- COLIFORMES TOTAIS E FECAIS: DETERMINAÇÃO PELA TÉCNICA DE TUBOS MÚLTIPLOS: MÉTODO DE ENSAIO

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE TECNOLOGIA
Missão/FT: Formar e aperfeiçoar cidadãos e prestar serviços atendendo às necessidades tecnológicas da sociedade com agilidade, dinâmica e qualidade.
	Relatório do Experimento 3 submetido à disciplina
EB207A – Laboratório de Microbiologia no dia 19/09/2017
EXPERIMENTO 3:
- COLIFORMES TOTAIS E FECAIS: DETERMINAÇÃO PELA TÉCNICA DE TUBOS
MÚLTIPLOS: MÉTODO DE ENSAIO-
Equipe 3: 
Bárbara Masson RA: 167064
Giovanna Malaquias Alves RA: 173247
Graziela da Silva RA: 173535
Natasha Padilha Tomaz Salvador RA: 184985
Wallace Gomes Ferreira RA: 188602
Docente: 
Profa. Dra. Cassiana Maria Reganhan Coneglian
LIMEIRA / S.P.
2º semestre / 2017
SUMARIO
INTRODUÇÃO................................................................ 02
OBJETIVOS......................................................................04
MATERIAIS E MÉTODOS..............................................05
MATERIAIS...............................................................05
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS..................05
RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................07
ENSAIO PRESUNTIVO............................................07
ENSAIO CONFIRMATIVO......................................08
CONCLUSÃO..................................................................09
REFERENCIAS................................................................10
ANEXO A........................................................................11
INTRODUÇÃO
A necessidade de se garantir água potável à população se dá devido ao seu consumo para diversos fins, seja para ingestão, recreação, entre outros. Com essa ampla utilização, a população está sujeita ao contato com diversos microrganismos, sendo muitos desses patógenos capazes de causar grandes epidemias de doenças ao homem, uma vez que a transmissão da maioria desses patógenos é oral-fecal (CETESB, 1993). Logo é necessário a análise e o tratamento adequado das águas de abastecimento, antes da sua distribuição à população, e avaliar se há ou não contaminação de origem fecal. Para monitorar sua qualidade, são utilizados os padrões estabelecidos na Portaria MS 2914/11, que assegura o tratamento e a distribuição de água de qualidade a toda a população. 
Para se determinar se há contaminação fecal, são utilizadas as bactérias do grupo coliformes termotolerantes, que se diferenciam dos coliformes totais, pois possuem a capacidade de fermentar a lactose a 44,5ºC (CETESB, 1993). De todo o grupo, a bactéria mais utilizada é a Escherichia coli, por ser encontrada exclusivamente em intestinos de animais de sangue quente, possibilitando conectar possíveis contaminações de origem fecal na água (CDC, 2015). Elas são importantes indicadores de contaminação, pois são liberadas em grande quantidade nas fezes e de fácil análise, ou seja, as técnicas para sua detecção são viáveis com resultados disponíveis em aproximadamente 48h (CETESB, 1993). 
A detecção de coliformes totais e termotolerantes se dá por diversos meios e técnicas, alguns mais específicos e rápidos, como o método cromogênico ou técnica de Colilert, outros pouco mais trabalhosos e demorados, como a técnica de tubos múltiplos. Porém, as técnicas são eficientes e práticas, além de serem viáveis na detecção dessas bactérias em laboratório.
A técnica de Tubos Múltiplos é utilizada para se determinar o número mais provável de bactérias para o grupo coliformes presentes numa determinada amostra. Neste método, utiliza-se um meio de enriquecimento constituído por lactose e peptona, ambas em concentrações que favorecem o crescimento de coliformes, juntamente com caldo lauril triptose, cujo princípio atua como agente seletivo, gerando o crescimento de bactérias esporuladas que produzem gás (CETESB, 1993). O meio é distribuído em 15 tubos de ensaio contendo tubos de Durhan dentro, para verificar se haverá ou não produção de gás. A cada cinco dos tubos, são inoculadas a amostra in natura e suas diluições que variam de acordo com a metodologia utilizada, sendo geralmente usadas até cinco diluições. Após a inoculação, os tubos ficam incubados a temperatura de aproximadamente 35ºC por 24h (CETESB, 1993). O volume inoculado varia de acordo com o tipo de amostra, por exemplo, se a amostra for de água para consumo humano, é utilizado 10 porções de 10 mL, preferencialmente, porém é possível utilizar cinco porções de 10 mL quando não for possível a utilização de 10 porções, atendendo já a legislação vigente. Para demais tipos de amostra, é necessário a inoculação de 1 mL em cada 5 tubos de ensaio (CETESB, 1993).
