (análogo da timidina) e mede fluorescência. 
- Cell trace: incuba as células com a molécula fluorescente, e remove as moléculas que não entraram. O reagente fica preso dentro das células, liga-se a proteínas celulares e vai se dividindo durante a divisão celular, e suas células filhas vão espalhando as proteínas.Quanto maior a proliferação, menor a fluorescência.
- Contagem de células em câmara de Neubauer;
- Cora as células com MTT ou cristal violeta (quanto mais corado, maior a proliferação).
- Ciclo celular: incuba com DAPI (cora as células) e passa por um citômetro de fluxo para quantificar o DNA. Em G0 e G1, DNA menor. Em S e G2, DNA maior. Na fase M, menor área de emissão e maior intensidade de fluorescência. Em G1 tem muita célula, em S tem pouca célula, e em M e G2 tem uma quantidade média. Se medir quantidades pequenas, mede morte celular (sub G1).
- Morte celular: 
- Visualiza por microscopia confocal ou microscopia eletrônica de varredura.
- Anexina + iodeto de propídio e Hoechst: o Hoechst atravessa a membrana plasmática e cora o núcleo da célula de azul. O iodeto não atravessa a membrana: só cora de rosa o núcleo de células em processo de apoptose. A anexina cora de verde a fosfatidilserina na membrana externa (essa substância só está presente em células em processo de apoptose).
- TUNEL: na apoptose há fragmentação do DNA; um nucleotídeo marcado que se liga nas extremidades livres é adicionado (maior coloração: apoptose).
- Migração celular: 
- Ensaio scratch: faz um risco em uma cultura confluente, criando uma fenda. Depois incuba e vê quanto tempo demora para a fenda se fechar. Ensaio com inibidor de proliferação: só mede a capacidade das células migrarem. Sem inibidor: mede proliferação e migração celular.
- Ensaio transwell: mede a capacidade das células migrarem através de uma barreira de matriz extracelular em direção a moléculas quimioatraentes (soro fetal).
 
- Formação de colônias: ensaio clonogênico: em superfície sólida mede a capacidade das células sobreviverem em baixa densidade e proliferarem formando colônias. Incuba a célula e observa a formação das colônias. Em suspensão mede a capacidade das células sobreviverem livres de ancoragem e proliferarem.
- Capacidade fagocítica: faz ensaio de fagocitose com leveduras. Incuba macrófagos em cultura sem soro, lava com PBS, fixar com etanol, lava com álcool 70%, lava em água destilada, cora com Giemsa, lava com água, desidrata e monta as lâminas em resina.