Quantificação de Açúcares Redutores em Amostra Biológica

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Curso Técnico em Biotecnologia 
Processos Bioquímicos
	
Quantificação de Açúcares Redutores em Amostra Biológica
 Ederson Martins
Gabriele Mentz
Hérick Mello
Nanda Couto
Pâmela Stradolini
Profº. Leonardo da Silva Bittencourt e Dra. Alessandra Nejar Bruno
Porto Alegre, 08 de novembro de 2019
INTRODUÇÃO
1.1 Carboidratos
 
Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na Terra. A cada ano, a fotossíntese converte mais de 100 bilhões de toneladas métricas de CO2 e H2O em celulose e outros produtos vegetais (Harvey e Ferrier, 2012).  Eles possuem grande variedade de funções, que incluem o fornecimento de fração significativa da energia na dieta da maioria dos organismos e a atuação como forma de armazenamento de energia no corpo e como componentes da membrana celular, mediando algumas formas de comunicação intercelular (Nelson e Cox, 2014). 
Existem três classes principais de carboidratos: monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos (a palavra “sacarídeo” é derivada do grego sakcharon, que significa “açúcar”) (Nelson e Cox, 2014).
Monossacarídeos e dissacarídeos
 Os monossacarídeos (açúcares simples) podem ser classificados de acordo com o número de átomos de carbono que contêm (Harvey e Ferrier, 2012). Os monossacarídeos, são aldeídos ou cetonas com dois ou mais grupos hidroxila; os monossacarídeos de seis carbonos, glicose e frutose, têm cinco grupos hidroxila. Muitos dos átomos de carbono aos quais os grupos hidroxila estão ligados são centros quirais, o que origina os muitos estereoisômeros de açúcares encontrados na natureza. Monossacarídeos de quatro ou mais carbonos tendem a formar estruturas cíclicas (Nelson e Cox, 2014).
 Os dissacarídeos (como maltose, lactose e sacarose) consistem em dois monossacarídeos unidos covalentemente por uma ligação O-glicosídica, a qual é formada quando um grupo hidroxila de uma molécula de açúcar, normalmente cíclica, reage com o carbono anomérico de outro (Nelson e Cox, 2014). 
Figura 1 - Formação da maltose - Nelson e Cox, 2014.
Ciclização de monossacarídeos
Menos de 1°/o dos monossacarídeos com cinco ou mais átomos de carbono ocorre na forma de cadeia aberta (acíclica). Ao contrário, eles são encontrados predominantemente na forma de anel (cíclica), na qual o grupo aldeído (ou cetona) reagiu com um grupo álcool do mesmo açúcar, tornando assimétrico o carbono carbonílico (carbono 1 para uma aldose ou carbono 2 para uma cetose) (Harvey e Ferrier, 2012).
 - Carbono anômero
 A ciclização cria um carbono anômero (o carbono que anteriormente fazia parte da carbonila), gerando as configurações α e β dos açúcares, por exemplo, α-D-glicopiranose e β-Dglicopiranose. Esses dois glicídeos são moléculas de glicose, mas são anômeros um do outro.
Figura 2 - Carbono anômero - Harvey e Ferrier, 2014.
 
Ligações Glicosídicas
 	Monossacarídeos podem ser ligados para formar dissacarídeos,oligossacarídeos e polissacarídeos. Dissacarídeos importantes incluem a lactose (galactose + glicose), sacarose (glicose + frutose) e maltose (glicose + glicose). Polissacarídeos importantes incluem o glicogênio ramificado (proveniente de fontes animais), o amido (fontes vegetais) e a celulose não ramificada (fonte vegetal); cada um deles é um polímero de glicose. As ligações que unem os açúcares são denominadas ligações glicosídicas. Essas ligações são formadas por enzimas conhecidas como glicosiltransferases, que utilizam como substrato um nucleotídeo-açúcar, como a UDP-glicose (Harvey e Ferrier, 2012).
 As ligações glicosídicas entre açúcares são denominadas conforme o número dos carbonos que estabelecem a conexão e também conforme posição do grupo hidroxila no carbono anômero do glicídeo envolvido na ligação. Se esse grupo hidroxila do carbono anômero estiver na configuração α, a ligação é α. Se o grupo estiver na configuração β. a ligação é β· A lactose, por exemplo, é sintetizada pela formação de uma ligação glicosídica entre o carbono 1 de uma β-galactose e o carbono 4 da glicose. A ligação é, dessa forma, uma ligação glicosídica β (1->4) (Harvey e Ferrier, 2012).
Polissacarídeos
 	Os polissacarídeos são polímeros de açúcar que contêm mais de 20 unidades de monossacarídeo; alguns têm centenas ou milhares de unidades. Alguns polissacarídeos, como a celulose, têm cadeias lineares; outros, como o glicogênio, são ramificados. Ambos são formados por unidades repetidas de D-glicose, mas diferem no tipo de ligação glicosídica e, em consequência, têm propriedades e funções biológicas notavelmente diferentes (Nelson e Cox, 2014).
  
