Labiocel 2002 - Manual de técnicas em histologia e biologia celular - USP

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LABIOCEL 1 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
 
FACULDADE DE MEDICINA 
 
 
 
 
 
MANUAL DE TÉCNICAS EM HISTOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR DO 
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR DA FACULDADE DE MEDICINA DA 
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
 
 
 
 
 
 
 
CONSOLIDAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
2002 
 
 
 
 
 
LABIOCEL 2 
ÍNDICE GERAL 
 
Apresentação 
Protocolo para obtenção e fixação de material a ser 
processado no Laboratório de Biologia Celular 
 
I. Preparo de soluções 
 1. Cálculos 
 2. Instruções gerais 
 3.Soluções mais usadas 
II. Tampões 
III. Microscopia de luz 
 1. Técnicas de Fixação 
 2. Descalcificação 
 3. Inclusão em Parafina 
 4. Microtomia 
 5. Preparação de lâminas e colagem de cortes 
 6. Digestões enzimáticas 
 7. Colorações (técnicas de uso corrente) 
IV. Métodos histoquímicos 
 1. Metais e ânions 
 2. Detecção de radicais químicos em proteínas 
 3. Lípides 
 4. Polissacarídeos 
 5. Ácidos Nucleicos 
 6. Grânulos citoplasmáticos 
 7. Fibras da matriz extracelular 
LABIOCEL 3 
V. Historesina 
VI. Processamento de Material para Microscopia Eletrônica 
de Transmissão 
VII. Uso do Microscópio Eletrônico 
VIII. Revelação e Ampliação de Micrografias 
IX. Arquivos e Registros no Laboratório de Biologia 
Celular 
X. Guia de Trabalhos Práticos 
 
 
 
LABIOCEL 4 
 
Apresentação 
 
 
 Este texto não pretende ser enciclopédico; assim reune, de forma sistemática, a descrição 
de apenas aqueles procedimentos que são utilizados rotineiramente no Laboratório de Biologia 
Celular (LIM/59) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São 
Paulo. 
 
 Levou-nos a tomar a iniciativa de redigir este manual o fato de que os muitos profissionais 
das diversas áreas de saúde que fazem estágios no nosso Laboratório utilizam grande parte do seu 
tempo para copiar nos seus cadernos pessoais as descrições dos procedimentos que utilizamos 
rotineiramente e nos quais solicitaram ser treinados. Com o objetivo de que possam aproveitar o 
estágio mais racionalmente, deliberamos que seria mais apropriado fornecer a eles um texto que 
reúna a descrição de todas as técnicas e assim lhes permita concentrar-se preferencialmente no 
desenvolvimento de habilidades em lugar de desperdiçar tempo em longas sessões de transcrição 
manuscrita de receitas. 
 
 Sugere-se ao leitor que, ao consultar o texto na busca de uma informação, tenha o cuidado 
de ler toda a seção do capítulo correspondente. No processo de redação tentou-se evitar 
repetições; assim, pode existir alguma informação essencial em itens complementares, logo acima ou 
abaixo do assunto procurado. 
 
 Esta versão preliminar certamente poderá ser aperfeiçoada com o tempo, através da 
experiência do seu uso e das sugestões que vierem, tornando-a mais sucinta e de melhor 
apresentação. Assim, esperamos contribuições para seu aprimoramento. 
 
 
 Profa. Dra. Elia Garcia Caldini 
 Chefe do Laboratório de Biologia Celular 
 
 
PROTOCOL 1 
 
PROTOCOLO PARA OBTENÇÃO E FIXAÇÃO DE MATERIAL A SER 
PROCESSADO NO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR 
 
CUIDADOS: 
Tanto para microscopia de luz quanto para microscopia 
eletrônica, deve-se tomar cuidado com: 
1) não deixar o material secar enquanto está sendo 
recortado. 
2) usar sempre uma gilete nova para recortar o material. 
3) o volume do fixador deve ser, pelo menos, 20 vezes 
maior que o volume do fragmento a ser fixado. 
 
1. MICROSCOPIA DE LUZ 
 
O material deverá ser fixado em paraformaldeído a 4% em 
tampão fosfato. Este fixador poderá ser obtido no 
Laboratório de Biologia Celular. 
O material deverá ter, pelo menos um dos lados, com, no 
máximo, 3 mm de espessura, podendo ter a forma de um 
paralelepípedo. Assim, o fixador poderá penetrar no 
interior do fragmento. 
O material deve ser deixado no fixador por, no mínimo, 24 
horas e, no máximo, 48 horas, devendo ser então colocado 
no álcool 70 ou ser trazido para o Laboratório de Biologia 
Celular para ser processado. 
 
PROTOCOL 2 
2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA 
 
O material deverá ser fixado em glutaraldeído a 2% em 
tampão fosfato 0,15M em dois frascos, sendo que, em um 
deles, deve-se dissolver ácido tânico 0,1% no 
glutaraldeído. 
O glutaraldeído deve ser guardado congelado até a hora da 
cirurgia. Na hora de usar, em um dos frascos colocar o 
ácido tânico pesado na quantidade apropriada e, antes de 
colocar o glutaraldeído, etiquetar os frascos 
GLUTARALDEÍDO e GLUTARALDEÍDO COM ÁCIDO TÂNICO. 
Pouco antes de usar, descongelar o glutaraldeído apenas 
com o calor da mão e colocá-lo, na quantidade apropriada 
nos frascos. 
O material deve ter, pelo menos um dos lados, com, no 
máximo, 1 mm de espessura. Aconselha-se a fazer com forma 
de um paralelepípedo de 10 mm x 1 mm x 1 mm. 
A fixação deve durar 2 horas. Deve-se anotar a hora em que 
o material foi colocado no fixador e entregá-lo no 
Laboratório de Biologia Celular antes de completar o tempo 
de fixação; se isto não for possível, deixar o material na 
geladeira (não no congelador) e entregá-lo ao Laboratório 
o quanto antes. Isto é essencial, pois cada minuto a mais 
no fixador contribui para piorar a qualidade do material. 
 
Entrar em contato conosco pelo telefone (852.2188 ou 
851.4011 ramal 241) para combinar horário de entrega. 
PROTOCOL 3 
 
PREP-SOL 1 
I. PREPARO DE SOLUÇÕES 
 
1. CÁLCULOS 
 
1.1. CÁLCULO DA NORMALIDADE DE UM LÍQUIDO (ml/l) 
 
 
 PESO MOLECULAR 
1N= ------------------------------------- 
 VALÊNCIA x PESO ESPECÍFICO x concent. 
 (densidade) (%) 
 
Ex.: Ac. Sulfúrico: 
 98,078 
 1N = ------------------ = 28,032 ml/litro 
 2 x 1,83 x 0,96 
 
 
 
1.2. CÁLCULO DA MOLARIDADE 
 
 1M = 1 mol/l = P.M./1 litro 
 
 
1.3. CÁLCULO PARA DILUIÇÃO DE SOLUÇÕES 
 
Ex: para obterem-se 100 ml de solução 0.15M a partir de 
uma solução estoque 1M. 
 Deve-se, primeiro, dividir a molaridade da solução 
estoque pela molaridade da solução desejada. O resultado 
representa o número de diluições. 
 
 1M/0.15M = 6.66 
 
Em seguida, deve-se dividir o volume desejado pelo número 
de diluições. 
 
 100 ml/6.66 = 15,01 
 
Portanto, necessita-se de 15,01 ml da solução estoque 1M e 
84,99 ml de água para obter-se 100 ml da solução a 0.15M. 
PREP-SOL 2 
2. INSTRUÇÕES GERAIS 
 
- Em qualquer solução que envolva a mistura de ácido e 
água, deve-se sempre ter o cuidado de jogar o ácido na 
água. 
 
- As diluições não alteram o pH de uma solução; o que se 
altera quando se dilui uma solução é a sua molaridade. 
 
 
3. SOLUÇÕES MAIS USADAS: 
 
3.1. SOLUÇÃO SULFOCRÔMICA (PARA LIMPAR VIDRARIA) 
 
Bicromato de Potássio......... 50 g 
Água destilada................500 ml 
Ácido sulfúrico conc......... 150 ml 
 
Dissolver o bicromato de potássio na água destilada 
quente. Resfriar. Colocar o balão dentro da pia cheia de 
água e adicionar lentamente o ácido sulfúrico. 
Deixar o material a ser limpo mergulhado na solução por 
algumas horas ou de um dia para outro. 
 
3.2. PREPARO DO COLÓDIO A 1% 
 
Álcool Absoluto..............50 ml 
Éter Etílico.................50 ml 
Celoidina em pó...............1 g 
 
 
3.3. NaOH 1 NORMAL 
 
NaOH pastilhas....................40 g 
Água destilada..................1000 ml 
 
 
3.4. HCL 1 NORMAL 
 
Ácido clorídrico comercial................82 ml 
Água destilada..........................1000 ml 
 
 
3.5. ÁLCOOL-ÁCIDO 
 
Ácido clorídrico....................1 ml 
Álcool 70°.........................99 ml 
 
 
 
TAMPÃO 1 
II. TAMPÕES 
 
1. PBS (SOLUÇÃO SALINA TAMPONADA)Cloreto de sódio............................9 g 
Tampão Fosfato 0,1M (pH 7,2 a 7,3).......100 ml 
Água destilada............completar para 1000 ml 
 
 
2. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,1M a diferentes pHs. 
 
Solução A: solução 0,2M de fosfato de sódio monobásico 
(NaH2PO4H20; PM = 138,01): 
27,6 g/1000 ml de água destilada. 
Solução B: solução 0,2M de fosfato de sódio bibásico 
(Na2HPO4; PM = 141,98): 
28,4 g/1000 ml de água destilada. 
 
Misturando-se os volumes indicados na tabela abaixo e 
completando-se para 200 ml com água destilada pode-se 
fazer tampão fosfato 0,1M a diferentes pHs. 
 
ml A ml B pH 
92,0 8,0 5,8 
90,0 10,0 5,9 
87,7 12,3 6,0 
85,0 15,0 6,1 
81,5 19,5 6,2 
77,5 22,5 6,3 
73,5 26,5 6,4 
68,5 31,5 6,5 
62,5 37,5 6,6 
56,5 43,5 6,7 
51,0 49,0 6,8 
45,0 55,0 6,9 
39,0 61,0 7,0 
33,0 67,0 7,1 
28,0 72,0 7,2 
23,0 77,0 7,3 
19,0 81,0 7,4 
16,0 84,0 7,5 
13,0 87,0 7,6 
10,5 89,5 7,7 
8,5 91,5 7,8 
 
 
TAMPÃO 2 
3. TAMPÃO VERONAL HCl 
 
Solução A: ácido dietil barbitúrico (sal disódico) 0,2M 
(PM= 206). 
Para obter-se a solução A, pesar 2,06 g do ácido e 
dissolver em 30 ml de água destilada. Completar para 50 ml 
com água destilada. 
Observação: deve-se usar sempre o ácido dietil barbitúrico 
e não o barbiturato de sódio, pois este não dissolve em 
água. 
 
Solução B: 0,2N de HCl (1,65 ml de HCl em 100 ml de água). 
 
Para pH 8,8 misturar: 
50 ml de A 
4 ml de B 
146 ml de água destilada 
A molaridade final do tampão é 0,05M. 
 
 
4. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,02M, pH 4,7 (para digestão 
com papaína) 
 
Solução A: solução 0,02M de NaH2PO4.H2O (PM= 138,01) pH 
4,0: 
0,276g/100 ml de água destilada 
 
Solução B: solução 0,02M de Na2HPO4.7H2O (PM= 267,98) pH 
8,0: 
0,536g/100 ml de água destilada 
ou 
solução 0,02M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) pH 8,0: 
0,356g/100 ml 
 
Titular uma solução com a outra até que o pH seja 4,7. 
 
 
5. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,05M pH 8,9 (para digestão com 
tripsina) 
 
Solução A: fosfato de sódio monobásico 1M 
Solução B: fosfato de sódio bibásico 1M 
Misturar 0,25 ml da solução A com 9,75 ml da solução B e 
completar para 200 ml com água destilada. 
 
