Inseminação artificial - Roteiro de aulas práticas

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE ZOOTECNIA
DEPARTAMENTO DE REPRODUÇÃO E AVALIAÇÃO ANIMAL
IZ 306 - INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS
SEROPÉDICA, RJ.
2017
HIGIENE DO REPRODUTOR (BOVINOS)
Limpeza externa do prepúcio
-	Banho completo do animal (se necessário)
-	Corte dos pelos do prepúcio (se necessário)
Lavagem da região prepucial externa com água morna e sabão neutro
Estímulo da micção (obrigatório na eletroejaculação)
Lavagem interna do prepúcio
-	Introduzir pipeta paralelamente ao prepúcio, na cavidade prepucial, obliterando o óstio prepucial. Injetar solução fisiológica morna.
OBS: Não utilizar água para lavagem interna, pois pode resultar em choque hiposmótico nos espermatozóides no momento da coleta.
-	Massagear o prepúcio (sentido ascendente), mantendo obliterado o óstio prepucial
-	Escoar a água da cavidade prepucial (massagem no sentido descendente)
-	Secar a região prepucial externa com papel toalha
	
MÉTODOS DE COLETA DE SÊMEN (BOVINOS)
As duas principais técnicas de coleta são por meio da vagina artificial ou por eletroejaculação, sendo a primeira considerada melhor técnica por simular a monta natural. Outras técnicas menos utilizadas são massagem por via retal das glândulas vesiculares e das ampolas dos ductos deferentes e excitação mecânica do pênis.
VAGINA ARTIFICIAL (RUMINANTES)
Componentes	
Tubo rígido com válvula
Mucosa de látex
Cone coletor de látex
Tubo coletor de material transparente graduado
Capa protetora (prevenção contra choque térmico e de luz)
Preparo da vagina artificial
Montar todos os componentes da vagina artificial
Colocar água quente (temperatura deve atingir 44°C)
Acertar a pressão
Lubrificação da região externa (opcional)
Colheita de sêmen
-	Utilizar a vagina artificial quando a mucosa interna atingir a temperatura de 44°C
-	Excitar o animal por meio de saltos falsos (pré-saltos)
-	Colher o sêmen, desviando lateralmente o pênis e introduzindo-o na vagina artificial.
VAGINA ARTIFICIAL (EQUINOS)
Componentes
Tubo rígido com válvula 
Presilha (elástico)
Mucosa de látex
Camisa sanitária
Copo coletor com filtro
Preparo da vagina artificial
Montar todos os componentes da vagina artificial
Colocar água (temperatura deve atingir 44°C)
Acertar a pressão (vestir uma luva de palpação invertida e introduzir a mão na vagina artificial para tirar excesso de água, acertando a pressão. Fechar a mão em punho, para simular dilatação do pênis equino)
Colheita de sêmen
Utilizar a vagina artificial quando a mucosa atingir a temperatura de 44°C
Colher o sêmen, desviando lateralmente o pênis e introduzindo-o na vagina artificial.
Liberar pressão, evitando que o pênis do animal fique preso, antes de retirar a vagina artificial
ELETROEJACULAÇÃO (BOVINOS)
Eletro ejaculador
-	Fonte de energia de 12 volts (bateria, pilha ou rede elétrica)
-	Eletrodo bipolar
-	Controlador de voltagem e de amperagem
Preparo do animal
-	Contenção adequada do reprodutor
-	Higiene do reprodutor
-	Retirada das fezes do reto
-	Introdução do eletrodo lubrificado (CMC) no reto e com as fitas metálicas voltadas para o assoalho da pelve
Colheita de sêmen
-	Estímulos de excitação (controlador de voltagem) por meio de baixa amperagem (+ 50mA) até que ocorra o gotejamento de líquido seminal
-	Estímulos de ejaculação (controlador de voltagem) por meio de elevada amperagem, iniciando com 200mA até o máximo de 600mA
-	Intercalar períodos de estímulo e de descanso com duração equivalente, tanto na fase de excitação quanto na fase de ejaculação
AVALIAÇÃO DO SÊMEN 
Parâmetros macroscópicos:
Volume (mL): pode ser mensurado através da graduação do próprio tubo coletor. 
Aspecto: pode ser cremoso, leitoso, opalescente ou aquoso. O mesmo sofre influência da concentração espermática. 
Cor: avaliação importante, pois pode mostrar se houver contaminação do sêmen, por sangue se estiver avermelhado ou contaminação por fezes e impurezas se estiver amarronzado.
Odor: outro importante indicativo de contaminação, principalmente por urina. O odor característico do sêmen é dito com “sui generis”
pH: pode ser realizada com auxílio de fitas próprias para medir pH.
Parâmetros microscópicos:
Turbilhonamento: colocar uma gota de sêmen puro sobre a lâmina e avaliar o movimento de massa (ondas) no menor aumento (40x). O mesmo é avaliado em ruminantes. Escala varia de 0 a 5. 
Motilidade: colocar uma gota de sêmen diluído entre lâmina e lamínula e utilizar aumento de 100x para avaliar porcentagem de espermatozóides vivos e móveis. Escala varia de 0 a 100%.
Vigor: avaliado juntamente com a motilidade. Verifica-se a velocidade (“força de propulsão”) do espermatozóide. Escala de 0 a 5.
 Concentração espermática = n de espermatozóides/mm3 ou n de espermatozóides/mL. Avaliado pela contagem na câmara de Neubauer. 
 Patologia espermática = % de espermatozóides com defeitos (maiores, menores e totais).
TESTE HIPOSMÓTICO
É um teste usado para avaliar a viabilidade funcional da membrana do espermatozóide, através da observação da integridade da mesma quando exposta a uma solução hiposmótica. 
Um espermatozóide morfologicamente funcional permite a passagem de água para o interior da célula. Com a entrada de água, há o aumento do volume celular (edema), causando o dobramento da cauda do espermatozóide. 
Caso o teste seja negativo (não haja inchaço), a membrana é considerada quimicamente inativa (não funcional).
	
CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA
Contagem dos espermatozóides é realizada com auxílio da câmara de Neubauer.
CÂMARA DE NEUBAUER
Altura entre lâmina e lamínula = 0,100 mm (deepth)
					Câmara de Neubauer
									 lamínula
-	A Câmara de Neubauer (1mm2 de área) possui 25 quadrados separados por linhas triplas
-	Cada quadrado separado por linhas triplas (0,04mm2 de área) possui 16 quadradinhos separados por linhas simples.
-	Contar os espermatozóides em 5 dos 25 quadrados separados por linhas triplas (x = somatória dos espermatozóides).
-	Como a câmara possui 25 quadrados separados por linhas triplas, então multiplica-se a somatória dos espermatozóides (x) por 5 para termos o número de espermatozóides em toda a área da câmara (1mm2)
-	Como a profundidade ou altura entre a câmara e a lamínula é de 0,1(1/10)mm, então multiplica-se o número de espermatozóides em toda a área da câmara por 10 para termos o número de espermatozóides em 1mm3 de sêmen diluído
-	Para determinar a concentração dos espermatozóides em 1mm3 de sêmen puro multiplica-se o número de espermatozóides em 1mm3 de sêmen diluído pela diluição do sêmen (p. ex: diluição 1:100 então multiplica-se por 100).
-	n de sptz/mm3 = (x) . 5 . 10 . 100		 n de sptz/mm2 de sêmen diluído
								 n de sptz/mm3 de sêmen diluído
								 n de sptz/mm3 de sêmen puro
Exemplo: Foram contados 50 espermatozóides em 5 quadrados, utilizando um sêmen diluído 1:100:
50 (sptz) x 5 (ajuste no n° de quadrados) x 10 (altura da lamínula) x 100 (diluição) = 250000 sptz/mm³ 
Se desejar passar o resultado para sptz/mL, deve-se multiplicar por 1000.
250000 x 1000 = 250000000 sptz/mL ou 250x106 sptz/mL.
PATOLOGIA ESPERMÁTICA
Coloração de Williams ou Panótico
1) Confeccionar dois esfregaços com sêmen puro ou diluído (para sêmen concentrado)
2) Fixar em placa aquecida
3) Corar segundo o protocolo do método de Williams ou do Panótico
Esta técnica permite a avaliação dos defeitos de morfologia de cabeça dos espermatozóides em microscópio óptico comum com aumento de 1000 vezes (objetiva de imersão).
Preparação Úmida com Formol Salino ou Glutaraldeído
1) Diluir o sêmen em solução de Formol Salino ou Glutaraldeído a 37 C (em 1 ml de formol colocar a quantidade de sêmen até obter aspecto turvo)
2) Colocar 1 gota do sêmen diluído sobre lâmina e
cobrir com lamínula. Enxugar com papel de filtro, se necessário, as margens da lamínula.
3) Vedar as margens da lamínula com esmalte.
4) Aguardar um período para a sedimentação dos espermatozóides e a secagem do esmalte.
Esta técnica permite a avaliação dos defeitos de acrossomo, peça intermediária e cauda em microscópio de contraste de fase ou de interferência diferencial com aumento de 1000 vezes (objetiva de imersão).
CÁLCULO DE DOSES PARA A CONGELAÇÃO DE SÊMEN BOVINO
Volume: mL
Concentração (): no de espermatozóides/mm3 ou no espermatozóides/mL	
OBS: Concentração (mL) x volume (mL) = no sptz no ejaculado	
Motilidade: % de espermatozóides com motilidade progressiva e retilínea
Perda na congelação – cerca de 50% dos espermatozóides (pode variar de acordo com a técnica)
Dose inseminante: de bovino é no mínimo 10 X 106 espermatozóides após a descongelação (Portaria do Ministério)
Volume da dose: 0,25ml ou 0,5ml
OBS: Se a concentração de espermatozóides estiver em mm3, deve-se passar a mesma para mL (multiplicar por 1000).
OBS: Resultado de doses deve ser um número inteiro. Se houver necessidade de arredondar, arredondar sempre para menos. 
Exemplo: 159,8 arredonda para 159 doses.
	
