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TÉCNICA DE FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE ANFÍBIOS ANUROS WILLIAM NASCIMENTO SILVA Graduando do Curso de Ciências Biológicas da Universidade Castelo Branco, Rio de Janeiro, RJ, Brasil; estagiário da Fundação Instituto de Pesca do Estado do Rio de Janeiro-FIPERJ. Willian_pok@hotmail.com MARIANNA SEVERO DE SOUZA Graduanda do curso de Zootecnia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, Brasil, estagiária da Fundação Instituto de Pesca do Estado do Rio de Janeiro-FIPERJ. Marianna.sev@hotmail.com ELAINE DA CONCEIÇÃO PINTO DE OLIVEIRA Analista de Recursos Pesqueiros da Fundação Instituto de Pesca do Estado do Rio de Janeiro, Guaratiba, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. elainep2000@bol.com.br MARCELO MAIA PEREIRA Pesquisador da Fundação Instituto de Pesca do Estado do Rio de Janeiro, Rio das Flores, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. mmaiap2001@yahoo.com.br JOSÉ TEIXEIRA DE SEIXAS FILHO Pesquisador da Fundação Instituto de Pesca do Estado do Rio de Janeiro ; docente do Centro Universitário Augusto Motta. Guaratiba, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. jseixas4@gmail.com SILVIA CONCEIÇÃO REIS PEREIRA MELLO Pesquisadora da Fundação Instituto de Pesca do Estado do Rio de Janeiro – Guaratiba; docente do Centro Universitário Augusto Motta, Guaratiba, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. silviaqua@uol.com.br RESUMO As estratégias reprodutivas em anfíbios anuros derivam de uma combinação de atributos morfológi- cos, fisiológicos e comportamentais, adaptados a certas condições ambientais. Para uso da técnica de fertili- zação artificial, os reprodutores e matrizes são man- tidos em instalações com controle da temperatura e do fotoperíodo. Dentre as espécies de anfíbios anuros, a mais estudada é a Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802), popularmente conhecida como rã-touro (Bull- frog). O estudo foi realizado em fevereiro de 2016, no Laboratório de Pesquisa em Ranicultura da Estação Experimental de Aquicultura Almirante Paulo Morei- ra da Fiperj, localizado na cidade do Rio de Janeiro. Foram selecionados oito machos e três fêmeas, os ani- mais foram separados em três grupos. Para indução à espermiação e ovulação foi utilizado produto a base de acetato de buserelina (Análogo sintético do GnRH). Os reprodutores (machos) de rã-touro receberam uma aplicação de 0,1mL na cavidade celomática uma hora antes da coleta do sêmen, já as fêmeas receberam duas Revista Semioses, V 11, n.02, 2017 ARTIFICIAL FERTILIZATION TECHNIQUE FOR ANURAN AMPHIBIANS https://doi.org/10.15202/1981996x.2017v12n2p40 doses de 1 mL com intervalo de 12 horas entre uma aplicação e outra. O manejo da extração dos óvulos foi realizado segurando a fêmea pelas patas posteriores e comprimindo levemente o ventre, os óvulos foram coletados em um recipiente, seco e limpo. O esperma diluído foi vertido sobre os óvulos, agitando-se a mis- tura por, aproximadamente, dois minutos. Os ovos fe- cundados foram misturados com água até a completa hidratação. A fertilização artificial é uma técnica que pode ser utilizada com sucesso em programas de me- lhoramento genético de anfíbios, reprodução para re- povoamento, assim como em ranários comerciais. Palavras-chave: Lithobates catesbeianus. Fertilização artificial. GnRH. Reprodução. ABSTRACT The reproductive strategies in anuran am- phibians derive from a combination of morphologi- Revista Semioses, V 11, n.02, 2017 cal, physiological and behavioral attributes adapted to certain environmental conditions. For use of the artifi- cial fertilization technique, the males and females are kept in facilities with temperature and photoperiod un- der control. Among the species of anuran amphibians, the most studied is Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802), popularly known as bullfrog. The study was conducted in February 2016 at Research Laboratory in Admiral Paulo Moreira