 
TAMPÃO 3 
6. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 
 
Solução A: solução 1M de KH2PO4 (PM = 136,09): 
13,6 g/100 ml de água destilada 
34,0 g/250 ml de água destilada 
 
Solução B: 
solução 1M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) 
17,8 g/100 ml de água destilada 
44,5 g/250 ml de água destilada 
ou 
solução 1M de Na24PO4.7H2O (PM = 267,98) 
26,8 g/100 ml de água destilada 
67,0 g/250 ml de água destilada 
ou 
solução 1M de Na2HPO4.12H2O (PM = 357,98) 
35,8 g/100 ml de água destilada 
89,5 g/250 ml de água destilada 
 
 
6.1. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,1M; pH = 7,0 a 7,2 
 
Solução A Solução B Completar com H2O para 
 
28,5 ml 71,5 ml 1000 ml 
14,25 ml 35,75 ml 500 ml 
2,85 ml 7,15 ml 100 ml 
 
 
6.2. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,15M; pH = 7,0 a 7,2 
 
Solução A Solução B Completar com H2O para 
 
28,5 ml 71,5 ml 660 ml 
14,25 ml 35.75 ml 330 ml 
04,75 ml 11,91 ml 110 ml 
 
 
TAMPÃO 4 
6.3. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,2M; pH = 7,0 a 7,2 
 
Solução A Solução B Completar com H2O para 
 
57,0 ml 143,0 ml 1000 ml 
28,5 ml 71,5 ml 500 ml 
14,25 ml 35,75 ml 250 ml 
5,7 ml 14,3 ml 100 ml 
 
 
7. TAMPÃO TRIS-HCl pH 7,4 (para digestão com colagenase) 
 
Solução A: TRIS 0,2M 
2,42 g/100 ml de água destilada 
 
Solução B: HCl 0,1N: 
0,8 ml/100 ml de água destilada 
 
Para pH 7,4 misturar: 
25 ml da solução A 
42 ml da solução B 
33 ml de água destilada 
 
TRIS = hidroxi methyl-aminomethan (PM = 121,14) 
 
 
8. TAMPÃO ACETATO 0,2M, pH 5,8 (para Alcian Blue + 
concentração eletrolítica crítica) 
 
Solução A: ácido acético 0,2M: 
1,2 ml/100 ml de água destilada 
 
Solução B: acetato de sódio 0,2M 
1,64 g de acetato de sódio anidro (PM = 82)/100 ml de água 
ou 
2,72 g de acetato de sódio trihidratado (PM = 136)/100 ml 
de água destilada. 
 
Medir o pH da solução B e ir pingar nesta a solução A, até 
atingir o pH desejado. 
 
 
TAMPÃO 5 
9. TAMPÃO SORENSEN pH 6,4 
 
Solução A: solução 0,06M de KH2PO4 
0,816 g/100 ml de água 
 
Solução B: solução 0,06M de Na2HPO4.12H2O 
1,074 g/50 ml de água. 
 
Para 100 ml de tampão, misturar 70 ml da solução A e 30 ml 
da solução B. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 III. MICROSCOPIA DE LUZ
FIXAÇÃO 1 
1. TÉCNICAS DE FIXAÇÃO 
 
O volume do fixador deve ser sempre 20 vezes maior do que 
aquele da peça a ser fixada. 
A peça deve ter, pelo menos um dos lados, medindo 3 mm de 
espessura para que o fixador possa penetrar. 
 
 
1.1. ACETONA-METANOL 
 
Partes iguais de acetona e metanol. 
 
 
1.2. BOUIN 
 
Solução saturada aquosa de ácido pícrico......750 ml 
Formol 36-40%.................................250 ml 
Ácido Acético Glacial..........................50 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar pedaços de até 0,5 cm de espessura em Bouin durante 
24 horas (5 horas no mínimo). 
Lavar de um dia para o outro, em água corrente, dentro do 
próprio frasco onde foi fixado. Para isto, cobrir o 
frasco com uma gaze (amarrada ou presa com um elástico na 
borda do frasco) e colocá-lo sob a água corrente. Cuidado 
com a intensidade do jato de água para não danificar o 
material. 
Após a lavagem, passar para álcool 70, onde pode ser 
deixado por muito tempo, se a peça não for ser emblocada. 
 
Observações: 
a) Ácido Pícrico Saturado: solução aquosa de ácido pícrico 
com concentração de 1,4%. 
b) Formol 36-40% é o formaldeído líquido (como vem). 
c) Extração do Ácido Pícrico de peças fixadas em Bouin: se 
a peça fixada pelo Bouin ainda ficar muito amarela, após 
ser lavada em água corrente a noite inteira, deixá-la por 
3 horas na solução saturada de carbonato de lítio em 
álcool 50o. Em seguida, passar para álcool 70o, desidratar 
e emblocar. Da mesma forma, se o corte histológico ainda 
estiver amarelado depois da hidratação, deixá-la alguns 
minutos numa solução saturada de carbonato de lítio em 
álcool 50o. 
 
 
1.3. CARNOY II (Carnoy dos patologistas) 
 
Etanol absoluto..............60 ml 
Clorofórmio..................30 ml 
Ácido acético...............10 ml 
 
Técnica de fixação: 
FIXAÇÃO 2 
Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100 
de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão. 
 
 
1.4. ETANOL-ACÉTICO 
 
Álcool 95...............75 ml 
Ácido acético...........25 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100 
de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão. 
 
 
1.5. SOLUÇÃO SALINA DE FORMOL 10% 
 
Formol 36-40%.....................100 ml 
NaCl................................9 g 
Água destilada....................900 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar por 24 horas. 
 
 
1.6. SOLUÇÃO NEUTRA FOSFATO TAMPONADA DE FORMOL 
 
Formaldeído 37-40%.........................100 ml 
Água destilada.............................900 ml 
Fosfato de Na monobásico (NaH2PO4.H2O).......4,0 g 
Fosfato de Na dibásico anidro (Na2HPO4)......6,5 g 
 
Técnica de Fixação: 
Fixar durante 6 a 24 horas, dependendo do tamanho da peça. 
 
 
1.7. PARAFORMALDEÍDO A 4% EM PBS (pH 7.0) 
 
Tampão fosfato 0,1M...............100 ml 
NaCl.................................9 g 
paraformaldeído.....................40 g 
 
Colocar 800 ml de água destilada para aquecer (não deixar 
ferver). Colocar o NaCl e o tampão. Por último, dissolver 
o paraformaldeído. Completar para 1000 ml com água 
destilada. 
 
Técnica de fixação: 
Fixar o material de 6 a 24 hs. 
 
 
1.8. METHACARN 
 
Álcool metílico............60 ml 
Clorofórmio................30 ml 
FIXAÇÃO 3 
Acético acético............10 ml 
 
Técnica de fixação: Fixar por 24 horas. 
 
 
1.9. GENDRE 
 
Soluçãosaturada de ácido pícrico em álcool 90.......85 ml 
Formol 40%...........................................10 ml 
Ácido acético.........................................5 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar por 4 horas. 
 
O líquido de Gendre é um fixador para glicogênio 
 
 
1.10. SOLUÇÃO DE FORMOL COM CÁLCIO 
 
Formol 40%.........................10 ml 
Água destilada.....................90 ml 
Cloreto de cálcio anidro............1 g 
 
Este é um fixador ideal para estudar lípides. 
 
 
1.11. CLARKE-CARNOY (Carnoy dos citologistas) 
 
Álcool 100....................... 75 ml 
Ácido acético.....................25 ml 
 
Fixador ideal para demonstração de proteínas. 
 
 
1.12. HIDRATO DE CLORAL 
 
25 g de hidrato de cloral 
100 ml de álcool 50 
 
Fixar por 24 a 48 horas. 
 
Fixador ideal para método de Nonidez para demonstração de 
terminações nervosas. 
 
 
1.13. FORMOL BROMETADO 
 
140 ml de formol 40% 
20 g de brometo de amônia 
1000 ml de água destilada 
 
Fixador ideal para tecido nervoso que será submetido a 
algum método de impregnação pela prata. 
 
FIXAÇÃO 4 
 
 
 
DESCALC 1 
2. TÉCNICAS DE DESCALCIFICAÇÃO 
 
 
2.1. DESCALCIFICAÇÃO PELO EDTA 
 
Deixar o fragmento em solução de EDTA a 5% em solução 
salina (5 g de EDTA em 100 ml de solução salina) até que a 
descalcificação esteja completa. Testar para verificar a 
descalcificação. 
Lavar abundantemente em água corrente antes de iniciar-se 
a desidratação. 
 
EDTA = Ac. Etilediamino Tetracético Sal Bisódico; PM = 
372,24 
 
 
2.2. DESCALCIFICAÇÃO PELO ACÍDO FÓRMICO 
 
Solução A: solução de citrato de sódio a 20% 
Citrato de Sódio 20% ......50 g 
Água destilada.............250 ml 
 
Solução B: solução de ácido fórmico 1:1 
Ácido fórmico a 50%.........125 ml 
Água destilada..............125 ml 
 
Misturar partes iguais das soluções A e B. Colocar nesta 
mistura o fragmento ósseo já fixado. Renovar a solução a 
cada 48 horas e testar periodicamente para verificar-se a 
descalcificação. 
Após a descalcificação lave o tecido em água corrente 
durante 24 horas, pelo menos (para eliminar totalmente o 
ácido), antes de iniciar-se a desidratação. 
Usando-se este método, a descalcificação é lenta, porém 
preserva melhor as estruturas. 
 
 
2.3. TESTE PARA VERIFICAR A DESCALCIFICAÇÃO 
 
5 ml da solução descalcificante usada (que esteve em 
contato com a peça durante pelo menos seis horas) 
5 ml de solução de oxalato de amônia a 5% 
5 ml de hidróxido de amônia 
 
DESCALC 2 
Agitar. Esperar 30 minutos. Se ficar turvo é porque a 
descalcificação da peça não está completa ainda. 
Caso esteja pronta, lavar a peça abundantemente antes de 
iniciar-se da desidratação. 
 
 
2.4. DESCALCIFICAÇÃO PELO ÁCIDO NÍTRICO 
 
Colocar a peça em solução aquosa de ácido nítrico a 4%. 
 
É um método muito drástico. Deve-se verificar o 
amolecimento da peça várias vezes. 
 
 
INCLUSÃO 1 
3. INCLUSÃO EM PARAFINA 
 
 
3.1. TÉCNICA DE INCLUSÃO EM PARAFINA 
 
Depois de completa a fixação, o material deve ser lavado, 
se for o caso, e deixado em álcool 70° durante duas horas, 
no mínimo. 
Fazer 3 passagens de duas horas cada uma em álcool 96°. 
Fazer 3 passagens de 2 horas cada uma em álcool 100° (na 
última pode deixar de um dia para outro). 
Fazer 3 passagens de 30 minutos cada uma em xilol. 
Dar um primeiro banho de parafina na estufa 60°C durante 
uma hora. 
Dar um segundo banho de parafina na estufa (à vácuo, de 
preferência) durante uma hora. 
Incluir o material. 
 
Observações: 
a) A parafina usada nos banhos deve ser filtrada antes de 
ser reutilizada. 
b) Para amolecer peças muito duras usar banhos de benzol 
em vez de xilol. 
c) Para diafanizar peças muito grandes ou muito pequenas 
calcular o tempo de diafanização da seguinte maneira: 
deixar no primeiro banho de xilol até a peça ficar 
diafanizada (como que transparente). Os outros dois banhos 
de xilol que se seguem devem ter a mesma duração deste 
primeiro. 
d) Para peças muito fibrosas: depois dos banhos de álcool 
100, dar 2 banhos com acetato amila ou éter. Em seguida, 
parafina + éter (1:1) a 38°C e depois parafina pura a 
60°C. 
 
 
3.2. PREPARAÇÃO DA PARAFINA 
 
3.2.1. PARAFINA PURA 
 
Derreter a parafina Petrobrás na estufa, colocar para 
ferver, levantar a fervura três vezes, recolocar na estufa 
e pronto. 
 