REFRIGERAÇÃO
Fração A = sêmen + diluidor
Fração B = diluidor + glicerol	
-	Colocar na geladeira ou no balcão refrigerado (5C) o frasco com a fração A, dentro de um Becker contendo água a 37C, por uma hora e meia a duas horas (tempo de equilíbrio).
-	Colocar a fração B na geladeira ou no balcão refrigerado para que esteja na mesma temperatura que a fração A (5C).
-	Adicionar a fração B sobre a fração A, gradativamente, e manter na geladeira ou no balcão refrigerado (glicerolização).
OBS: Adicionar sempre a fração B na fração A, nunca o contrário.
ENVASE
-	Identificar, manualmente ou em máquina automática, as palhetas com o nome e a raça do reprodutor e o número da partida do sêmen, o qual, geralmente é a data da colheita e do processamento do sêmen.
-	Colocar as palhetas na geladeira ou no balcão refrigerado para que estejam na mesma temperatura (5°C) do sêmen no momento do envase.
-	Preencher as palhetas manualmente com seringa e vedar com álcool polivinílico ou preencher e vedar em máquina automática.
	OBS.: O envase e a vedação devem ser feitos dentro da geladeira ou do balcão refrigerado (5°C), não podendo haver oscilação de temperatura durante todo este processo.
CONGELAÇÃO
Exposição ao nitrogênio
-	As palhetas são congeladas horizontalmente ou verticalmente no vapor de nitrogênio, como mostra o esquema abaixo:
 vapor vapor de N2 (temperatura varia de acordo com a altura) 
 líquido N2 líquido (-196° C)
-	Expor as palhetas ao vapor de nitrogênio por 15 a 20 minutos e depois mergulhar as mesmas no nitrogênio líquido
-	Após alguns minutos de estabilização no nitrogênio líquido, as palhetas são colocadas em raques (imersas no nitrogênio) e as raques em canecos, os quais são armazenados em botijões de nitrogênio líquido.
-	Após 24 horas de armazenagem, descongela-se duas palhetas de cada partida para a avaliação do sêmen (controle de qualidade): avalia-se motilidade e vigor das amostras
OBS: O raqueamento das palhetas deve ser feito sempre dentro do nitrogênio líquido para evitar oscilação de temperatura.
		
Descongelamento
Deve ser realizado à uma temperatura de 37°C por 20 segundos (palheta fina) ou 30 segundos (palheta média).
		
MANEJO DE BOTIJÃO
 Primeiramente deve-se medir o nível de nitrogênio introduzindo uma régua graduada até o fundo do botijão. 
OBS: o nível deve estar sempre acima de 15cm.
Materiais necessários:
Termômetro 
Água quente
Isopor 
Gilete ou tesoura
Papel toalha
Bainha
Aplicador e borrachinha para prender a bainha ao aplicador
Pinça
Após medir o nível de nitrogênio e conferir os materiais, deve-se exteriorizar apenas a ponta da bainha, mantendo a mesma ainda na embalagem a fim de evitar contaminação.
Em seguida prepare a água para descongelamento (37°C).
Para pegar a palheta, abra a tampa do botijão e levante o caneco que contém a raque com o sêmen desejado, sempre lembrando de manter o caneco a pelo menos 7cm abaixo da boca do botijão.
Pegue a palheta do sêmen desejado com auxílio da pinça e coloque a mesma para descongelar na água à 37°C (20 segundos para palheta fina de 0,25mL ou 30 segundos para palheta média de 0,5mL).
OBS: Se houver demora na retirada da palheta do botijão, mergulhe novamente o caneco no botijão para assegurar a viabilidade do sêmen.
Depois de descongelada, secar a palheta com papel toalha e cortar a parte vedada (oposta à bucha). O corte deve ser reto se for palheta fina ou em bisel se for palheta média. 
Colocar a parte cortada da palheta na bainha, em seguida o aplicador, lembrando de prender a cânula do mesmo à bainha com a borrachinha e terminar com colocação do êmbolo.