A análise e quantificação do NMP (Número Mais Provável) se dá pela quantidade de frascos em que houver produção de gás, ou seja, em que a lactose foi fermentada pelas bactérias. São utilizadas três tabelas bases que constam na Norma Técnica disponibilizada pela CETESB, sendo que sua utilização depende do volume inoculado no tubo. Através dessas tabelas e dos números de tubos que ocorreu fermentação, é possível se obter o NMP de coliformes totais e termotolerantes na amostra de água.
OBJETIVOS
Aplicar a técnica de Tubos Múltiplos e, verificar por meio dessa técnica a presença ou ausência de coliformes totais e fecais e quantificá-los pelo método do Número Mais Provável (NMP) em uma amostra de água.
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS
Amostra de água 
15 Tubos de ensaio
Água de Diluição
Pipetas de 10 mL
Meio de Cultivo - Caldo lactosado
Meio de Cultivo - EC
Alça de inoculação
Incubadora termostatizada à 35ºC
Banho – Maria
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Primeiro, identificamos a amostra para análise e definimos os volumes da mesma a serem inoculados, em função da procedência. Assim, fizemos a identificação dos tubos colocando o número da amostra volume a ser inoculado e a data. Homogeneizamos a amostra suavemente. A partir desse, fizemos a diluição em série amostra de até e colocamos a identificação dos frascos com as respectivas diluições. Homogeneizamos o frasco que contém a diluição, e com uma nova pipeta transferimos 1,0 mL em cada um dos tubos de caldo lactosado (série de 5 tubos). Repetimos o processo para as diluições de e de completando o total de 15 tubos, sendo cinco para cada diluição.
Após a inoculação de todos os volumes da amostra, incubamos a 35 +- 0,5º durante 24 horas. Depois desse período de incubação, efetuamos a primeira leitura, sendo que o resultado positivo seria a acidificação do meio ou sem produção de gás. Se os resultados forem negativos, retornar os frascos para a incubadora por mais 24 horas, e efetuar a leitura novamente após mais 24 horas. Registramos os resultados, anotamos o número de tubos com resultados positivos para cada volume inoculado.
Submetemos as culturas com resultados presuntivos aos testes confirmativos, para a determinação de coliformes totais e para diferenciar dos coliformes fecais, com o auxílio de uma alça inoculadora devidamente flambada, retiramos um inóculo da cultura positiva em caldo CL e o transferimos para um tubo contendo caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% a 35+- 0,5ºC, durante 24-48 horas e para o meio E.C. a 44,5+-0,5ºC, em banho-maria com agitação por 24 horas.
Posterior ao período de inoculação efetuaram-se as leituras, sendo resultado positivo para coliformes totais a produção de gás a partir da fermentação da lactose no meio caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%, coliformes fecais estão presente se houver produção de gás no meio E.C. Anotamos os resultados e calculamos o NMP a partir dos dados obtidos.
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
Ensaio Presuntivo 
Após realizar todos os métodos já citados e inocular por 24 horas, foi possível observar que houve dois tubos positivos para a amostra de diluição 100 e um positivopara a amostra de diluição . Assim determinamos o número mais provável através da tabela da CETESB (Anexo A) e da equação 1. 
Equação (1)
O índice que corresponde ao código (2 - 1 - 0 ) de amostras que apresentaram resultado positivo é 7 NMP/100 mL e o maior volume que positivou foi o de 1mL. Portanto realizando o calculo se encontrou o resultado de 70 NMP/100 mL de coliformes totais e fecais.