1.2 Açúcares redutores.
 
           Existem açúcares que possuem grupos carbonílico e cetônico livres, que são capazes de se oxidar na presença de agentes oxidantes, em soluções alcalinas. Estes são os açúcares redutores (AR), que são monossacarídeos, como a glicose e a frutose, e alguns dissacarídeos, como a maltose (formada por glicose) e a lactose (formada por galactose e glicose). As funções cetônicas e aldeídicas livres possibilitam a redução de íons catiônicos, como o Cobre e o Ferro (DEMIATE et al., 2002).
      Os açúcares não-redutores (ANR) precisam sofrer hidrólise da ligação glicosídica para oxidar. Um exemplo é a sacarose, que é formada pela ligação entre o grupo funcional aldeídico de uma molécula de glicose e o grupo funcional cetônico de uma molécula de frutose. A hidrólise de açúcares não-redutores é geralmente feita com ácido forte ou com o uso de enzimas (invertase, no caso da sacarose) (DEMIATE et al., 2002).
 
1.3 ADNS
 
O ácido 3,5-dinitrossalicílico (ADNS) é um composto amarelado em solução que pode ser reduzido por açúcares redutores a um composto nitroamino análogo, ácido 3-amino-5-nitrossalicílico, que possui coloração avermelhada, ao mesmo tempo em que os açúcares redutores são oxidados. Este composto, assim como o ADNS, é aromático, mas absorve luz facilmente e, assim, é possível estabelecer uma relação direta entre a quantidade de açúcares redutores presente na solução com a medida colorimétrica realizada em espectrofotômetro (VASCONCELOS et al., 2013).
  
1.4 Espectrofotometria
 
A espectrofotometria é uma técnica analítica que permite determinar a concentração das soluções por meio da intensidade de luz absorvida ou transmitida por elas. Com soluções coloridas, em que a intensidade de cor produzida na solução é proporcional à concentração da substância que está sendo dosada, conseguimos quantificar a concentração de uma dada substância em uma solução. Isso ocorre devido às diversas biomoléculas absorverem luz em comprimentos de onda (l) característicos. A luz branca é um espectro contínuo dos comprimentos de onda de todas as cores. Se a luz branca atravessar uma solução contendo um composto corado, certos comprimentos de onda de luz são absorvidos seletivamente (BRUNO et al., 2014).
Em 1852, Johann Lambert estudou transmissão de luz por sólidos homogêneos, enquanto August Beer estendeu os estudos para a análise das soluções, resultando na Lei de Lambert-Beer que determina que: “Quando uma faixa de luz monocromática atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada” (NELSON; COX, 2011).
O espectrofotômetro é um equipamento que compara quantitativamente a fração de luz que passa através de uma solução de referência e de uma solução de teste. De modo geral, um espectrofotômetro possui uma fonte estável de energia radiante (normalmente uma lâmpada incandescente), um seletor de faixa espectral (monocromatizadores, como os prismas, que selecionam o comprimento de onda da luz que passa através da solução de teste), um recipiente para inserir a amostra a ser analisada (a amostra deve estar em recipientes apropriados conhecidos como cubetas) e um detector de radiação, que permite uma medida relativa da intensidade da luz. O espectrofotômetro informa quanta luz foi transmitida (T) ou quanta luz foiabsorvida (A). Desta forma podemos afirmar que: 
Absorbância (A): é a quantidade de luz que uma solução absorve. Apresenta a vantagem de variar de forma linear com a concentração da amostra.
Transmitância (T): é quantidade de luz que uma solução deixa passar, ou seja, não absorve. É expressa em porcentagem de luz transmitida. Assim, quando T=100%, não há absorção de fótons.
A determinação da concentração de um soluto em uma determinada solução por espectrofotometria envolve também a comparação da absorbância da solução comum com uma solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto. De modo geral, essa solução de referência é chamada de solução-padrão. Pode-se então diluir a solução-padrão para obter diferentes concentração (pontos), determinar as suas respectivas absorbâncias e traçar um gráfico, cujo perfil é conhecido como curva-padrão. No gráfico da curva-padrão, o eixo Y (vertical) indica a absorbância da amostra, enquanto no eixo X (horizontal) indica a concentração em mg/mL da amostra (BRUNO et al., 2014).
Em cada ponto obtido na curva-padrão, obtemos o fator de calibração (FC) de cada ponto da curva. Realizando a média dos fatores de calibração parcial, obtemos o fator de calibração médio (FCM) e, com ele, calculamos as concentrações desconhecidas em uma solução por meio da seguinte fórmula:
Q ou C (concentração) = A (absorbância da amostra) X FCM
OBJETIVO
Utilizar um método espectofotometrico de quantificação de carboidratos. Determinar a concentração de açúcares redutores em uma amostra biológica pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (ADNS).
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
300 uL Leite (diluído 40X).
5mL Solução padrão de glicose 5 mg/mL
15 mL de reagente ADNS (75 g de tartarato duplo de sódio e potássio, 0,25 g de ácido dinitrosalicílico  e 50 mL de NaOH 2 M) 
06 tubos de ensaio grandes 
Estantes para tubos de ensaio
13 tubos eppendorf
Micropipeta de 100-1.000uL e de 20-200uL
Ponteiras grandes e pequenas
1 pipeta de vidro de 5 mL para o ADNS
Banho Maria
Espectrofotômetro
3.2 Métodos
-  Diluir a amostra (leite) 40X.
-  Pipetar a curva padrão em uniplicata conforme tabela abaixo:
 
