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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Alunas: Esther Iolanda Silva Frois e Júlia Maria Alvarenga Ribeiro Treponema pallidum • Bactéria espiroqueta Gram- (penetração no tecido) • Impossibilidade de cultivo em meio artificial • Baixa resistência ao meio ambiente (resseca, sensível a sabão) • Transmissão sexual (mais prevalente, estágios iniciais > tardio), vertical, sanguínea (rara) História natural da doença História natural da sífilis congênita Ocorre pela disseminação hematogênica • Precoce: tx. de transmissão de 25%, via placenta e via contato do recém nascido com lesões genitais no momento do parto. • Mais da metade das crianças são assintom áticasao nascimento e, naquelas com expr essão clínica, os sinais e sintomas são disc retos ou pouco específicos Tratamento • Penicilina G Benzatina (Benzetacil) e Cristalina. • Tratar o paciente e as parcerias sexuais. Oferecer ao paciente sorologia para outras doenças sexualmente transmissíveis. TIPO DE S ÍF IL IS TR ATA M ENTO • Primária • Secundaria • Latente recente Penicilina G Benzatina, 2,4 milhões UI, IM, dose única (1,2 milhão UI em cada glúteo) Dose total de 2,4 milhões UI. • Latente tardia • Latente de duração ignorada e Sífilis terciária Penicilina G Benzatina, 2,4 milhões UI, IM, (1,2 milhão UI em cada glúteo), 1x/semana, por três semanas. Dose total de 7,2 milhões UI. • Neurossifilis Penicilina cristalina, 18-24 milhões UI/dia, IV, administrada em doses de 3-4 milhões UI, a cada 4 horas ou por infusão contínua, por 14 dias. Dose total de 252-336 milhões UI Diagnóstico • Sempre em duas etapas (triagem + confirmatória) • Exame direto (amostra coletada da lesão) x exame sorológico (pesquisa de anticorpos treponêmicos vs não treponêmicos) • Depende da fase da doença. Sinais/sintomas favorecem a suspeita clínica, mas não há sinal/sintoma patognomônico. • Deve ser pesquisado em todas as gestantes: 2 vezes durante a gravidez e no momento do parto Exame direto em campo escuro • Usa exsudato seroso das lesões ativas • Material deve ser analisado imediatamente após a coleta e levado ao microscópio com condensador de campo escuro. • Sens. 74%-86%, e espec. <97% • Positivo: infecção ativa. • Negativo: considerar que 1) número de T. pallidum na amostra não foi suficiente para sua detecção; 2) a lesão está próxima à cura natural; 3) a pessoa recebeu tratamento sistêmico ou tópico Permite a visualização de T. pallidum vivo e apresentando mobilidade típica, tamanho e morfologia Pesquisa direta com material corado • Método Fontana-Tribondeau: Deixa-se secar o esfregaço da amostra na lâmina e depois fazer a coloração pela prata, que vai impregnar a parede do treponema permitindo sua visualização; • Método de Burri: Utiliza a tinta da China (nanquim); • Método de coloração pelo Giemsa: O T. pallidum cora tenuamente (palidamente), sendo difícil a observação das espiroquetas; • Método de Levaduti: utiliza a prata em cortes histológicos. Testes treponêmicos x Testes não-treponêmicos Treponêmicos • Detecta anticorpos específicos IgM e IgG contra o Treponema • Qualitativos (indica que o paciente já teve contato com o T. pallidum em algum momento) • Primeiro a se tornar reagente, mas geralmente permanece positivo o resto da vida -> Usados para confirmação do diagnóstico, mas não utilizado para monitorar resposta ao tratamento • Imunofluorescêcia indireta (FTA-ABs), hemaglutinação, imunoenzimático (ELISA), imunocromatográficos (testes rápidos) Não treponêmicos • Detecta anticorpos IgM e IgG anticardiolipínicos (não específicos