Aquaculture Station of the Fi- perj, located in the city of Rio de Janeiro. Eight males and three females were selected, the animals were se- parated into three groups. For induction to spermiation and ovulation, a product based on buserelin acetate (synthetic GnRH analogue) was used. Bull frog males were given 0.1 mL application in the Peritoneal cavity one hour before semen collection, while the females received two doses of 1 mL with 12-hour interval be- tween one application and another. The management of egg extraction was performed by holding the female by the hind legs and lightly compressing the belly, the eggs were collected in a clean and dry container. The diluted sperm was poured onto the ovules, the mixtu- re being stirred for approximately two minutes. The fertilized eggs were mixed with water until complete hydration. Artificial fertilization is a technique that can be successfully used in amphibian breeding programs, reproduction for restocking, as well as in commercial frog farms. Key words: Lithobates catesbeianus. Artifi- cial fertilization. GnRH. Reproduction 1 INTRODUÇÃO Como todo animal presente naturalmente em um ambiente, os anfíbios desempenham um papel fun- damental no funcionamento do mesmo, e se por algu- ma eventualidade deixarem de existir, sérias complica- ções poderão ocorrer. De acordo com as observações de Hayes et al. (2010) os anfíbios estão em declínio no mundo todo, provavelmente por um sinergismo de fatores. A taxa de declínio dos anfíbios é de no mínimo 211 vezes maior do que a predita pelo registro fóssil (MCCALLUM, 2007) e infere-se que a degradação ambiental causada pelo homem é o fator que mais tem incrementado as taxas de declínio e extinção destes animais. Sendo assim, Wake e Vredenburg (2008) res- saltaram que estamos entrando na sexta onda de extin- ção em massa dos anfíbios. As cinco anteriores foram naturais e esta sexta é, provavelmente, acelerada pe- los impactos causados pela sociedade (MCCALLUM, 2007). Declínios catastróficos são ainda mais preocu- pantes quando ocorrem nas regiões de alta riqueza e endemismo de espécies do planeta. Este é justamente o caso do Brasil, detentor absoluto do maior número de espécies, abrigando aproximadamente 17% da diversi- dade global, e o maior número de espécies endêmicas do mundo (FROST, 2010; SBH, 2016). Esta riqueza ainda está em constante ascensão e deve aumentar sig- nificativamente nos próximos anos, por meio de des- crições de novas espécies e rearranjos taxonômicos (ARAÚJO et al. 2009). O desaparecimento dos anfíbios pode trazer diversos problemas, como por exemplo, o fato de que os anfíbios se alimentam fundamentalmente de insetos e consomem uma quantidade massiva destes organis- mos por ano. A remoção dos anfíbios em um ambiente deve, portanto, acarretar em desequilíbrio ecológico, gerando surtos de pragas agrícolas. Esta situação já foi registrada na Índia, gerando a necessidade de uso extensivo de inseticidas, causando prejuízos ao agro- negócio e aumentando a poluição ambiental (OZA, 1990). Um grande número de pessoas vem buscando cada vez mais produtos orgânicos, que somente podem ser produzidos com auxílio de controle biológico e, os anfíbios, participam ativa e diretamente desse contro- le. Nos corpos d’água a incidência da eutrofização tem aumentado e os anfíbios anuros na fase larval (girinos) se alimentam de algas e a extirpação destas larvas dos ambientes aquáticos, contribuirá para elevar à eutro- fização de rios e principalmente de reservatórios de água. Isto pode prejudicar o abastecimento de água potável para a população, além de encarecer o valor do seu tratamento para o consumo humano (TOLEDO et al, 2010). Outra ocorrência esperada é o aumento de patologias, pelo fato dos anfíbios, em muitas situações, corresponderem à maior biomassa de vertebrados ter- restres em um ambiente, constituindo a base da dieta de diversos organismos terrestres e aquáticos. Ademais,se alimentam de uma grande quantidade de invertebra- dos, proporcionando