3.2.2. FÓRMULA DR. CARDOSO DE ALMEIDA 
 
Parafina Petrobrás 145o ....1000 ml ou 780 g 
Estearina.....................25 ml ou 21 g 
Cera de abelha...............130 ml ou 104 g 
Vaselina líquida...............2 ml 
 
 
3.2.3. FÓRMULA DO BENIGNO ARROYO (ICB-USP) 
 
parafina pura..............................800 g 
INCLUSÃO 2 
cera purificada............................150 g 
ácido esteárico (ou estearina)..............50 g 
MICROTOM 1 
4. MICROTOMIA EM PARAFINA 
 
4.1. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 
 
Deve-se limpar previamente as lâminas onde serão colocados 
os cortes: retirar as lâminas da embalagem e colocá-las em 
uma solução de Extran a 1% em um recipiente grande. Deixar 
de um dia para o outro. Enxaguar em água corrente 
abundantemente até que o detergente tenha sido totalmente 
retirado. Colocar em álcool 95°. As lâminas devem 
permanecer no álcool até o momento de serem utilizadas, 
quando então devem ser secas com uma fralda. 
Se as lâminas estiverem fungadas ou muito sujas, deixar de 
molho em soluçào sulfocrômica ou em álcool-ácido preparado 
da seguinte maneira: 
Álcool 95 ou 100%...........1000 ml 
Água destilada................63 ml 
HCl..........................120 ml 
 
 
4.2. OBTENÇÃO DOS CORTES 
 
Aparar lateralmente o bloco (deve-se aparar o máximo 
possível, pois se ficar excesso de parafina dos lados da 
peça emblocada os cortes sairão enrugados). 
Cortar rotineiramente com 4 a 7 µm. 
Com uma pinça colocar fragmentos da fita de cortes em 
Banho-Maria com água destilada a 45° a 50°C. Colocar a 
superfície brilhante da fita em contacto com a água e 
fazê-la caminhar sobre a superfície da água antes de 
soltá-la da pinça. 
Separar os cortes um a um usando delicadamente a pinça. 
Deixar os cortes no banho-maria até esticarem e pescá-los 
com as próprias lâminas que devem estar perfeitamente 
limpas e desengorduradas (ver "Preparação de lâminas"). 
Depois de pescar, colocar as lâminas com os cortes na 
estufa a 50 a 60° para secar, durante no mínimo duas 
horas, sendo que o melhor é deixá-las na estufa de um dia 
para o outro. Desta maneira, a parafina derrete bem e os 
cortes grudam satisfatoriamente na lâmina. 
 
 
PREP-LAM 1 
5. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS E COLAGEM DE CORTES 
 
 
5.1. COMO DESPARAFINAR E HIDRATAR OS CORTES 
 
Este procedimento deve ser seguido rotineiramente, a menos 
que para o tipo de coloração desejada exista determinação 
específica em contrário. 
 
Passar as lâminas por: 
Xilol 1..........10 min. 
Xilol 2..........10 min. 
álcool 100°.......5 min. 
álcool 95°........5 min. 
álcool 70°.......10' a 15 min. 
Lavar em água corrente 
Corar. 
 
Observações: 
a) Diversos fatores (tipo de parafina, a utilização de 
cortes obtidos há muito tempo, a dimensão do corte) 
influem no tempo durante o qual as lâminas devem 
permanecer no xilol para a retirada da parafina. 
Imediatamente após colocar a lâmina no álcool 100°, 
retirá-la e, olhando a lâmina contra a luz, certificar-se 
de que toda parafina foi retirada pelo xilol; se isto não 
tiver ocorrido, voltar a lâmina para o xilol. 
 
 
5.2. MONTAGEM DA LÂMINA APÓS COLORAÇÃO 
 
 
Passar as lâminas por: 
 
Álcool 70°.............5 min. 
Álcool 95°.............3 min. 
Álcool absoluto........3 min. 
Álcool absoluto........3 min. 
Álcool-xilol (1:1)....10 min. 
Xilol diafanizante.....5 min. 
Xilol montagem........30 min. ou mais 
Colocar a lamínula usando o meio de montagem apropriado. 
 
 
PREP-LAM 2 
5.3. MODELO DE ROTULAÇÃOApós o meio de montagem estar seco, deve-se limpar a 
lâmina para retirar o excesso deste que acumulou-se nas 
bordas da lamínula, limpando com um pano ou lenço de papel 
com xilol. Em seguida, as lâminas devem ser identificadas 
por etiquetas que contenham as seguintes informações: 
número do bloco (correspondente ao número registrado no 
livro de autópsias), identificação da espécie animal, 
identificação do órgão e da coloração. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 corte 
 
 espécie coloração 
 lamínula 
 número do órgão 
 registro 
 
 
 
5.4. ESMERILHAMENTO DE LÂMINAS (PREPARO DE LÂMINA FOSCA) 
 
Com este procedimento consegue-se que uma das extremidades 
da lâmina fique fosca, e assim pode-se escrever sobre ela 
com um lápis, facilitando sua identificação. 
 
 
5.4.1. RECEITA DO PROF. JUNQUEIRA 
 
Solução esmerilhadora: 
 
150 g de fluoreto de amônia anidro 
20 ml de ácido sulfúrico 
150 ml de ácido fluorídrico 
100 ml de água destilada 
 
Adicionar o ácido sulfúrico, em gotas, ao fluoreto de 
amônia agitando com cuidado. Depois adicionar o ácido 
fluorídrico da mesma maneira e a água por último. 
 
Técnica: Deixar as lâminas durante 1 minuto na solução 
esmerilhadora, retirar e lavar bem em água corrente. 
 
PREP-LAM 3 
Observações: 
a) É essencial adicionar os reagentes na ordem indicada. 
b) Não usar fluoreto de amônia hidratado. 
c) Tanto para a preparação como para estocar a solução 
usar recipiente de polietileno de parede espessa, pois a 
reação é exotérmica. 
d) A adição do ácido sulfúrico por gotejamento e sob 
constante agitação deve ser feita para evitar 
empedramento. 
e) Lembrar e avisar ao técnico que a solução ataca vidro 
em geral e não apenas as lâminas. 
f) À medida que a solução for envelhecendo, aumentar o 
tempo para o esmerilhamento, controlando o processo 
observando a lâmina contra luz. 
 
 
5.4.2. RECEITA DA CLEUSA (ICB-USP) 
 
150 g de fluoreto de amônia 
30 ml de ácido sulfúrico 
30 ml de ácido fluorídrico 
75 ml de água destilada 
10 ml de goma arábica 
 
Dissolver o fluoreto de amônia na água; adicionar o ácido 
sulfúrico gota a gota; juntar o ácido fluorídrico e a goma 
arábica também gota a gota. 
 
 
5.5. COLAGEM DE CORTES 
 
Os cortes podem ser pescados em lâminas limpas (sem 
nenhuma substância adesiva) quando pretende-se fazer 
colorações rotineiras e que não agridam muito o material. 
Caso contrário, deve-se promover a colagem do corte na 
lâmina, dissolvendo-se a substância colante no banho-maria 
ou pescando-se os cortes em lâminas previamente 
preparadas. 
 
 
5.5.1. GELATINA (para cortes que vão sofrer digestão 
enzimática) 
 
Gelatina em pó..................1 colher café 
Bicromato de potássio...........1 colher café 
Água destilada..................200 ml 
 
Ferver, filtrar, colocar no banho-maria e completar com 
água destilada. Trocar cada duas ou três semanas. 
 
 
5.5.2. GELATINA (usada rotineiramente) 
 
0,1 g gelatina 
PREP-LAM 4 
0,1 g dicromato de potássio 
1 litro água destilada fervente 
 
 
5.5.3. GELATINA (A Yara diz que esta não interfere na 
coloração e que as outras interferem) 
 
Dissolver na água do banho-maria um quadradinho de 4cm x 
4cm de gelatina em folha. 
 
 
5.5.4. ALBUMINA (Luna, 1968) 
 
Clara de ovo...............50 ml 
Glicerina..................50 ml 
 
Misturar bem. Filtrar em uma gaze. Colocar uma pequena 
gota em uma das extremidades da lâmina e espalhar de uma 
só vez com o dedo. 
Atenção: a albumina cora-se com muitos corantes, interfere 
no resultado final e a lâmina torna-se fungada com o 
tempo. 
 
 
5.5.5. SUPER-COLAGEM PARA DIGESTÃO ENZIMÁTICA 
 
Colar os cortes com albumina. 
Deixar secar e colocar as lâminas apoiadas (com os cortes 
virados para baixo) sobre frascos contendo formol dentro 
da estufa a 60°C durante 1 hora. 
Retirar os frascos de formol e deixar as lâminas secando 
na estufa a 37°C de um dia para outro antes de 
desparafinar. 
Desparafinar. 
Deixar de um dia para outro secando na estufa. 
 
 
5.5.6. SUPER-COLAGEM PARA RETICULINA. 
 
Colar os cortes com albumina. 
Colocar nos vapores de formol a 60°C durante uma hora (ver 
instruções na receita acima). 
Passar pela bateria de desparafinização e hidratação: 
xilol 1, xilol 2 e álcool 100°. 
Tirar do álcool 100° e colodionar os cortes, mergulhando-
os em solução de celoidina 0,5% (ou nitrato de celulose 
0,1%) em álcool-éter (1:1). 
Deixar secar coberto, à temperatura ambiente. 
Passar no álcool 70°, na água e proceder à coloração 
desejada. 
 
 
PREP-LAM 5 
5.5.7. GELATINA PARA LÂMINAS AO CRIOSTATO (usada para 
digestão enzimática e algumas reações imuno-histoquímicas) 
 
Solução A: Dissolver 1 g de gelatina incolor em 80 ml de 
água quente. 
 
Solução B: Dissolver 0,1 g de cromo alumen [CrK(SO4)2.12H2O; 
PM = 499,40] em 20 ml de água. 
 
Misturar as duas soluções, imergir as lâminas e deixá-las 
enxugar verticalmente. Guardá-las no congelador da 
geladeira em caixas fechadas. 
 
 
5.5.8. SILANE (3-aminopropyltriethoxysilane nº A-3648 
Sigma) 
 
Usar lâminas perfeitamente limpas e desengorduradas. 
 
Fazer uma solução de silane 2% em acetona pura. 
Mergulhar a lâmina 2 vezes nesta solução. 
Mergulhar a lâmina 2 vezes na acetona pura. 
Mergulhar a lâmina 2 vezes em água. 
Secar em temperatura ambiente. 
 
 
5.5.9. SILANE (receita que o Gregorio deu) 
 
Preparar uma solução de 0,5% de silane em acetona pura. 
Mergulhar as lâminas nesta solução por 10 a 15 segundos. 
Deixar secar de um dia para o outro. 
Lavar em três ou mais banhos de água destilada. 
Secar na estufa a 60ºC. 
 
 
5.5.10. COLA TENAZ 
 
Dissolver um pouco (1 a 2 ml) de cola tenaz de rótulo azul 
em um recipiente com 50 ml de água. Mergulhar as lâminas. 
Colocá-las para secar na estufa (cerca de 15 minutos). 
Após a secagem as lâminas devem ficar praticamente 
transparentes, senão é porque tem cola em excesso. Pode-se 
colocar a cola direto no banho-maria onde os cortes são 
pescados. 
 
 
PREP-LAM 6 
5.5.11. COLÓDIO 
 
Esta técnica permite a adesão de cortes que foram pescados 
em lâminas sem nenhuma substância adesiva, possibilitando 
assim submeter lâminas já prontas a processos como 
hidrólise, acetilação, saponificação, metilação etc., que 
são muito agressivos e descolam os cortes. 
As lâminas devem ser colodionadas no momento adequado para 
cada tratamento, segundo as indicações específicas. 
 
Preparo do colódio a 1% ou 0,5% 
Álcool absoluto.....................50 ml 
Éter etílico........................50 ml 
Celoidina em pó..............1 g.ou 0,5 g 
 
No decorrer dos diversos procedimentos, o colódio deve ser 
removido das lâminas, passando-as por álcool absoluto e, 
em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partes 
iguais. 
 
 
5.5.12. ADESÃO POR CALOR 
 
De modo geral, para todas as colorações sejam elas 
agressivas ou não (exceto para digestão enzimática, que 
neccesita de uma substância adesiva), os cortes resistem 
muito bem se, após a desparafinização e passagem por 
álcool 100°, as lâminas forem colocadas para secar na 
estufa a 55°,por uma ou duas horas. A seguir, voltar as 
lâminas no álcool 100° e proceder a bateria de hidratação 
normal. 
 
DIG-ENZ 1 
6. TÉCNICAS DE DIGESTÃO ENZIMÁTICA 
 
 
6.1. DIGESTÃO COM COLAGENASE 
 
Fazer uma solução de colagenase 0,1 a 0,4% (1 a 4 mg/ml) 
em Tampão Tris-HCl 0,05M (pH 7,4) contendo 0,0025M (2,5 
mM) de NEM e 0,001M (1 mM) de CaCl2. 
 
Para 10 ml de solução: 
 
10 a 40 mg de colagenase 
3,1 mg de NEM 
1,1 mg de CaCl2 
Dissolver estes ingredientes em 5 ml de tampão e completar 
com o mesmo tampão para 10 ml. 
 
Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C durante 
24 horas ou mais (testar o tempo de incubação para cada 
material). 
 
Observações: 
TRIS = hydroxymethil-aminomethan PM 121,14. 
NEM = N-ethyl-maleidemide PM 125,13. O NEM atua como 
inibidor de outras proteases. Pode-se fazer a digestão sem 
o NEM, caso este não esteja disponível. 
CaCl2 PM= 110,99. 
 
 
6.2. DIGESTÃO COM ELASTASE 
 
Fazer uma solução de 0,5 mg de elastase por ml de tampão 
Veronal-HCl, pH 8,8. 
 
Pingar a solução sobre os cortes e deixar durante 30 a 60 
minutos, à temperatura ambiente. 
Lavar em água corrente. 
Proceder à coloração desejada. 
 
 
6.3.DIGESTÃO COM PEPSINA 
 
Fazer uma solução de 2 mg de pepsina cristalizada por ml 
de HCl 0,02N (pH 1,6). 
Pingar sobre os cortes e proceder à digestão a 37°C, 
durante 15 a 60 minutos. 
 
 
DIG-ENZ 2 
6.4. DIGESTÃO COM RNASE 
 
Fazer uma solução de 1 mg de RNAse por ml de água. Usar 
água deionizada com pH acertado a 6,8. Acertar o pH da 
água com solução de fosfato de sódio bibásico ou 
monobásico (dependendo do pH que está a água). 
 
Colocar 0,5 ml de solução de RNAse sobre o corte. Incubar 
os cortes na RNAse a 37°C durante 3 horas. Lavar e corar 
com Azul de Toluidina ou Galocianina. 
 
 
6.5. DIGESTÃO COM TRIPSINA 
 
Tampão Fosfato 0,05M (pH 8,9)......1 ml 
Tripsina cristalizada............0,1 mg 
 
Dissolver a tripsina no tampão, pingar sobre os cortes e 
incubar a 37°C por duas horas. 
 
 
6.6. DIGESTÃO COM PAPAÍNA 
 
Fazer uma solução de papaína 0,1% (1 mg/ml) em tampão 
fosfato 0,02M, pH=4,7, contendo 0,005M (5mM) de 
metabissulfito de sódio (PM=190,10) e 0,0005M (0,5mM) de 
EDTA (PM=372,24). 
 
Para 10 ml de solução: 
10 mg de papaína 
9,505 mg de bissulfito de sódio 
1,86 mg de EDTA 
Dissolver estes ingredientes em uma quantidade de tampão 
suficiente para completar 10 ml. 
 
Desparafinar os cortes e levá-los até água. Pingar a 
solução sobre os cortes e deixar à temperatura ambiente 
por 2 horas. Lavar durante alguns minutos na água 
corrente. Realizar a coloração desejada. 
Sobre os cortes-controle pingar só a solução de tampão + 
bissulfito + EDTA. 
 
Observação: 
a) Ver Guia de Tabalhos Práticos, no ítem Interação 
Colágeno-Proteoglicanos. 
DIG-ENZ 3 
6.7. DIGESTÃO COM AMILASE (LISON, 1960) 
 
Fazer uma solução de amilase 0,1 a 0,5% em salina (1 a 5 
mg/ml). 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C por duas 
horas. Os cortes controles devem ser submetidos à solução 
salina sem a enzima. 
Lavar em água destilada. 
Corar pelo Método do PAS. 
 
Resultado: 
Locais PAS positivos na lâmina controle que diminuirem ou 
perderem a positividade na lâmina digerida indicam 
presença de glicogênio. 
 
 
6.8. DIGESTÃO COM AMILASE 
 
Amilase a 2% em solução aquosa de NaCl a 4%. Pingar a 
solução sobre os cortes e deixar a 37°C durante 30 
minutos. 
 
 
6.9. DIGESTÃO COM HIALURONIDASE TESTICULAR 
 
Fazer um solução de hialuronidase testicular 0,1% (1 
mg/ml) em tampão Sorensen pH 6,4. 
 
Desparafinar e hidratar 2 cortes (A e B). 
Submeter o corte A à digestão enzimática, enquanto que o 
corte B recebe apenas o tampão. 
Corar os dois cortes pelo Alcian Blue pH 2,5 ou Azul de 
Toluidina. 
 
Resultado: Diminuição ou perda da positividade ao Alcian 
Blue no corte A indica a presença de ácido hialurônico 
e/ou condroitim-4 ou -6 sulfatado. 
 
 
DIG-ENZ 4 
6.10. DIGESTÃO COM NEURAMINIDASE 
 
Fazer uma solução de neuraminidase 500 U/ml em água 
destilada. Diluir esta solução em igual volume de tampão 
acetato 0,1M pH 5,5 contendo 1% de NaCl e 0,1% de CaCl2. 
 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Incubar os cortes com a solução enzimática, a 37° C, por 
16 a 24 horas. Os cortes controles devem ser incubados no 
mesmo tampão acetato a 0,05M. 
Lavar com água destilada. 
Corar com Alcian Blue - PAS. 
Montar. 
 
Resultado: 
Locais menos corados pelo Alcian Blue no corte digerido 
indicam a presença de ácido siálico (sialomucinas). 
 
COLOR 1 
7. COLORAÇÕES (TÉCNICAS DE USO CORRENTE) 
 
 
7.1. EOSINA (usar com hematoxilina de Harris) 
 
0,25 g de eosina amarela em pó (solúvel em água) 
100 ml de água destilada 
 
 
7.2. EOSINA (para usar com Hematoxilina de Ehrlich) 
 
2 g de eosina 
1 g de bicromato de potássio 
20 ml de solução aquosa saturada de ác. pícrico 
20 ml de álcool absoluto 
160 ml de água destilada 
 
 
7.3. HEMATOXILINA DE HARRIS 
 
1 g de hematoxilina cristalizada 
10 ml de álcool absoluto 
20 g de alúmen de potássio ou de amônio 
200 ml de água destilada 
0,5 g de óxido de mercúrio (vermelho) 
8 ml de ácido acético glacial (optativo) 
 
Preparo do corante: 
Dissolver a hematoxilina no álcool ligeiramente aquecido, 
dissolver o alúmen em água aquecida. Misturar as soluções 
e aquecer até ferver. Tirar do fogo e adicionar 
imediatamente e aos poucos o óxido de mercúrio (agitando 
para não explodir). 
Resfriar a solução o mais rapidamente possível, 
mergulhando o frasco num vasilhame (ou na pia) contendo 
água fria. 
Acrescentar o ácido acético e filtrar. Estocar em vidro 
escuro. Dura cerca de 3 meses. 
Deve-se filtrar a solução toda vez que for usar. 
 
 
COLOR 2 
7.4. HEMATOXILINA DE EHRLICH 
 
2 g de hematoxilina 
100 ml de álcool absoluto 
100 ml de glicerina 
100 ml de água destilada 
10 ml de ácido acético glacial 
15 g de alúmen de potássio 
 
A hematoxilina deve ser dissolvida no álcool; o alúmen 
deve ser dissolvido na água. Misturar as duas soluções e 
adicionar os outros reativos. 
Deixar amadurecer no sol por 1 mês. 
Dura muitos anos. 
 
Observações: 
a) O amadurecimento pode ser apressado adicionando-se 
iodato de sódio, na proporção de 50 mg de iodato de sódio 
para cada grama de hematoxilina; porém o corante não dura 
muito tempo. 
b) Útil para corar tecidos que estiveram expostos a 
soluções ácidas; assim é recomendada para corar tecidos 
que sofreram descalcificação ou que ficaram muito tempo no 
fixador. 
c) Usar associada à eosina preparada com bicromato de 
potássio e ácido pícrico. 
 
 
7.5. HEMATOXILINA DE MAYER 
 
0,2 g de hematoxilina 
200 ml de água destilada 
0,4 g de iodato de sódio 
10 g de alúmen de potássio 
10 g de hidrato cloral 
0,2 g de ácido cítrico 
 
Dissolver a hematoxilina, o alúmen e o iodato na água 
destilada. Isto pode ser feito a quente ou deixando de um 
dia para o outro à temperatura ambiente. Após a total 
dissolução, adicionar o hidrato cloral e o ácido cítrico. 
Ferver por 5 minutos, esfriar e filtrar. Pode ser usada 
imediatamente. 
 
COLOR 3 
Observação: 
a) Esta hematoxilina, por não precisar de diferenciação 
com álccol-ácido, é especialmente útil como corante 
nuclear nos casos em que é necessário realçar, por 
contraste, algum componente citoplasmático que tenha sido 
demonstrado por um corante que sofre descoloração com a 
diferenciação em álcool ácido (comum para outras 
hematoxilinas). 
 
 
7.6. HEMATOXILINA-EOSINA 
 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar com hematoxilina, pelo tempo desejado, conforme o 
tipo e idade da hematoxilina; de modo geral: corar durante 
15 a 20 minutos com hematoxilina de Mayer; corar de 2 a 10 
minutos com a hematoxilina de Harris e corar de 2 a 10 
minutos com a hematoxilina de Ehrlich. 
Lavar em água corrente por 10 minutos. 
Caso necessário, proceder à diferenciação em álcool-ácido: 
solução alcoólica de HCl a 1% (1 ml de HCl em 99 ml de 
álcool 70°). Controlar a diferenciação ao microscópio até 
chegar à intensidade desejada. 
Lavar rapidamente em água corrente, após a diferenciação. 
Corar pela eosina por 2 minutos. 
Lavar em água corrente (até que a água esteja limpa). 
Passar pela bateria de desidratação: passar rapidamente 
pelo álcool 70°, passar pelo álcool 95°, álcool 100°, 
xilol e montar. 
 
Observações: 
a) A hematoxilina cora os núcleos primariamente em 
vermelho e a posterior lavagem em água corrente converte a 
coloração para o azul (processo de azulecimento da 
hematoxilina). 
b) O procedimento de diferenciação da hematoxilinaem 
álcool-ácido raramente é necessário e deve ser feito nos 
casos em que ocorre uma supercoloração. 
c) A eosina sofre diferenciação com o álcool 70°; por isso 
esta passagem deve ser rápida. Se, por acaso, o corte 
ficar muito descorado ao ser passado pelo álcool 70° , 
passá-lo novamente pela água e recolocá-lo na eosina. Às 
vezes, é preferível pular a passagem pelo álcool 70°, 
colocando diretamente em álcool 95°. 
 
 
COLOR 4 
7.7. SHORR - HEMATOXILINA (para esfregaços vaginais) 
 
Pode-se usar o corante comercial ou prepará-lo: 
0,5 g de Biebrich scarlat red 
0,25 g de Orange G 
0,075 g de fast green FCF 
0,5 g de ácido fosfotúngstico 
0,5 g de ácido fosfomolíbdico 
1 ml de ácido acético glacial 
100 ml de álcool 50° 
 
Procedimento: 
Fazer o esfregaço numa lâmina e colocá-la imediatamente no 
álcool 95° para fixação. Deixar no álcool por 15 minutos 
(pode ficar até 72 horas). 
Lavar rapidamente em álcool 70°. 
Lavar rapidamente em água corrente. 
Corar pela hematoxilina por 30 segundos. 
Lavar em água corrente por 5 minutos. 
Lavar em álcool 90°. 
Corar no corante de Shorr por 5 minutos. 
Lavar em álcool 95°. 
Desidratar e montar. 
 