contra o treponema). • Apresentam mais falso positivos (1% da pop.), e pode ser falso negativo em sífilis primária ou latente • Qualitativos (triagem) ou quantitativos (determinar o título) -> monitoramento da resposta ao tratamento, queda do título indica sucesso terapêutico • Os principais são por floculação (VDRL, RPR, USR, TRUST) • Efeito Prozona Efeito prozona (apenas testes não-treponêmicos) • Desproporção entre as quantidades de antígenos e anticorpos, causando ausência de reatividade e, portanto, falso-negativos. • Principalmente na sífilis secundária, quando há grande quantidade e anticorpos • Proceder com teste qualitativo na amostra pura e diluída 1:8, 1:16 ... Não treponêmicos - Testes de floculação (VDRL, RPR, USR, TRUST) Na suspensão antigênica, há cardiolipina, lectina e colesterol (demais componenetes variam com o tipo de teste) que se arranjam formando micelas ao acaso. Os Ac não treponêmicos (da amostra) se ligam às cardiolipinasdas micelas. • O RPR o USR e o TRUST são modificações do VDRL que visam aumentar a estabilidade da su spenão antigênica, possibilitar a utilização de plasma (RPR e TRUST) e permitir a leitura do resultado a olh o nu (RPR e TRUST). • *Cardiolipina: lipídeo de mamíferos (usado de boi como antígeno do VDRL) SUSPENSÃO ANTIGÊNICA AMOSTRA VDRL : Venereal Disease Laboratory Reação de VDRL observadas em microscópio óptico comum em aumento de 100 vezes. VDRL qualitativo vs. VDRL quantitativo Cardiolipina (0,03%), Colesterol (0,9%) e Lecitina (0,21+/-0,1%). Testes treponêmicos - FTA-Abs (Fluorescent treponemal antibody – absorption) • É o padrão ouro dentre os testes treponêmicos • Primeiro a se tornar reagente após a infecção (10 dias) • Se trata de técnica de imunofluorescência indireta (IFI): T. pallidum vem fixado na lâmina -> amostra do paciente -> lavagem -> conjugado fluorescente -> leitura no microscópio Leitura FTA-Abs • Reagente: Treponemas verde-fluorescentes • Não reagente: Treponemas com colocação avermelhada ou verde pálido, sem sinal de fluorescência • Inconclusiva: treponemas com baixa intensidade de fluorescência, ou fluorescência descontínua Testes treponêmicos - MHA-TP (Micro- hemaglutinação para T. pallidum) e Aglutinação indireta • A aglutinação indireta (passiva) se baseia na ligação dos anticorpos treponêmicos (do soro do paciente) com hemácias que contêm antígenos de T. pallidum na sua superfície. Os antígenos do Treponema são adsorvidos à superfície de partículas de gelatina, e os anticorpos presentes no soro ligam-se ao antígenos das partículas a gelatina resultando em aglutinação. Leitura da reação de hemaglutinação Reagente: Quando há hemaglutinação (agluti nação) forma-se uma rede ou "tapete" de hemácias unidas aos anticorpos, que se espalham por toda a superfície da placa Não reagente: as hemáceas (partículas de gelatina) se depositam no fundo da placa formando um botão compacto Inconclusiva: mistura entre presença de hemaglutinação e botão na placa. O teste deve ser repetido. Testes treponêmicos - ELISA Antígenos totais/sintéticos de Treponema fixados em uma fase sólida -> anticorpos anti-T. Pallidum da amostra se ligam aos antígenos -> adicionar IgG anti-humana conjugada com composto estreptavidina- peroxidase -> adição do substrato com formação de cor Testes Treponêmicos: testes rápidos para sífilis • Testes em que é feita a leitura em no máximo 30 minutos, não necessitam de estrutura laboratorial • Os testes liberados no Brasil e registrados na ANVISA utilizam os princípios de: 1. Imunocromatografia de fluxo lateral: Alere Sífilis, Sifilis Bio e