	Porém mesmo acidificando e havendo produção de gás nos meios positivados, tem-que se fazer o ensaio confirmativo já que o meio utilizado para o ensaio presuntivo não é um meio seletivo apenas para coliformes fecais e para coliformes totais do trato humano e animal. Também não se pode afirmar apenas com o ensaio presuntivo que esta amostra sofreu contaminação fecal ou que têm patógenos, já que bactérias presentes no ambiente, como por exemplo, no solo ou em plantas, podem também fermentar a lactose (a lactose pode ser usada como fonte de carbono orgânico) (FRANCO&LANDGRAF, 2003). Assim, pode-se afirmar apenas com o ensaio presuntivo que há bactérias fermentadoras de lactose na amostra, não sabendo se são coliformes fecais e totais e não podendo se afirmar que houve contaminação fecal.
Ensaio Confirmativo
Como três dos tubos positivaram, inoculou-se no meio lactosado verde brilhante e no meio E.C. para assim se confirmar os resultados do ensaio presuntivo e avaliar a presença de E. coli ( o principal indicador de coliformes fecais) e de coliformes totais. 
No meio verde brilhante, que é seletivo para coliformes totais, o resultado foi positivo para as três amostras. Nesse meio há o crescimento de bactérias comuns em animais de sangue quente (FRANCO&LANDGRAF, 2003). O meio ficou turvo e houve produção de gás no tubo de Durhan. Assim, pode se confirmar que o resultado é de 70 NMP/100 mL de coliformes totais. 
As três diluições também positivaram no meio de cultivo E.C., deixando a amostra turva e havendo detecção da produção de gás pelo tubo Durhan, ocasionado pela fermentação da lactose. Portanto pode-se afirmar que o resultado é de 70 NMP/100 mL de coliformes fecais. 
Se baseando na Portaria 2.914/2011 pode-se dizer que esta amostra que foi coletada de um poço, se encontra imprópria para consumo humano, pois apresenta organismos indicadores de contaminação fecal e pode acabar ocasionando patologia em quem consumi-la já que pode conter organismos endopatogênos. Para tornar esta água própria para beber, tem-que se trata-la convencionalmente visando sua potabilidade. Portanto, pode-se confirmar que a amostra foi contaminada por material fecal, apresenta coliformes totais e coliformes fecais e que está imprópria para o consumo humano.
CONCLUSÃO
Após o experimento, com os resultados concluídos, constatou-se que o teste é válido para confirmação e quantificação das bactérias do grupo Coliformes. O método dos Tubos Múltiplos é simples e eficaz, tendo confiança de 95% segundo a Cetesb (1993). Pelo ensaio presuntivo foi possível se concluir que havia bactérias fermentadoras de lactose na amostra, pois acidificaram três meios. Foram feitos os cálculos e chegou-se ao provável resultado de 70 NMP/ 100 mL de coliformes fecais e coliformes totais. Com o ensaio confirmativo pode-se afirmar o resultado calculado na etapa presuntiva, pois houve a positivação de coliformes totais e fecais de novo nas três amostras. Deste modo, a Portaria 2.914/2011 de potabilidade de água nos fala que a amostra analisada é imprópria para consumo humano, pois é padronizada a ausência dessas bactérias em amostras de 100 mL, assim sendo necessárias ações corretivas para o abastecimento público.
REFERENCIAS
BRASIL, Ministério da saúde. Portaria nº 2914 de 12 /2011. Diário oficial, poder executivo, Brasília, DF, 12. Dez.2011. 
CETESB (Estado). Constituição (1993). Norma nº L5. 202, de janeiro de 1993. Coliformes Totais e Fecais - Determinação Pela Técnica de Tubos Múltiplos: Método de Ensaio. 1. ed. São Paulo, SP, Disponível em: <http://cetesb.sp.gov.br/normas-tecnicas-cetesb/normas-tecnicas-vigentes/>. Acesso em: 20 out. 2017.
FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu: São Paulo, 2003. 182p.
ANEXO A