seu controle. Logo, a extinção ou declínio dos anfíbios de um ambiente, deverá acarre- tar desequilíbrios em diversos níveis tróficos, prejudi- cando o ecossistema como um todo. Um dos possíveis efeitos é o aumento de epidemias de doenças trans- mitidas por insetos vetores (RAGHAVENDRA et al. 2008), também poderá acarretar impactos na indústria farmacêutica visto que os anfíbios produzem uma mi- ríade de substâncias por suas glândulas cutâneas, para defesa contra predadores, contra micro-organismos e patógenos, ou mesmo para permitir trocas gasosas adequadas (já que boa parte da respiração é cutânea). Muitos destes compostos químicos estão sendo utiliza- dos para produção de fármacos no Brasil e no mundo (CAMARGO 2005; PUKALA et al. 2006). 42 TÉCNICA DE FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE ANFÍBIOS ANUROS nas em ambientes úmidos (DUELLMAN, 1989). Dentre todas as espécies de anfíbios anuros, a espécie abordada mais profundamente é a Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802), popularmente conhecida como rã-touro (Bullfrog), assim denominada porque o macho na época da reprodução emite um som potente, o coaxar, muito parecido com mugido de boi (FERREI- RA et al, 2002; IFSC, 2016). Em relação às fêmeas, um aspecto reprodutivo interessante é que quando adultas, permanecem maduras durante o ano todo (COSTA, 1991), todavia, o processo de maturação final e ovu- lação somente é desencadeado por estímulos ambien- tais, como as chuvas e o aumento da temperatura logo após o final do inverno (AGOSTINHO et al, 2000), contudo, para que a temperatura tenha efeito sobre a reprodução há necessidade de que as rãs estejam sen- sitivas, o que depende de um ritmo circadiano endó- geno (BEATTIE, 1985). A luz não tem seu papel bem definido para os anuros (SALTHE; MECHAM, 1974), entretanto, sabe-se que os anfíbios mantidos em labo- ratórios ajustam seus estados fisiológicos às condições de luz oferecidas (EASLEY et al., 1979). A temperatu- ra e o fotoperíodo controlados artificialmente afetam o desenvolvimento dos órgãos reprodutivos das fêmeas de rã-touro e um fotoperíodo de 12/12 (L/E) evita a regressão dos ovários (FIGUEIREDO et al., 2001). 3 FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE ANFÍBIOS ANUROS Para garantir a reprodução nos sistemas de produção, pesquisas em melhoramento genético e pro- jetos de repovoamento existem técnicas de reprodução artificial ou induzida, esses métodos podem ser reali- zados em laboratório, onde os reprodutores e matrizes são mantidos em instalações com controle da tempera- tura e fotoperíodo. Com esse controle, os fatores abió- ticos se assemelhem ao natural. Os primeiros trabalhos de indução à reprodução de rã-touro pelo uso de hi- pófises foram realizados por Rugh (1935). Em 1974, o National Academy of Science (NAS, 1974) propôs a utilização de duas hipófises misturadas com 5 mg de progesterona para a indução da ovulação. Ribeiro Filho (1998) trabalhou com várias dosagens de hipófi- se e obteve os melhores resultados com 5 ou 7 mg/kg aplicados em duas doses (10% do total na primeira e o restante na segunda dose, 12 horas após). As técnicas de indução à ovulação e fertilização artifi- cial têm importante papel na resolução deste problema, pois usam hormônios liberadores de gonadotropina para desencadear o processo reprodutivo e possibili- 2 REPRODUÇÃO DOS ANFÍBIOS ANUROS As estratégias reprodutivas em anfíbios anu- ros derivam de uma combinação de atributos morfo- lógicos, fisiológicos e comportamentais, adaptados a certas condições ambientais. Embora muitas espécies de anuros tropicais possam se reproduzir ao longo do ano, a chuva parece ser o fator extrínseco primário no controle dos padrões reprodutivos dessas espécies (DUELLMAN; TRUEB, 1986). Wells (1977) consi- derou dois padrões temporais de comportamento re- produtivo em anuros: o explosivo e o prolongado. A reprodução explosiva estende-se por poucos dias, ao passo que a prolongada por várias semanas. Estes dois