imunorápido sífilis Wama diagnóstica 2. Imunocromatografia em plataforma de duplo percurso (DPP): DPP® Sífilis BioManguinhos Testes treponêmicos - Teste rápido Alere Sífilis Contém uma membrana pré revestida com antígeno de Treponema pallidum na região de teste (T). • Baseado a metodologia de fluxo lateral • Utilizado amostra de punção digital -> adicionar solução diluente -> leitura Imunocromatografia de fluxolateral: Se houver Ac anti- treponema na amostra, se ligam ao conjugado com corante na área intermediária -> Ac + conjugado se ligam aos antígenos imobilizados na área T -> restante é revelado na área C (indica perfeita migração na tira). Leitura do teste rápido Alere Sífilis • Reagente - Formação da linha Teste e linha controle: Pre sença de anticorpos (IgA, IgM e igG) contra T. pallidum • Não reagente - Formação apenas de linha controle: ausência de anticorpos contra T. pallidumna amostra • Inválido - Formação apenas de linha teste ou formação de nenhuma linha. Repetir o teste Teste rápido - DPP® Sífilis BioManguinhos Imunocromatografia em plataforma de duplo percurso (DPP): a fase sólida contém 2 tiras de nitrocelulose. • Adicionar amostra + tampão no poço 1: Quando os anticorpos anti-treponema estão presentes na amostra, fluem pela fita e ligam- se aos antígenos imobilizados na área de leitura do teste. Outros anticorpos presentes na amostra podem se ligar à área C. • Adicionar tampão no poço 2: liberação do conjugado, que revela as linhas nas áreas T e C Leitura igual ao teste rápido de fluxo lateral Testes para diagnóstico da sífilis adquirida de acordo com a fase da doença Fase da doença Pesquisa direta do T. pallidum Sorológicos: Testes não treponêmicos Sorológicos: Testes treponêmicos Sífilis primária positivo Títulos baixos ( 1/4) (positivo após 1-3 semanas do aparecimento do cancro duro) Positivo após 10 dias da infecção Sífilis secundária Positivo Títulos altos (1/8, 1/32) positivo Sífilis latente recente (até 1 ano) - Títulos baixos (1/4) positivo Sífilis latente tardia (após 1 ano) - Títulos baixos (1/4) positivo Sífilis terciária - Títulos baixos (1/4) positivo DIAGNÓSTICO FLUXOGRAMA 1 Teste de triagem não- treponêmico confirmado por teste treponêmico • Se persistir a suspeita clínica de sífilis, repetir este fluxograma após 30 dias para a exclusão do diagnóstico DIAGNÓSTICO FLUXOGRAMA 2 Diagnostico laboratorial reverso de sífilis baseado em testes sorológicos automatizados. Indicado para grandes laboratórios. * O 3º teste deve ter metodologia diferente do 1º teste. Se persistir a suspeita clínica de sífilis, deve-se repetir este fluxograma após 30 dias para a exclusão do diagnóstico. DIAGNÓSTICO FLUXOGRAMA 3 Indicado em: Serviços de saúde sem infraestrutura laboratorial, CTA, população vulnerável, parcerias de diagnosticados pela sifilis, laboratorios pequenos, PA, HIV+, hepatites virais +. DIAGNÓSTICO • Cicatriz ou memória sorológica: persistência de resultados reagentes com títulos baixos (1:1 – 1:4) durante 1 ano após o tratamento, sem nova exposição, indica sucesso do tratamento. • Se os títulos aumentarem, indica nova infecção ou reativação. "Os testes treponêmicos não devem ser utilizados para o monitoramento da resposta ao tratamento. Esses testes não permitem que seja feita titulação e é esperado que permaneçam reagentes por toda a vida do indivíduo, sem contudo indicar falha do tratamento." Relação da sífilis e infecção pelo HIV • Aumenta significativamente o risco de se contrair a infecção pelo HIV (pelas lesões sifilíticas) • A sífilis acelera a evolução da infecção pelo HIV para SIDA e