Resultado: 
Reconhecimento das fases do ciclo estral de ratas: 
No diestro tardio o esfregaço aparece tipicamente 
atrófico, consistindo de poucas células epiteliais 
pequenas, arredondadas e nucleadas, enorme quantidade de 
polimorfonucleares e muco. 
No começo do proestro decresce em muito a quantidade de 
polimorfonucleares e o esfregaço compõe-se principalmente 
de células epiteliais arredondas ou ovaladas e nucleadas. 
No fim do proestro predominam as células poligonais 
grandes, achatadas e com núcleo picnótico, sendo que já 
existem células anucleadas. 
Com a chegada do estro, o esfregaço apresenta-se 
basicamente constituído por células cornificadas (células 
poligonais, grandes, achatadas, anucleadas e acidófilas). 
No começo do metaestro o esfregaço constitui-se de células 
cornificadas, polimorfonucleares e muco. No metaestro 
tardio a imagem é de muitas células epiteliais ovaladas ou 
arredondadas e nucleadas, associadas a polimorfonucleares 
e muco. 
A fase seguinte é o diestro, onde nota-se que o esfregaço 
torna-se cada vez mais atrófico: as poucas células 
epiteliais que aparecem são pequenas, arredondadas, 
COLOR 5 
nucleadas e sempre acompanhadas de grande quantidade de 
polimorfonucleares e muco. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IV. MÉTODOS HISTOQUÍMICOS 
MINERAIS 1 
1. MINERAIS 
 
 
1.1. VON KOSSA (para cálcio) 
 
Solução corante: 
solução aquosa de AgNO3 (nitrato de prata) a 5% 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar na solução de nitrato de prata, sob luz do dia forte 
(porém não luz solar direta), durante 10 a 60 minutos. 
Lavar em água destilada por 1 a 2 minutos. 
Deixar em água destilada, sob luz difusa, por 10 a 60 
minutos 
(esta passagem pode ser omitida). 
Reduzir a prata, imergindo os cortes em solução de 
hidroquinona 0,5% ou solução diluída 1:3 de qualquer 
revelador fotográfico, durante 2 minutos, agitando sempre. 
Tratar com solução aquosa de hipossulfito de sódio a 5% 
durante 2 a 3 minutos, para remover o excesso de prata 
(controlar ao microscópio). 
Lavar em água destilada. 
Contracorar com safranina O a 0,2 a 0,5%, durante 20 a 30 
segundos. 
Montar. 
 
Resultado: regiões contendo carbonato ou fosfato de cálcio 
aparecem coradas em negro; o método demonstra a presença 
de cálcio de maneira indireta, uma vez que, de fato, é 
específico para os íons fosfato e carbonato. 
 
Observações: 
a) se os cortes estiverem descolando da lâminas, 
colodionar com celoidina a 1%, depois do álcool absoluto 
de montagem, mergulhar no álcool 70° e seguir a montagem. 
b) a reação consiste em uma dupla troca entre o nitrato de 
prata e o fosfato ou carbonato de cálcio, levando à 
formação de carbonato e fosfato de prata insolúveis. Estes 
compostos são fotossensíveis e escurecem, sobre a ação da 
luz, formando um precipitado amarelo ou marrom. A passagem 
pela hidroquinona serve para reforçar a cor destes 
precipitados, tornando-os negros. 
c) o material de eleição para esta coloração é joelho de 
rato de 5 dias de idade, pois ainda é pequeno e permite 
cortes sem descalcificação. 
MINERAIS 2 
d) se houver grande quantidade de cálcio depositado, é 
melhor corar pelo nitrato de prata, em bloco, antes de 
descalcificar, pois deve-se remover um pouco do cálcio 
para poder cortar. 
 
 
1.2. AZUL DA PRÚSSIA E TURNBULL (para Fe+3 ou Fe+2, 
respectivamente) 
 
Solução corante: 
Preparar na hora de usar: 
a) para testar a presença Fe+3: 
solução de ferrocianeto de potássio [K4Fe(CN)6.3H2O] a 1% 
em ácido clorídrico 0,5%. 
b) para testar a presença de Fe+2: 
solução de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] a 1% em 
ácido clorídrico 0,5%. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Deixar na solução corante por 60 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Contracorar os núcleos com corante nuclear vermelho. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: pigmentos de ferro coram-se em azul brilhante, 
núcleos em vermelho e citoplasma em rosa claro. 
 
Observação: 
a) a fixação do material deverá ser feita em formol 
isotônico (preparado com salina ou PBS) ao pH fisiológico, 
durante 24 horas. Fixadores ácidos solubilizam os íons 
ferro e são, portanto, contra-indicados. 
b) material de eleição: baço e rim de rato ou cobaia 
injetados, intraperitonialmente, com sangue, durante 6 
dias, na dose diária de 1 ml de sangue para cada 100 g de 
animal. 
 
 
MINERAIS 3 
1.3. DETECÇÃO DE TÁLIO 
 
Solução de gás sulfídrico: 
7,8 g de Na2S 
0,56 ml de H2SO4 
100 ml de água destilada 
 
Solução de sulfeto de amônia: 
Solução aquosa de sulfeto de amônia [(NH4)S] saturada com 
selênio preto (óxido de selênio) 
 
Soluções estoques para revelação: 
Preparar: 
solução aquosa de goma arábica a 10% (preparada 7 a 14 
dias antes e agitada diariamente com um bastão de vidro) 
solução aquosa de nitrato de prata a 10% (mantida 14 dias 
no escuro, antes de usar) 
solução de ácido cítrico a 5% 
solução de hidroquinona a 2% 
 
Solução reveladora de trabalho (líquido de Timm): 
100 ml da solução de goma arábica 
1 ml da solução de nitrato de prata 
2 ml da solução de ácido cítrico 
10 ml da solução de hidroquinona 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Tratar pela solução de gás sulfídrico por 15 minutos. 
Imergir na solução de sulfeto de amônia por 10 minutos. 
Lavar em água destilada. 
Passar em H2O2 a 20% até descolorir. 
Colocar no líquido de Timm (solução de trabalho), durante 
20 a 30 minutos, no escuro. Parar a revelação quando os 
cortes estiverem marrons e não pretos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: depósitos de tálio aparecem como grânulos 
negros. 
 
MINERAIS 4 
Observações: 
a) Deve-se fazer junto cortes controles, omitindo-se o gás 
sulfídrico, o óxido de selênio ou o procedimento de 
revelação. 
b) A prata e o mercúrio podem interferir na coloração, mas 
poderão ser identificados no controle sem o óxido de 
selênio. 
RADQUIM 1 
2. RADICAIS QUÍMICOS EM PROTEÍNAS 
 
 
2.1. REAÇÃO PARA CITRULINA (Rogers, 1970) 
 
Preparo da solução corante: 
1 g de p-dimetil-amino-benzaldeído (reagente de Ehrlich) 
4 ml de ácido clorídrico concentrado 
23,38 g de NaCl 
água destilada suficiente para completar 100 ml 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Colocá-los na solução corante e montar no próprio meio de 
reação. 
Observar seguidamente ao microscópio até o aparecimento de 
uma coloração amarelada (demora cerca de 15 a 20 minutos). 
Fotografar, pois a preparação não pode ser montada de 
maneira permanente. 
 
Resultado: 
Locais ricos em citrulina, principalmente folículos 
pilosos, coram-se em amarelho palha.2.2. REAÇÃO PARA CISTEÍNA (SH) 
 
Preparo da solução corante: 
30 ml de solução aquosa de cloreto férrico (FeCl3.6H2O) a 
1% 
4 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio 
[K3Fe(CN)6] a 1 % 
6 ml de água destilada 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Deixá-los imersos na solução corante recém preparada, por 
10 minutos, à temperatura ambiente. 
Lavar em solução de ácido ácético a 1%. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: Locais ricos em radicais SH coram-se em azul. 
 
 
2.3. REAÇÃO PARA CISTINA (SS) 
Barka e Anderson, 1963 
RADQUIM 2 
 
Preparo da solução corante: 
60 ml de solução aquosa de cloreto férrico [FeCl3.6H2O] a 
1% 
20 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio 
[K3Fe(CN)6] a 1 % 
 
Preparo da solução de iodoacetamida: 
2 g de acetamida 
0,5 d iodo ressublimado 
100 ml de água destilada 
Ajustar o pH para 8,5 com NaOH 1N 
 
Preparo do tioglicolato de sódio: 
5 ml de ácido tioglicólico 
50 ml de água destilada 
50 ml de NaOH 1N 
Ajustar o pH para 8,5 com cerca de 5 ml de NaOH 1N 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Submetê-los à ação da iodoacetamida por 24 a 48 horas a 
37°C. 
Lavar em água destilada. 
Deixar na solução de tioglicolato de sódio por 4 horas. 
Lavar em solução de ácido acético 1% por 2 minutos. 
Colocar na solução corante recém-preparada por 10 minutos, 
no escuro. 
Lavar demoradamente em água corrente (cerca de 15 
minutos). 
Montar. 
 
Resultado: locais em que houve a redução dos grupos SS 
aparecem corados em pink, vermelho, lilás e azulado. 
 
 
2.4. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS BÁSICAS EM GERAL 
 
Solução corante: 
naphtol yellow S...............1 g 
ácido acético..................1 ml 
água destilada...............100 ml 
 
RADQUIM 3 
Solução metiladora: 
HCl 1N...................0,8 ml 
álcool metílico...........100 ml 
 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até álcool absoluto e colodionar os 
cortes. 
Metilar o tecido, à 60°, por cerca de 3 horas. 
Lavar em álcool e levar até a água. 
Imergir os cortes na solução corante durante 20 minutos. 
Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1 
minuto cada banho. 
Desidratar diretamente em álcool butílico terciário, 
diafanizar e montar. 
 
Resultado: locais ricos em proteínas básicas aparecem 
corados de amarelo vivo. 
 
 
2.5. DETECÇÃO DE HISTIDINA 
 
Solução corante: 
naphtol yellow S...............1 g 
ácido acético..................1 ml 
água destilada...............100 ml 
 
Solução metiladora: 
HCl 1N....................0,8 ml 
álcool metílico...........100 ml 
 
Solução acetiladora: 
Anidro acético.............40 ml 
Piridina...................60 ml 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. 
Metilar o material por 3 horas. 
Lavar em álcool absoluto. 
Recolodionar. 
Deixar na solução acetiladora, por 24 horas. 
Lavar em piridina por 2 minutos. 
Lavar em álcool absoluto e levar até a água. 
Corar pela solução corante por 20 minutos. 
Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1 
minuto cada banho. 
Desidratar diretamente em álcool butílico terciário, 
diafanizar e montar. 
RADQUIM 4 
 
Resultado: locais ricos em histidina aparecem corados de 
amarelo vivo. 
 
 
2.6. DETECÇÃO DE ARGININA 
 
Solução corante: 
2 ml de solução aquosa de NaOH a 4% 
2 gotas de água sanitária, "cândida", solução de 
hipoclorito de sódio a 5% comercial 
4 gotas de solução de alfa naphtol a 1% em álcool 70° 
Misturar nesta ordem e imediatamente antes do uso. 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. 
Secar e mergulhá-los em álcool 70°. 
Levar até a água. 
Colocar os cortes na horizontal e cobrí-los com a solução 
corante. 
Preparar nova solução corante, desprezar a primeira e 
tornar a cobrir os cortes por 2 minutos. 
Montar no próprio meio de reação e observar imediatamente. 
 
Resultado: locais ricos em arginina coram-se em vermelho 
tijolo. 
 
Observação: 
a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles, 
bloqueando-se os radicais guanidil, através da acetilação, 
assim realizada: após a passagem pelo álcool 70°, lavar os 
cortes em piridina por 2 minutos e colocá-los na solução 
acetiladora por 24 horas; em seguida, lavar em álcool 
absoluto, recolodionar os cortes e realizar a reação para 
arginina. 
Solução acetiladora: 
Anidro acético.............16 ml 
Piridina...................24 ml 
 
 
RADQUIM 5 
2.7. DETECÇÃO DE TIROSINA 
Bensley & Gersh, 1933 
 
Preparo do reativo de Millon: 
Preparar uma solução aquosa de ácido nítrico a 40%, 
dissolvendo o ácido gota a gota na água (40 ml de ácido em 
60 ml de água). Deixar estabilizar por 48 horas. Diluir 40 
ml desta solução em 360 ml de água, conseguindo-se assim 
400 ml de uma solução de ácido nítrico a 4%. Deixe 
repousar por 24 horas. Saturar esta solução com excesso de 
cristais de nitrato de mercúrio. Filtrar e adicionar 1,4 g 
de nitrito de sódio e 4 ml da solução aquosa de ácido 
nítrico a 40% (aquela inicial). O reativo de Millon assim 
preparado pode ser guardado em geladeira por muito tempo. 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. 
Secar e mergulhá-los em álcool 70°, por 3 minutos. 
Mergulhar em acetona anidra e deixar secar ao ar. 
Cobrir com o reagente de Millon. 
Levar à chama do bico de Bunsen até o aparecimento da 
coloração tijolo. 
Lavar bem em solução de ácido nítrico a 2% a 37°C. 
 
Resultado: locais ricos em tirosina aparecem em vermelho 
tijolo. 
 