padrões reprodutivos influenciam as estratégias repro- dutivas adotadas pelas populações de anuros. A diversidade de modos de reprodução nos anuros é uma das maiores observada para os vertebra- dos (DULLMAN; TRUEB, 1986). Os anfíbios anuros possuem a maior diversidade de modos reprodutivos dentre os vertebrados tetrápodes, com 39 modos co- nhecidos (HADDAD; PRADO, 2005). Nas comunida- des de anuros neotropicais, isso se deve à existência de espécies que apresentam modos de reprodução mais generalizados, onde os ovos são depositados direta- mente na água, e de espécies que apresentam modos de reprodução mais especializados, inclusive em ambien- tes terrestres. Entre as diferentes espécies de anuros, é evidente uma tendência a uma menor dependência dos ambientes aquáticos, chegando a ocorrer independên- cia total destes ambientes nos grupos mais especiali- zados (SALTHE; DUELLMAN, 1973; DUELLMAN, TRUEB 1986; DUELLMAN, 1989; HODL, 1990). A alta pluviosidade e a umidade e temperatura elevadas possivelmente influenciaram na diversificação evolu- tiva de formas de reprodução nas florestas tropicais (HODL, 1990). Além disso, é possível que a predação tenha exercido forte pressão, na evolução de formas menos dependentes da água (MAGNUSSON; HERO, 1991; HADDAD; PRADO, 2005). Geralmente pressu- põe-se que, em anuros, a desova aquática é a condição reprodutiva primitiva e as desovas terrestres, com de- senvolvimento direto, o modo mais derivado (DUELL- MAN; TRUEB, 1986). Alguns modos reprodutivos evoluíram independentemente em diferentes linhagens filogenéticas, ao passo que outros são conhecidos ape- nas em uma (DUELLMAN, 1989). Uma tendência evolutiva na reprodução dos anuros foi a remoção dos ovos da água. Como os anuros não desenvolveram es- truturas eficientes contra a dessecação de suas desovas, ovos não aquáticos destes animais são conhecidos ape- 43 TÉCNICA DE FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE ANFÍBIOS ANUROS 4 METODOLOGIA O estudo foi realizado na Estação Experi- mental de Aquicultura Almirante Paulo Moreira, no Laboratório de Pesquisa em Ranicultura, localizado na cidade do Rio de Janeiro, coordenadas geográfi- cas 22°59’58.1’’S 43°, 35’25.9’’W em fevereiro de 2016. Foram selecionados oito machos e três fême- as, os animais permaneceram em jejum para coleta do sêmen por um período de 48 horas, segundo téc- nica proposta por Agostinho et al. (2010), os óvulos das fêmeas foram coletados dentro desse período. Os animais foram separados em três grupos, para possi- bilitar a fertilização artificial do produto (óvulos) de três fêmeas: grupo1 (1 fêmea e 3 machos); grupo 2 (1 fêmea e 2 machos); grupo 3 (1 fêmea e 3 machos). Para indução à espermiação e ovulação foi utilizado o produto Sincroforte® a base de acetato de buseralina (Análogo sintético do GnRH). Os reprodutores (ma- chos) de rã-touro receberam uma aplicação de 0,1mL de Sincroforte® na cavidade celomática uma hora an- tes da coleta do sêmen, já as fêmeas receberam duas doses de 1 mL com intervalo de 12 horas entre uma aplicação e outra. Para extração do volume seminal foi utilizado uma pipeta de vidro de 2mL, que foi introduzida na cloaca dos animais e ao mesmo tempo foi realizada uma massagem com os dedos na cavidade celomática, próximo a região pélvica (figura 1). A coleta do sê- men dos exemplares de rã-touro foi realizada após 60 minutos da aplicação do produto hormonal, de acordo com o preconizado por Agostinho et al (2000). Figura 1: Aspecto da técnica de coleta do sêmen de macho de rã-touro (Lithobates catesbeianus). Fonte: foto de William Nascimento Silva Antes do manejo de fertilização artificial, os óvulos extraídos de cada fêmea foram pesados e foi mensurado o volume do sêmen obtido de cada grupo tam a sincronização das desovas parao período de- sejado (AGOSTINHO et al, 2000). A solução viável para o produtor de rãs é o uso de hormônios libera- dores de gonadotropina análogos, que têm apresen- tado excelentes resultados na indução da ovulação e espermiação, são