o HIV favorece a ocorrência de manifestações mais agressivas/atípicas de sífilis 1. Cancros multiplos e profundos de resolução mais lenta 2. Concomitância de lesões primárias e secundárias 3. Predisposição para acometimento ofálmico e neurológico • É frequente a presença de altos títulos de anticorpos e o VDRL apresentar falso-negativo (prozona) DIAGNÓSTICO NA GESTANTE • Toda gestante deve ser testada 2x durante o pré-natal e no parto. A parceria sexual também deve ser testada • primeira consulta do pré-natal (1º trimestre da gestação) • início do 3º trimestre (28ª semana) • momento do parto ou aborto, independentemente de exames anteriores • Em caso de gestante, o tratamento deve ser iniciado com apenas 1 teste reagente, treponênico ou não-treponêmico, sem aguardar o resultado do segundo teste. Testes para diagnóstico da sífilis congênita no RN Exame direto: pode ser pesquisado o T. pallidum no material coletado da lesão e da mucosa nasal Testes treponêmicos (FTA-Abs, TPHA, ELISA, testes rápidos): não utilizar em crianças abaixo de 18 meses, pois os anticorpos IgG maternos ultrapassam a barreira placentária. Após 18 meses o resultado reagente confirma a infecção. Testes não treponêmicos (VDRL, RPR, TRUST): fazer no sangue do neonato (e não do cordão umbilical). Só é considerado positivo se o título for 2x maior do que o título da mãe, e deve ser confirmado com outra amostra. ▪ RN não-reagente, ou título menor ou igual da amostra da mãe, o teste não treponêmico deve ser repetido com 1 mês, 3, 6, 12 e 18 meses. ▪ Fazer pesquisa de neurossífilis (análise de leucócitos , proteínas e VDRL no líquor) DIAGNÓSTICO NA TRANSMISSÃO VERTICAL FLUXOGRAMA 1: FLUXOGRAMA 2: DIAGNÓSTICO NA TRANSMISSÃO VERTICAL FLUXOGRAMA 3: FLUXOGRAMA 4: Diagnóstico é feito em toda situação de evidência de infecção pelo T. pallidum, por meio de exames microbiológico: • na placenta ou no cordão umbilical • em amostras da lesao • biópsia ou necropsia de criança, • produto de aborto ou natimorto. Bibliografia • Federação Brasileira das Associações de Ginecologia e Obstetricia. 2017. Disponível em: https://www.febrasgo.org.br/pt/noticias/item/188-sifilis • Sífilis: Estratégias para Diagnóstico no Brasil. Brasília: Ministério da Saúde, Coordenação de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids. 2010. 100 p. (Série TELELAB). Disponível em: em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/sifilis_estrategia_diagnostico_brasil.pdf • Ministério da saúde. Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas para Atenção Integral às Pessoas com Infecções Sexualmente Transmissíveis (IST). 2018. Disponível em: http://portaldeboaspraticas.iff.fiocruz.br/wp-content/uploads/2019/02/pcdt_ist_para_web_- _nao_diagramado1.pdf • Ministério da saúde. Manual Técnico para diagnóstico de Sífilis. Disponível em: http://www.aids.gov.br/en/node/59218 • Diretrizes para o controle da sifilis congenita. Manual de bolso, 2006.Disponível em: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicaco es/manual_sifilis_bolso.pdf • Manual técnico para o diagnóstico da Sífilis. Disponível em: https://www.pncq.org.br/uploads/2016/Qualinews/Manu al_T%C3%A9cnico_para_o_Diagn%C3%B3stico_da_S%C3%ADfi lis%20MS.pdf • Protocolo Clínico e Diretrizes terapêuticas- IST. Ministério da saúde, 2015. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/protocolo_cli nico_diretrizes_terapeutica_atencao_integral_pessoas_infecco es_sexualmente_transmissiveis.pdf Bibliografia Esther Frois e Júlia Alvarenga PATOLOGIA CLÍNICA II – 2019/2
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