Observação: 
a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles, 
através do bloqueio dos radicais p-hidroxi-fenil, por 
processo de iodação, da seguinte maneira (Landing & Hall, 
1956): 
Após colodionar os cortes, colocá-los diretamente na 
solução de iodação por 24 horas; em seguida, lavar em água 
corrente, voltar ao álcool absoluto, recolodionar os 
cortes e realizar o método para tirosina, a partir da 
etapa da acetona. 
Solução de iodação: 
Iodo.........................3 g 
Iodeto de potássio...........6 g 
Água destilada............100 ml 
 
 
RADQUIM 6 
2.8. DETECÇÃO DE TRIPTOFANO 
 
Soluções corantes: 
Solução de p-dimetiaminobenzaldeído (DMAB) a 5% em HCl 
concentrado 
 
Solução de nitrito de sódio a 1% em HCl concentrado. Os 
cristais de NaNO2 são postos no HCl imediatamente antes de 
se usar a solução. Mergulhar as lâminas enquanto está 
havendo formação de gás. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e levar as lâminas até álcool absoluto. 
Recobrir o corte com celoidina, imergindo-o em solução 
0,25% de celoidina em álcool absoluto e éter em partes 
iguais durante 1 minuto. 
Retirar o corte da celoidina e colocar diretamente na 
solução de DMAB por 1 minuto. 
Colocar diretamente na solução de NaNO2 por 1 minuto. 
Lavar em água corrente por 30 segundos. 
Passar em solução de álcool ácido (HCl concentrado a 1% em 
álcool 70°). 
Montar. 
 
Resultados: 
Locais contendo triptofano aparecem corados em azul. 
Grânulos de zimogênio das células principais do estômago: 
moderadamente corados. 
granulações eosinofílicas: fortemente coradas. 
queratina: não se cora. 
grânulos de zimogênio do pâncreas: muito corados. 
células alfa da ilhota pancreática: azul claro. 
células beta da ilhota pancreática: não se coram. 
célula de Paneth: fortemente corada. 
células absortivas do intestino: azul acinzentado claro. 
fibras elásticas das artérias: não se coram. 
 
Observações: 
a) o ácido clorídrico puro é extremamente corrosivo e 
fumegante; trabalhe com luvas e na capela. 
b) para demonstrar células de Paneth no intestino use 
animais que foram mantidos em jejum por um noite. 
RADQUIM 7 
c) pode-se bloquear a reação, utilizando-se o ácido 
perfórmico, da seguinte maneira: 
Após colodionar, mergulhar os cortes em solução de formol 
a 10% em álcool 70° e em seguida, colocá-losna solução de 
ácido perfórmico por 2 minutos; lavar em álcool absoluto, 
recolodionar os cortes e aplicar a técnica para 
triptofano. 
Preparo da solução de ácido fórmico: 
Ácido fórmico a 98%......................40 ml 
Ácido sulfúrico a 65%...................0,5 ml 
Água oxigenada 100 vol....................4 ml 
Preparar 3 horas antes de usar e agitar por diversas vezes 
para remover o gás formado. 
 
 
2.9. DETECÇÃO DE GRUPOS NH2 
(Yasuma & Ichikawa, 1953) 
 
Solução corante: 
solução aloxana a 1% em álcool absoluto 
 
Reativo de Schiff: ver método de PAS, em Histoquímica de 
polissacarídeos 
 
Solução de água sulfurosa: 
10 ml de metabissulfito de sódio 
10 ml de HCl 1N 
180 ml de água destilada 
 
Procedimento: 
Desparafinar os cortes e levá-los até o álcool absoluto. 
Mergulhar as lâminas em solução de aloxana por 24 horas. 
Lavar em álcool absoluto e levar até a água. 
Colocar no reativo de Schiff por 30 minutos. 
Passar por três banhos de água sulfurosa de 2 minutos 
cada. 
Lavar em água corrente por 15 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: locais ricos em radicais livres NH2 coram-se em 
vermelho. 
RADQUIM 8 
Observação: 
a) pode-se bloquear a reação, através do método de Barka & 
Anderson (1963), utilizando-se o seguinte procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes, colocá-los na solução 
bloqueadora por 24 horas; lavar em água e realizar o 
método da aloxana. 
Preparo da solução bloqueadora: misturar, na hora de usar, 
partes iguais de solução aquosa de ácido acético a 12,5% e 
solução de nitrito de sódio a 15% (ambas geladas). 
 
 
 
LIPID 1 
3. LÍPIDEOS 
 
 
3.1. SUDAN BLACK B 
 
Preparo da solução corante: 
Preparar uma solução saturada de Sudan black em álcool 70° 
e filtrar. 
 
Procedimento: 
Usar cortes de material fresco ou fixado em formol. 
Cortar em congelação. 
Imergir os cortes por 10 minutos na solução corante 
filtrada. 
Lavar em álcool 70° para retirar o excesso de corante ou 
até que os cortes controles estejam descorados. 
Lavar em água corrente. 
Pode-se contracorar fracamente com hematoxilina. 
Montar em glicerina. 
 
Resultado: lipideos coram-se em negro. 
 
Observações: 
a) a adição de cálcio ao formol fixador contribui para a 
retenção dos lípides ao tecido. 
b) Sabe-se que os cristais de colesterol não se coram 
normalmente com o Sudan black; além disso, os 
fosfolipídeos se dissolvem no álcool (que é o solvente do 
corante). Estes dois problemas podem ser contornados 
usando-se uma solução de brometo da seguinte forma: 
Obtidos os cortes, deixá-los em uma solução aquosa de 
brometo a 2,5%, por 1 hora e, em seguida, lavar em uma 
solução aquosa de 0,5% de metabissulfito de sódio para 
retirar o excesso de brometo; lavar em água corrente e 
imergir na solução corante. 
 
 
 
 
POLISS 1 
4. POLISSACARÍDEOS 
 
 
4.1. AZUL DE TOLUIDINA 
 
Solução corante: 
Azul de Toluidina 0,5% em água destilada 
 
Procedimento: 
Corar as lâminas durante 1 a 2 horas. 
Lavar em água destilada. 
Montar. 
 
Resultado: 
Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA e 
polissacarídeos ácidos, com diferentes intensidades de 
cor, conforme a quantidade de grupamentos ácidos. 
 
 
4.2. ALCIAN BLUE, pH 2,5 
Mowry, R.W.; Ann. N.Y. Acad. Sci, 106 (2): 402-423, 1963. 
 
Solução corante: Alcian Blue 8GX 1% em solução aquosa de 
ácido acético a 3% 
 
Preparo da solução corante: 
97 ml de água destilada 
3 ml de ácido acético glacial 
1 g de Alcian Blue 8GX 
 
Medir o pH da solução e, se necessário, acertá-lo com HCl 
1N ou NaOH 1N. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Passá-los em solução aquosa de ácido acético 3% durante 3 
minutos. 
Corar pela solução corante, por 2 horas. 
Enxugar o excesso de corante. 
Lavar em ácido acético 3%, durante 3 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
POLISS 2 
Resultado: 
Coram-se, em azul turquesa, carboidratos complexos ricos 
em grupos carboxilas, ácido hialurônico, carboibratos 
fracamente sulfatados, carboidratos ricos em ácido 
siálico. Os carboidratos fortemente sulfatados coram-se 
fracamente ou não se coram. 
 
 
4.3. ALCIAN BLUE pH 0,5 e 1,0 
 
Solução corante: solução de Alcian Blue 1% em HCl 0,2 N. 
 
Preparo da solução: 
1 g de Alcian Blue 8GX 
100 ml de HCl 0,2N (para pH 0,5) ou 
100 ml de HCl 0,1N (para pH 1,0). 
 
Para 100 ml de HCl 0,2N: 1,65 ml de HCl em 98,3 ml de H2O. 
Para 100 ml de HCl 0,1N: 0,83 ml de HCl em 99,17 ml de 
H2O. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Passar no HCl 0,2N ou 0,1N, por 3 minutos. 
Corar na solução corante por 30 minutos. 
Passar em HCl 0,2N ou 0,1N. 
Lavar rapidamente em água destilada. 
Desidratar e montar. 
 
Resultado: 
Locais ricos em polissacarídeos sulfatados coram-se em 
azul, portanto não cora ácido hialurônico (não-sulfatado). 
 
 
4.4. METILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + ALCIAN BLUE, pH 2,5 
 
O processo de metilação em alta temperatura promove o 
bloqueio da basofilia dos polissacarídeos sulfatados e 
carboxilados; a saponificação posterior restaura a 
basofilia somente dos polissacarídeos carboxilados. 
 
Solução para metilação: 
99,2 ml de álcool metílico (metanol) 
0,8 ml de HCl 
 
POLISS 3 
Solução para saponificação: 
Solução de BaOH a 4% em álcool 80° 
ou 
1 g de hidróxido de potássio 
70 ml de álcool absoluto 
30 ml de água destilada 
 
Procedimento: 
Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcool 
absoluto. 
Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, 
passar 5 minutos no álcool 70° e levar até álcool 
absoluto. 
Colocar os cortes A e B na solução metiladora pré aquecida 
por 2 a 5 horas a 60°C. O corte C deve permanecer em água 
destilada pelo mesmo tempo e na mesma temperatura. 
Lavar em água corrente e colocar todos os cortes em álcool 
70°. 
Tratar o corte A com uma das soluções saponificadoras, por 
uma hora à temperatura ambiente. Os cortes B e C devem 
permanecer em álcool 70°. 
Lavar em água corrente por 5 minutos. 
Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as por 
álcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-
éter em partes iguais. 
Lavar em água, ou em solução de ácido acético a 3%, caso a 
manutenção do pH seja importante. 
Corar todos os cortes com Alcian Blue, pH 2,5, por 5 a 30 
minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: 
Corte C (Alcian): coram-se os polissacarídeos carboxilados 
e sulfatados; 
Corte B (metilação + Alcian): bloqueia a coloração dos 
polissacarídeos carboxilados e sulfatados; 
Corte A (metilação + saponificação + Alcian): coram-se 
somente os polissacarídeos carboxilados. 
 
POLISS 4 
Interpretação: 
Caso o corte A fique tão corado quanto o corte C: indica a 
presença de polissacarídeos carboxilados somente. 
Caso o corte A fique menos corado que o corte C: indica a 
presença de polissacarídeos carboxilados e sulfatados. 
Caso o corte A não se core pelo Alcian: indica a presença 
de polissacarídeos sulfatos somente. 
 
Observações: 
a) Sempre que realizar este método colocar para correr 
junto três lâminas de um material já previamente testado 
com bons resultados. 
b) O colódio deve ser bem removido, pois ele se cora com o 
Alcian Blue, interferindo com o resultado. 
 
 
4.5. MÉTODO DA HIDRÓLISE ÁCIDA + ALCIAN BLUE (Quintarelli) 
 
Solução para hidrólise: 
acetato de sódio a 0,02M: 0,164 g em 100 ml de água 
 0,273 g , se for trihidratado. 
ácido clorídrico a 0,02N: 0,164 ml em 100 ml água 
Misturar as duas soluções em partes iguais. 
Medir o pH e acertar para 2,5. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e levar até álcool absoluto dois cortes (A e 
B). 
Colodionar os cortes. 
Deixar secar, passar no álcool e água destilada. 
Colocar o corte A na solução de hidrólise, durante 2 horas 
a 60°C. Acompanhar o procedimento com o corte B, coberto 
com água destilada. 
Descolodionar oscortes com mistura de álcool-éter (partes 
iguais). 
Corar pelo Alcian Blue pH 2,5, durante 30 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultados: 
Estruturas Alcian Blue positivas na lâmina B, que 
diminuírem ou perderem positividade na lâmina A, indicam a 
presença de ácido siálico. 
Pode-se aumentar o tempo ou a temperatura de hidrólise 
para obtenção de melhores resultados. 
 
 
4.6. ALCIAN BLUE + PAS 
POLISS 5 
 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Colocá-los por 30 minutos em solução de Alcian Blue, pH 
2,5. 
Lavar em solução de ácido acético a 3%. 
Passar em água destilada. 
Deixar por 10 minutos em ácido periódico a 1%. 
Lavar rapidamente em água destilada. 
Deixar por 1 hora no Reativo de Schiff (ver preparo do 
reativo de Schiff no ítem PAS, em Histoquímica de 
Polissacarídeos). 
Lavar em água corrente por 10 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
Glicogênio e polissacarídeos neutros em vermelho. 
Polissacarídeos ácidos em azul. 
A cor violeta representa associação de ambos. 
 