facilmente encontrados e de fácil aplicação. Entre estes pode-se citar o acetato de bu- serelina (ALONSO, 1997). O emprego de hormônio sintético para induzir a ovulação e espermiação é uma técnica rotineira em laboratórios, entretanto, a utili- zação da técnica de fertilização artificial em ranários comerciais ainda é limitada, devido à sua complexida- de e à baixa fecundidade obtida, quando se emprega a metodologia descrita nos trabalhos publicados até o momento. A importância dessas técnicas de reprodu- ção consiste em ajudar a recuperar espécies que so- frem com a constante degradação do meio ambiente em que vivem, visto que, a constante degradação dos ecossistemas naturais é ocasionada pelas ações antró- picas, que implicam na alteração ou eliminação com- pleta dos “micro-habitats” específicos explorados por anuros, considerada o principal fator responsável pelo declínio populacional observado em diversas espécies de anfíbios (YOUNG, 2001). A literatura apresenta uma série de informações para permitir a interferência e facilitar o repovoamento das espécies na natureza e a reprodução em cativeiro, dentre estas, uma de gran- de importância é a criopreservação do sêmen visando garantir a existência de gametas para a reprodução e a manutenção de bancos de recursos genéticos de con- servação de anfíbios (KOUBA; VANCE, 2009). De acordo com Lima e Agostinho (1988), a técnica de fertilização artificial consiste na aplicação de hormônio nos machos e nas fêmeas, coleta de es- perma que é feita por meio da introdução de uma pi- peta na cloaca do macho e extração dos óvulos das fêmeas. Para a extração é necessário segurar a fêmea pelas patas posteriores comprimindo levemente o ventre com o auxílio do polegar. Os óvulos são cole- tados em recipiente seco e limpo e o esperma diluído é vertido sobre os óvulos, agitando-se a mistura por, aproximadamente, dois minutos. Os ovos fecundados são misturados em 15 litros de água, até a completa hidratação. Após a hidratação, os ovos são colocados em incubadoras flutuantes providas de fundo de tela plástica com malha de 1,0 mm (1,0 m x 0,70 m). 44 TÉCNICA DE FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE ANFÍBIOS ANUROS Fonte: Tabela elaborada pelos autores As fêmeas mais pesadas apresentaram deso- vas maiores e, consequentemente, a quantidade de ovos foi maior. Para o grupo 1, devido ao tamanho, a desova foi dividida em dois recipientes, um com seis litros e outro com sete litros. De cada recipiente foram feitas três amostragens de 40 mL para contagem dos ovos. A média obtida foi de 30,83 ovos/ 40mL, então para os 13 litros a quantidade total estimada foi de 10.020 ovos. Para o grupo 2, a quantidade de ovos foi estimada pela contagem de 40 mL de amostra em tri- plicata, coletada do recipiente de hidratação, a média foi de 12 ovos/ 40mL, como estavam alojados em um recipiente de sete litros, o número total estimado foi de 2.100 ovos. Essa menor quantidade esta relaciona- da ao peso da fêmea que também era mais jovem. Para o Grupo 3, a estimativa do número de ovos seguiu o mesmo procedimento adotado nos grupo 2 e o total foi de 4.025 ovos. Em relação ao número de ovos, Agostinho et al. (2000) observaram em desova obtida por indução, no mês de julho, um número de 12.500 ovos, bem pró- ximo da quantidade obtida no presente trabalho. Lima e Agostinho (1992) e Ribeiro Filho et al. (1998) rela- taram que a capacidade de produção de ovúlos em rã- -touro fica entre 2.000 e 25.000. Levando-se em con- sideração a idade da fêmea (SILVA, 1982) relatou que a primeira desova foi observada com mais freqüência em animais com dois anos de idade, que apresenta- ram, em média, 1.500 ovos por desova, ressaltando-se que, à medida que há o envelhecimento das fêmeas, sua capacidade reprodutiva vai aumentando até atin- gir, não raro, 20.000 ovos. A quantidade média de ovos obtidos em deso- vas de Lithobates catesbeianus é de 5.000, sendo que de machos em mililitros. O manejo da extração dos óvulos foi realizado