	Concentração final de Glicose (mg/mL)
	Glicose 5 mg/mL (μL)
	Água (μL)
	5
	1000
	0
	2,5
	500
	500
	1
	200
	800
	0,5
	100
	900
	0,1
	20
	980
	0
	0
	1000
-  Identificar 13 tubos de ensaio pequenos (ou em eppendorf) com a respectiva concentração da curva padrão (em duplicata, exceto o branco) + 2 tubos identificados como “amostra”.
-  Pipetar 1000 μL (1mL) da solução de ADNS para tubos previamente identificados.
-  Transferir 100 μL de cada ponto da curva para os tubos contendo o ADNS (11 tubos).
-  Pipetar 100 μL da amostra (leite diluído 40X) em 2 dos tubos (identificados como “amostra”) contendo o ADNS.
-  Aquecer a mistura em banho-maria, com água fervente, por 10 minutos.
-  Resfriar as soluções até temperatura ambiente.
-  Zerar o espectrofotômetro com o branco. Determinar as absorbâncias a 570 nm (A570).
-  Anotar as absorbâncias na tabela abaixo.
-  Calcular o FCM (Fc= Q / A) a partir dos dados da curva padrão.
-  Calcular a concentração de açúcares redutores do leite (C = A X FCM).
4. RESULTADOS 
Tabela 1 - Absorbâncias da glicose 5mg/mL e amostra biológica lidas em 570 nm.
	Curva Padrão
	Absorbância
	5
	1,099/1,271 > 1,185
	2,5
	 0,572/0,545 > 0,557
	1
	0,192/0,211 > 0,201
	0,5
	0,066/0,0068 > 0,067
	0,1
	0,040/0,080 > 0,060
	0
	0
	Amostra
	0,371/0,374 > 0,372
Com os dados da tabela acima foi traçada a curva absorbância versus concentração. O gráfico contendo tal curva está expresso abaixo.
Gráfico 1 - Curva Padrão da Glicose 5mg/mL versus absorbância lida em 570 nm.
Para descobrir o valor do Fator de Calibração usamos a fórmula:
	FC = Q/A
FC5 = 1,099 / 1,271 = 1,185
FC4 = 0,572 / 0,0545 = 0,557
FC3 = 0,192 / 0,211 = 0,201
FC2 = 0,066/0,068 = 0,067
FC1 = 0,040 / 0,080 = 0,060
Amostra = 0,371 / 0,374 = 0,372
Para descobrir o Fator de Calibração Médio usamos a fórmula:
	FCM = FC5+FC4+FC3+FC2+FC1
FCM = 1,185 + 0,557 + 0,201 + 0,067 + 0,060 = 2,07/5 = 0,414
Para calcular a concentração da amostra usamos a fórmula:   e obtemos o seguinte resultado:
Q=  0,372 X 0,414 = 0,154 (mg/mL)
CONCLUSÃO 
A indústria alimentícia é um mercado competitivo, no qual padrões de qualidade devem ser atingidos a fim de se obter propriedades desejadas nos produtos e garantir a satisfação aos consumidores. Em inúmeras situações, a determinação da concentração de açúcares é um indicador de características do produto final que será distribuído ao mercado. O conhecimento da composição dos açúcares em uma solução possibilita determinar, por exemplo, o melhor momento para o uso de uvas na produção de sucos, néctares e vinhos, dentre outros produtos alimentícios, e auxilia no controle de qualidade que é imposto pela legislação, e também desmascara qualquer produto adulterado (DORNEMANN, 2016).
Para o experimento foram preparadas cinco amostras em duplicata, 1, 2, 3, 4 e 5 no qual foram pipetados, respectivamente, 1000 μL, 500 μL, 200 μL, 100 μL e 20 μL de glicose. Em seguida, foi adicionado água destilada nos tubos 2, 3, 4 e 5 com a finalidade de obter o mesmo volume de solução que a alíquota 1. Após, foi adicionado em cada amostra 1 mL de ácido 3,5-dinitrossalicílico (ADNS). Foram preparadas outras duas soluções, as amostras A1 e A2, onde foram pipetados 100 μL de leite diluído 40 vezes e 1000 μL de ADNS em ambas, podendo ser observado uma coloração amarelada. Juntamente, foi preparado uma amostra denominada Branco (B), onde foram pipetados 1 mL de água destilada e 1 mL de ADNS. As amostras foram homogeneizadas e aquecidas em banho-maria fervente por 10 minutos para acelerar a reação entre a glicose e o ADNS.