 
4.7. ALCIAN BLUE + CONCENTRAÇÃO ELETROLÍTICA CRÍTICA 
 
Solução corante: 
0,05 g de Alcian Blue 
100 ml de tampão acetato 0,2M, pH 5.8 
Adicionar MgCl2.6H2O (PM = 203,30) nas diversas 
molaridades requeridas 0,3M, 0,65M, 0,9M e 1M. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar as lâminas. 
Corar pelas soluções de Alcian Blue com as diferentes 
concentrações de MgCl2, por 18 horas, à temperatura 
ambiente. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
POLISS 6 
Resultado: 
A presença de uma concentração eletrolítica maior na 
solução corante proporciona uma coloração seletiva dos 
polissacarídeos de acordo com o grau crescente de 
sulfatação. 
Com MgCl2 0,3M: coram-se todos os polissacarídeos 
carboxilados e sulfatados. 
Com MgCl2 0,65M: coram-se todos os polissacarídeos 
sulfatados. 
Com MgCl2 0,9M: coram-se heparina, heparam sulfato e 
queratam sulfato. 
Com MgCl2 1M: cora-se somente queratam sulfato. 
 
 
4.8. REAÇÃO FERRO-COLOIDAL (Mowrey) 
 
Preparo da solução estoque de ferro-coloidal: 
Preparar 5 ml de solução de cloreto férrico a 29% (1,45 g 
de cloreto férrico em 5 ml de água). 
Ferver 250 ml de água destilada. 
Com a água fervendo, adicionar 4,4 ml da solução de 
cloreto férrico. Deixar ferver. Quando a solução ficar 
vermelho escuro suspender a fervura e deixar esfriar. 
Dializar a solução contra água destilada gelada 18-24 
horas duas vezes. 
Guardar a solução estoque na geladeira. Dura muitos meses. 
Na hora de usar, diluir esta solução estoque na seguinte 
proporção: 
12 ml de ácido acético 
18 ml de água destilada 
10 ml solução estoque de ferro-coloidal 
 
Preparo da solução de ferrocianeto clorídrica: 
Preparar 15 ml de solução de ferrocianeto de potássio a 
2%: 0,3 g de ferrocianeto de potássio em 15 ml de água. 
Preparar 30 ml de ácido clorídrico 1%: 0,3 ml de HCl em 30 
ml de água. 
Misturar as duas soluções na hora de usar. 
 
Procedimento para reação: 
Desparafinar e hidratar o corte. 
Lavar rapidamente em ácido acético 10%. 
Colocar na solução de ferro coloidal recém-preparada, 
durante 2 horas. 
Lavar em 3 banhos de ácido acético 10%, 3 minutos cada. 
POLISS 7 
Colocar os cortes expostos ao ferro e os cortes controles 
(que ficaram na água) durante 20 minutos na solução de 
ferrocianeto-clorídrica. 
Lavar em água corrente 5 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
Cora polissacarídeos ácidos em azul 
 
Observação: 
a) O ferro coloidal é adsorvido pelos polissacarídeos e é 
visualizado com a subseqüente conversão para ferrocianeto-
férrico (azul da Prússia). 
 
 
4.9. REAÇÃO DO FERRO COLOIDAL (Muller, 1966) 
 
Preparo da solução estoque de hidróxido de ferro coloidal: 
solução aquosa de cloreto férrico a 32%............12 ml 
água destilada....................................750 ml 
Levar a água à ebulição e, quando ferver, ajuntar a 
solução de cloreto férrico. Dura um mês, no máximo. 
Solução de trabalho (preparar na hora de usar): 
solução de hidróxido de ferro coloidal..........100 ml 
ácido acético....................................10 ml 
 
Preparo da solução de ferrocianeto de potássio: 
Ferrocianeto de potássio..............1 g 
HCl concentrado......................1 ml 
Água destilada......................99 ml 
 
Procedimento: 
Desparafinar os cortes e levá-los até a água. 
Tratar com a solução de trabalho de hidróxido de ferro 
coloidal, durante 10 minutos. 
Lavar 5 vezes em água destilada. 
Tratar pela solução ferrocianeto clorídrica recém 
preparada, por 10 minutos. 
Lavar em água destilada. 
Montar. 
 
Resultado: 
Coram-se os polissacarídeos ácidos em azul. 
 
 
4.10. PAS (ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF) 
 
Solução de ácido periódico a 1%: 
POLISS 8 
Esta solução pode ser preparada de duas maneiras: 
periodato de sódio ou potássio ............1 g 
ácido sulfúrico 1N.......................100 ml 
ou, a mais usada: 
ácido periódico............................1 g 
água destilada...........................100 ml 
 
 
PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF: 
Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963 
 
Água destilada........................192 ml 
Ácido clorídrico concentrado............8 ml 
Fucsina Básica (Color Index 42510)....0,5 g 
Sulfito de sódio (Na2SO3)...............5 g ou 
Metabissulfito de sódio (Na2S2O5).....3,8 g 
Carvão ativado........................0,5 g 
 
Dissolver a fucsina na água adicionada de ácido 
clorídrico. 
Junte o sulfito ou o metabissulfito. Fechar o frasco. 
Agitar por 20 a 30 minutos até que a mistura esteja 
límpida e de cor marrom avermelhado. Adicione o carvão 
ativado para descolorir. Agitar por 2 minutos e 
filtrar. O filtrado deverá ser incolor. O reativo 
somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6 horas após 
sua preparação. Guardar na geladeira. 
 
Observações sobre o Reativo de Schiff: 
a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido; 
se não, rejeitá-lo. 
b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo este 
pode descolorir totalmente ou ficar com coloração 
amarelo palha; em qualquer dos casos está bom para ser 
utilizado. 
c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do 
mesmo em alguns mililitros de formol a 10%. Se a 
solução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode ser 
usado. 
 
POLISS 9 
Procedimento para a realização do método PAS: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Colocar no ácido periódico, durante 10 a 15 minutos, na 
geladeira. 
Lavar em várias trocas de água destilada ou lavar 5 
minutos na água corrente e, em seguida, passar pela água 
destilada. 
Colocar no reativo de Schiff durante 1 hora, no escuro, na 
geladeira ou durante 15 minutos, no escuro, à temperatura 
ambiente. 
Lavar em água corrente por 5 a 10 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
Locais ricos em glicogênio ou polissacarídeos neutros, 
contendo grupos 1,-2 glicol, coram-se em vermelho. Os 
proteoglicanos não se coram. 
 
Observações: 
a) Ao retirar-se do Reativo de Schiff pode-se passar pelas 
seguintes soluções: 
bissulfito de sódio 2% durante 2 minutos 
ou 
vários banhos de HCl 3N durante 2 minutos 
ou 
3 banhos de água sulfurosa de 2 minutos cada 
Preparo da água sulforosa: 
Metabissulfito de sódio a 10% ...............10 ml 
HCl 1N.......................................10 ml 
Água destilada...............................180 ml 
De modo geral, estes banhos são desnecessários. 
b) Para material incluído em historesina o ácido periódico 
deve ser a 0,4% e os cortes devem ficar no Reativo de 
Schiff por 30 minutos. 
 
 
4.11. ACETILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + PAS 
 
Solução acetiladora: 
Anidrido acético..................32,5 ml 
Piridina..........................50,0 ml 
 
Solução saponificadora: 
Solução de BaOH a 4% em álcool 80° 
 
POLISS 10 
Procedimento: 
Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcool 
absoluto. 
Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, 
passar 5 minutos no álcool70° e levar até álcool 
absoluto. 
Passar os corte A e B na piridina por 2 minutos. 
Colocar os cortes A e B na solução acetiladora recém-
preparada, durante 24 horas à temperatura ambiente. O 
corte C deve permanecer em água destilada pelo mesmo tempo 
e na mesma temperatura. 
Lavar em álcool absoluto. 
Recolodionar os cortes. 
Passar no álcool 70° por 5 minutos. 
Passar no álcool 80°. 
Colocar o corte A na solução saponificadora, por 4 a 5 
minutos, a temperatura ambiente. Os cortes B e C devem 
permanecer no álcool 80°. 
Lavar em água destilada. 
Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as por 
álcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-
éter em partes iguais. 
Lavar em água. 
Realizar o método de PAS. 
 
Resultado: 
Corte C (PAS): coram-se o glicogênio e os polissacarídeos 
neutros. 
Corte B (acetilação + PAS): bloqueia a coloração dos 
polissacarídeos neutros. 
Corte A (acetilação + saponificação + PAS): 
polissacarídeos neutros bloqueados pela acetilação voltam 
a se corar. 
 
 
4.12. P.A.S. + BOROHIDRIDO 
 
Solução de borohidrido de sódio: 
Borohidrido de sódio (NaBH4 ; P.M = 37,83)........0,1 g 
Na2HPO4 (anidro)..................................1,0 g 
Água destilada...................................100 ml 
Dissolver o fosfato de sódio na água e então acrescentar o 
borohidrido. Preparar solução nova cada vez que for usar. 
O pH deve ser 9,4. 
 
POLISS 11 
Procedimento: 
Desparafinar três lâminas (A, B e C) e levar até a água. 
Tratar a lâmina A e B com ácido periódico a 1%, por 30 
minutos. A lâmina C deve permanecer no ácido periódico por 
24 horas. 
Lavar bem as lâminas em água destilada. 
Tratar a lâmina B com a solução de borohidrido, por 30 
minutos, enquanto a lâmina A espera em solução aquosa de 
Na2HPO4 .sem o borohidrido. 
Lavar as lâminas em água corrente. 
Tratar as lâminas com Reativo de Schiff, por 15 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: 
Lâmina A: somente os polissacarídeos neutros e o 
glicogênio aparecem corados em magenta (P.A.S. normal). 
Lâmina B: bloqueio total da coloração dos polissacarídeos 
neutros e do glicogênio. 
Lâmina C: coram-se, em magenta, tanto os polissacarídeos 
neutros quanto os ácidos (glicosaminoglicanas). 
 
Observação: 
a) Com o tempo maior de exposição ao ácido periódico (24 
horas) os grupamentos 1,2 glicol das glicosaminoglicas 
também dão origem a aldeídos e reagem com o Reagente de 
Schiff. 
b) o borohidrido serve para bloquear a positividade do 
P.A.S. 
c) Aconselha-se usar cortes colhidos em lâminas com algum 
tipo de adesivo e/ou colodionar os cortes. 
d) O tempo durante o qual as lâminas A e B permanecem no 
primeiro ácido é 30 minutos, ao invés dos 10 a 15 minutos 
do P.A.S. de rotina. Assim, as glicoproteínas neutras e o 
glicogênio produzam o máximo de grupamentos aldeídos neste 
estágio, para que sejam efetivamente bloqueados pelo 
borohidrido. 
 
 
 
 
 
 
 
ACNUCL 1 
5. ÁCIDOS NUCLÉICOS 
 
 
5.1. COLORAÇÃO DE ACRIDINE ORANGE (Ganter e Jolles) 
 
Solução estoque de Acridine Orange: 
Acridine Orange....................1 g 
H2O destilada...................1000 ml 
 
Solução de Trabalho: 
Solução Estoque de Acridine Orange.........10 ml 
PBS (pH 6,0 a 6,5).........................90 ml 
 
Corar 15 minutos na solução de trabalho de acridine 
orange. 
Lavar em PBS. 
Cobrir a lâmina com glicerina e observar no microscópio de 
fluorescência. 
 
Observações: 
a) A fixação do material deve ser feita em Carnoy ou 
etanol acético; para esfregaços ou culturas de células a 
fixação deve ser feita em acetona metanol. 
b) O preparado descora e muda de cor depois de um tempo. 
c) Alguns autores recomendam, após lavar no PBS, passar em 
uma solução de cloreto de cálcio 0,1M, por 1 a 2 minutos 
e, em seguida, lavar em PBS por 10 segundos, antes de 
montar. 
 
Resultado: coram-se as estruturas ricas em ácidos 
nucléicos. 
 
 
5.2. AZUL DE TOLUIDINA ÁCIDO 
 
Solução corante: 
Azul de Toluidina 0,5% em água; pH 3,5 (acertar com HCl 
0,1N) 
 
Procedimento: 
Corar as lâminas durante 1 a 24 horas a 60°C (com o 
corante pré-aquecido a esta temperatura). 
Lavar em água destilada. 
Imergir em molibdato de sódio ou potássio 1%, por 30 
segundos, para evitar descoloração posterior. 
Montar. 
 
ACNUCL 2 
Resultado: 
Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA e 
polissacarídeos ácidos. 
 
 
5.3. MÉTODO DE FEULGEN PARA DNA 
 
Solução de ácido clorídrico 1N: 8,5 ml de HCl em 91,5 ml 
de água destilada. 
 