segurando a fêmea pelas patas posteriores e compri- mindo levemente o ventre com o auxílio do polegar (fi- gura 2). Os óvulos foram coletados em recipiente seco e limpo. O tempo necessário para o completo esgota- mento do ovário foi de aproximadamente um minuto. O esperma foi vertido sobre os óvulos, agitando-se a mistura por, aproximadamente, dois minutos. Os ovos fecundados foram misturados com água até a completa hidratação. Figura 2: Extrusão dos óvulos de fêmea de rã-touro (Litho- bates catesbeianus) uma das etapas da reprodução induzida em cativeiro Fonte: foto de William Nascimento Silva Uma amostra de ovos hidratados, obtidos de cada grupo, foi coletada em triplicada em um Becker de 40 mL e feita a contagem para se estimar a média de ovos por mL para posterior estimativa do número total de ovos obtidos. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na tabela 1 a seguir observa-se o peso das fê- meas e dos machos, o peso total dos óvulos obtidos, o volume de sêmen por grupo de machos e o número estimado de ovos por desova. Tabela 1: Peso das fêmeas, peso médio dos machos e desvio padrão, peso total dos óvulos, volume total de sêmen e número estimado de ovos de cada grupo de animais. 45 TÉCNICA DE FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE ANFÍBIOS ANUROS REFERÊNCIAS AGOSTINHO, C. A.; WECHSLER, F. S.; NICTHE- ROY, P. E. D. O.; PINHEIRO, D. F. 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Ferreira et al. (2002). Oliveira; Moura (1988) afirmaram que o número de ovos por desova varia de 2.777 a 6.446, entre animais de um a cinco anos. Os machos utilizados nos três grupos desse estudo apresentaram peso médio semelhante aosma- chos utilizados por Nascimento (2015), em seu traba- lho de análise da eficácia hormonal do acetato de bu- serelina. O peso médio desses animais foi de 497,7 g ±72,4 e foi utilizada a proporção de três machos para cada fêmea, evidenciando a necessidade da utilização de um número maior de machos para viabilizar a fe- cundação dos óvulos de uma fêmea. 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS A fertilização artificial é uma técnica que pode ser utilizada com sucesso em programas de me- lhoramento genético e repovoamento, assim como em ranários comerciais. Essa técnica de reprodução tem grande im- portância na recuperação de espécies que sofrem com a degradação do meio ambiente em que vivem, visto que, a constante degradação dos ecossistemas naturais é ocasionada pelas ações antrópicas, que implicam na alteração ou eliminação completa dos “micro-ha- bitats” específicos explorados por anuros (YOUNG, 2001). Para que a técnica de fertilização artificial seja realizada com sucesso, os reprodutores e matrizes deverão ser mantidos em baias climatizadas com foto- período, umidade e temperatura controlados. Segundo Figueiredo et al (2001), a temperatura e o fotoperíodo afetam o desenvolvimento dos órgãos reprodutivos das fêmeas de rã-touro. O estudo evidenciou que o peso e idade dos animais influenciam o número de óvulos e espermatozóides obtidos e, segundo os autores pesquisados (SILVA, 1982; LIMA e AGOSTINHO, 1992; RIBEIRO FI- LHO et al, 1998; AGOSTINHO et al., 2000; FERREI- RA et al., 2002), a capacidade de produção de óvu- los em rã-touro varia de 2.000 e 25.000, sendo que a quantidade de óvulos na desova é menor em animais mais jovens. 46 TÉCNICA DE FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE ANFÍBIOS ANUROS ria, 1992. 168p. LIMA, S. L., AGOSTINHO, C. A. A criação de rãs. São Paulo, Globo, 1988. 187p. MAGNUSSON, W. E.; HERO, J. M. Predation and the evolution of complex oviposition behaviour in Amazon rainforest frogs. Oecologia, v. 86, n. 3, p. 310-318, 1991. MCCALLUM, M. L. Amphibian decline or extinc- tion? Current declines dwarf background extinction rate. Journal of Herpetology, v. 41, n. 3, p. 483-491, 2007. NASCIMENTO, N. F.; SILVA, R. C.; VALENTIN, F. N.; PAES, M. D. C. F.; De STEFANI, M. V.; NAKA- GHI, L. S. O. 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