O ADNS é um reagente amarelado, que, ao entrar em contato com o anômero da glicose (açúcar redutor) é reduzido em 3-amino-5-nitrossalicílico, um composto que proporciona a coloração vermelho-tijolo da solução. Após o aquecimento, observou-se que as soluções apresentavam uma coloração avermelhada com diferentes intensidades, devido às diferentes concentrações. As amostras A1 e A2 apresentaram a mesma coloração vermelho-tijolo das outras soluções, na mesma intensidade, devido a concentração ser aparentemente idêntica em ambas. Já no Branco pode-se observar que sua coloração permaneceu amarelada, pois não havia glicose ou lactose em solução para que a reação acontecesse.
O açúcar presente no leite é a lactose (açúcar redutor), que é um dissacarídeo composto por uma molécula de galactose unida por ligação glicosídica à uma de glicose - Galactose β (1->4) Glicose, onde podemos concluir que a alteração da coloração amarelada para vermelho-tijolo ocorreu devido ao anômero da glicose que estava livre para reagir com o ADNS.
A amostra B serve como padrão na leitura do espectrofotômetro, onde está contida na solução todos os reagentes do procedimento com exceção do que se quer quantificar. Assim, na leitura das amostras contendo glicose ou lactose, os resultados de absorbância obtidos são das mesmas.
Foram transferidos uma alíquota de cada amostra preparada para as cubetas e assim prosseguiu-se com a leitura das absorbâncias no espectrofotômetro das amostras 1, 2, 3, 4, 5 e suas duplicatas com a finalidade de obter o fator de calibração médio (FCM) da glicose, de 1. 154 mg/mL. Em seguida fizemos a leitura das amostras A1 e A2, as soluções com lactose, e através do cálculo da absorbância média entre ambas e do FCM, obtivemos a concentração de lactose 0,414 mg/mL e multiplicamos este valor por 40, devido a diluição de 40 vezes do leite, obtendo um resultado final de 16,56 mg/mL de lactose presente no leite.
O FCM da glicose foi utilizado devido a lactose possuir o carbono anomérico da glicose livre enquanto a galactose tem seu carbono anomérico ocupado por uma ligação glicosídica com o carbono4 da glicose. Sendo assim, somente a glicose participa da reação com o ADNS.
Desse modo, o produto 3-amino-5-nitrossalicílico da reação, é um composto que absorve luz facilmente (VASCONCELOS et al., 2013), potencializando a leitura de absorbância pelo espectrofotômetro.
Podemos concluir a eficiência do método através da espectrofotometria, proporcionando a possibilidade de verificar a concentração de lactose na amostra do leite.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRUNO, Alessandra Nejar et al (Org.). Biotecnologia I: Princípios e Métodos. Porto Alegre: Artmed, 2014. p 101 - 102.
DEMIATE et al. Determinação de Açúcares Redutores e Totais em Alimentos. Comparação entre Método Colorimétrico e Titulométrico. Publicatio UEPG – Exact and Soil Sciences, Agrarian Sciences and Engineering, v. 8, n. 1, p. 65-78, 2002. Disponível em: < http://www.revistas2.uepg.br/index.php/exatas/article/view/772/677 >.
DONNERMAN. Comparação de Métodos para Determinação de Açúcares Redutores e Não-redutores. UFRGS - Departamento de Engenharia Química. Porto Alegre, 2016. Disponível em: <https://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/143940/000998082.pdf?sequence=1>
Harvey, A., Ferrier, D; Bioquímica ilustrada - 5. ed. - Porto Alegre: Artmed, 2012
Nelson, L. Cox, M; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6. ed. – Porto Alegre: Artmed, 2014.
NELSON, David L.; COX, Michael M.; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 7. Ed. Porto Alegre: Artmed, 2019.
VASCONCELOS. Determinação de Açúcares Redutores pelo Ácido 3,5-Dinitrosalicílico: Histórico do Desenvolvimento do Método e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratório de Bioprocessos. Embrapa Agroindústria de Alimentos, Fortaleza, 2013. Disponível em: <https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/103 342/1/BPD13017.pdf >