Solução aquosa de metabissulfito de sódio ou de potássio a 
0,5%. 
 
Reativo de Schiff. 
 
PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF 
Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963. 
 
Água destilada.........................192 ml 
Ácido clorídrico concentrado.............8 ml 
Sulfito de sódio (Na2SO3)................5 g ou 
Metabissulfito de sódio (Na2S2O5)......3,8 g 
Fucsina Básica (Color Index 42510).....0,5 g 
Carvão ativado.........................0,5 g 
 
Dissolver a fucsina na água adicionada de ácido 
clorídrico. Juntar o sulfito ou o metabissulfito. 
Fechar o frasco. Agitar por 20 a 30 minutos até que a 
mistura esteja límpida e de cor marrom avermelhado. 
Adicionar o carvão ativado para descolorir. Agitar por 
2 minutos e filtrar. O filtrado deverá ser incolor. O 
reativo somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6 
horas após sua preparação. Guardar na geladeira. 
 
Observações sobre o Reativo de Schiff: 
a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido; 
se não, rejeitá-lo. 
b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo este 
pode descolorir totalmente ou ficar com coloração 
amarelo palha; nos dois casos está bom para ser usado. 
c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do 
mesmo em alguns mililitros de formol a 10%; se a 
solução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode ser 
usado. 
 
ACNUCL 3 
Procedimento para realização do método de Feulgen: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Hidrolisar os cortes, a 60°C, durante 5 a 20 minutos, no 
ácido clorídrico 1N pré-aquecido a esta temperatura. 
Interromper a hidrólise através de uma lavagem em água 
destilada. 
Transferir para o Reativo de Schiff, durante 45 minutos. 
Lavar os cortes em três banhos de metabissulfito de sódio 
ou potássio durante 2 minutos cada. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: 
O DNA nuclear cora-se em vermelho escuro. 
Os núcleos de microorganismos, como plasmódios, 
sarcosporídeos, toxoplasma, histoplasma, etc., coram-se em 
vermelho pálido devido ao seu baixo teor de DNA. 
 
Observações sobre o método de Feulgen: 
a) O metabissulfito utilizado deve ser ativo. Conhece-se 
pelo seu forte cheiro característico. 
b) O tempo de hidrólise com ácido clorídrico varia com o 
tipo de fixador que foi usado e com o tempo de fixação. No 
caso do formol, o tempo de hidrólise é ao redor de 8 
minutos; para o Bouin, deve ser um pouco menor; para o 
Helly, deve ser ao redor de 5 minutos. Para obter bons 
resultados convém testar vários tempos de hidrólise, entre 
5 a 15 minutos para cada bloco utilizado. 
c) O método de Feulgen baseia-se no fato de que o HCl 
quebra a ligação purina-desoxiribose formando grupamentos 
aldeídicos, que podem ser visualizados pelo Reativo de 
Schiff pela formação de um novo composto de adição 
insolúvel e de cor vermelho forte. O processo de hidrólise 
não afeta o RNA, de modo que o método é específico para 
DNA. 
d) Se quiser, antes de montar, contracorar em solução 
0,01% Fast Green - FCF em álcool 95° durante alguns 
segundos. 
e) Se a lâmina estiver colodionada, deve-se retirar o 
colódio antes de tratar pelo Reativo de Schiff. 
 
 
ACNUCL 4 
5.4. GALOCIANINA 
 
Solução corante: 
10 g de alúmen de cromo 
0,3 g de galocianina 
200 ml de água destilada 
 
Dissolver o álumen em 200 ml de água e acrescentar a 
galocianina. Misturar por agitação elevar lentamente à 
fervura. Ferver por 10 a 20 minutos. Esfriar lentamente. 
Filtrar e completar para 200 ml com água destilada. A 
solução deve ter pH 1,8. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar na solução corante por 24 a 48 horas. 
Lavar em água destilada. 
Montar. 
 
Resultado: 
Ácidos nucléicos corados em azul profundo. 
 
 
5.5. LÍTIO-CARMIN (de Örth) 
 
Preparo da solução corante: 
Preparar 100 ml de solução saturada de carbonato de lítio 
(aproximadamente 1,25 g em 100 ml). 
Dissolver 2,5 a 5,0 g de carmin (C.C.) em 100 ml da 
solução de carbonato de lítio e levar à ebulição. Ferver 
durante 10 a 15 minutos. Quando esfriar, adicionar 1 g de 
timol e filtrar. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar na solução corante por 2 a 5 minutos. 
Transferir diretamente para o álcool-ácido. 
Proceder a um ou mais banhos em álcool-ácido para fixar o 
corante no núcleo e para diferenciação; controlar a 
diferenciação ao microscópio. 
Lavar em água corrente. 
Desidratar em álcool 95° e 100°. 
Montar. 
 
Resultado: 
núcleos em vermelho; citoplasma rosa claro ou descorado. 
GRANUL 1 
6. GRÂNULOS CITOPLASMÁTICOS 
 
 
6.1. SIRIUS RED ALCALINO - HEMATOXILINA 
 
Solução corante: 
Sírius Red F3B .........................0,5 g 
álcool absoluto.........................50 ml 
Solução aquosa de NaOH a 1%..............1 ml 
Solução aquosa de NaCl a 20%.............4 ml 
Água destilada..........................45 ml 
 
Dissolver o Sírius na água destilada; acrescentar o álcool 
e, em seguida, o NaOH. Agitar várias vezes até dissolver 
bem. Deixar repousar por duas horas; gotejar lentamente, 
agitando bem, o NaCl até obter um ligeiro precipitado; 
deixar repousar de um dia para o outro e filtrar; a 
solução se conserva, na geladeira, por um ou dois meses. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e levar até a água. 
Corar pela hematoxilina por 2 a 3 minutos. 
Lavar em água corrente por 5 minutos. 
Passar pelo álcool 70°. 
Corar no Sírius alcalino por 1 hora. 
Lavar em água corrente por 10 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
Coram-se em vermelho os eosinófilos e amilóide. 
 
Observações: 
a) Após o acréscimo do NaOH, o pH da solução ficará em 
torno de 12 e permanecerá assim até o final. A receita 
original manda acertar o pH para 10,5, o que pode ser 
feito acrescentando-se gotas de HCl 1N nesta etapa. 
Para evitar-se o acréscimo de HCl, pode-se omitir o NaOH, 
pois, em qualquer das três circunstâncias, ou seja, com 
NaOH (pH 12), com NaOH e HCl (pH 10,5) ou sem nenhum dos 
dois (pH 11), o corante funciona perfeitamente. 
 
 
GRANUL 2 
6.2. LEISHMAN (para esfregaços de sangue) 
 
Solução corante estoque: 
0,2 g de Leishman 
100 ml de álcool metílico p.a. 
O corante leva um mês para amadurecer e dura anos. 
 
Solução corante de trabalho: 
Na hora de usar, diluir o corante na proporção de 1 ml de 
corante para 3 ml de água tamponada. 
 
Procedimento: 
Fixar o esfregaço em metanol, por 2 a 3 minutos. 
Colocar sobre o esfregaço a solução corante de trabalho e 
deixar de 3 a 5 minutos. 
Lavar em água tamponada. 
Secar ao vento. 
Examinar ao microscópio com óleo de imersão. 
 
Resultado: 
grânulos dos eosinófilos: rosa alaranjado. 
grânulos dos neutrófilos: púrpura a violeta. 
grânulos dos basófilos: violeta escuro. 
núcleo dos monócitos: violeta claro. 
citoplasma dos monócitos: cinza claro. 
grânulos centrais das plaquetas: violeta. 
grânulos periféricos das plaquetas: azul claro. 
eritrócitos: coloração variando de rosa amarelado a cinza, 
dependendo do pH. 
 
Observação: 
a) a água tamponada deve ser feita adicionando-se 1 ml de 
tampão fosfato 0,1M (pH 6,5) para cada 30 a 40 ml de água 
destilada. 
b) aconselha-se, após a coloração, proceder a uma 
diferenciação com água destilada (que é ligeiramente 
ácida) ou com ácido acético muito diluído (0,05%) para 
retirar o excesso de azul, tornar as hemácias bem rosadas 
e realçar os grânulos dos eosinófilos. 
 
 
 
FIBRMATR 1 
7. FIBRAS DA MATRIZ EXTRACELULAR 
 
 
7.1. ALDEÍDO-FUCSINA (Gomori) 
 
Solução corante: 
Fucsina básica...........0,5 g 
Álcool 70°...............100 ml 
Dissolver a fucsina, se necessário com ligeiro 
aquecimento. Deixar esfriar. Filtrar. 
Adicionar: 
Ácido clorídrico concentrado ...1 ml 
Paraldeído......................1 ml 
 
Deixar a solução amadurecer à temperatura ambiente (48 hs) 
ou a 50°C (menos tempo), em recipiente fechado. A solução 
passa de vermelho para roxo, quando estará em condições de 
ser usada. 
Quando guardada a 4°C pode ser usada por várias semanas. À 
temperatura ambiente dura até 4 dias. 
 
Solução Oxidante: Ácido per-acético a 40% encontrada 
comercialmente ou preparada da seguinte maneira: 
ácido acético........................9,5 ml 
ácido sulfúrico.....................0,25 ml 
peróxido de hidrogênio a 30%........30,0 ml 
 
A solução deve amadurecer por 1 a 3 dias e ser estocada em 
geladeira (4°C). Colocar 4 mg de fosfato dissódico após os 
3 dias para estabilizar a solução. 
 
Procedimento para coloração: 
 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Oxidar os cortes com a solução de ácido per-acético a 40% 
por 30 minutos. 
Lavar em água corrente por 2 minutos. 
Corar com aldeído-fucsina por 10 a 20 minutos. 
Diferenciar os cortes: 4 trocas em álcool 95° por 2 
minutos e uma troca em álcool 70° por 4 minutos; controlar 
ao microscópio. 
Desidratar, diafanizar e montar. 
 
FIBRMATR 2 
Resultado: 
Sistema elástico em púrpura. 
Omitindo-se a oxidação dos cortes, coram-se apenas as 
fibras elásticas e elaunínicas. 
Outras estruturas que também se coram: algumas 
glicosaminoglicanas (como por exemplo, aquelas presentes 
na matriz cartilaginosa e nos grânulos dos mastócitos), 
queratina, grânulos de zimogênio, células beta do pâncreas 
e hipófise. 
 
Observações: 
a) Recomenda-se fixar o material em fixadores aldeídicos 
como o formol ou o Bouin que praticamente não dão 
coloração de fundo. Fixadores com sais de mercúrio (como 
Helly ou Zenker) dão coloração de fundo lilás pálido. 
b) O aldeído-fucsina é um corante transitório. 
A fucsina básica (vermelha) com paraldeído, sob condições 
ácido-alcóolica, forma gradualmente um corante violeta 
denominado aldeído-fucsina (à temperatura ambiente). 
O corante forma-se lentamente, e após um período de 2 
semanas ocorrem posteriores modificações, quando as 
substâncias formadas não são mais úteis como corante. Para 
preservar por mais tempo o corante costuma-se mantê-lo a 
4°C. Alguns autores acham que mesmo nesse caso o corante 
não é muito confiável. 
c) Em vez de usar o ácido per-acético é preferível 
proceder a oxidação com solução 10% de OXONA, por 30 
minutos (ver Técnica da Resorcina-Fucsina de Weigert) 
ou 
oxidar com solução de monoperssulfato de potássio, por 2 a 
3 minutos; usar solução recém preparada, de acordo com a 
seguinte instrução: 
10 ml de permanganato de potássio a 2,5%: 0,25 g/10 ml de 
água destilada 
10 ml de ácido sulfúrico a 5%: 0,52 ml/10 ml de água 
80 ml de água destilada 
d) Recomenda-se que o paraldeído usado na preparação do 
corante seja novo (não mais de 3 ou 4 meses). 
 
 
FIBRMATR 3 
7.2. CRESIL - VIOLETA (fibras oxitalânicas) 
Garotek & Jewemoka, 1964 (Cotta-Pereira) 
 
Solução corante: solução aquosa de cresil-violeta a 0,01% 
 
Solução oxidante: solução aquosa de Oxona a 10% (ver 
técnica da Resorcina Fucsina de Weigert) 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Oxidá-los pela Oxona, por 40 minutos. 
Lavar 5 minutos em água corrente. 
Corar 15 minutos na solução de cresil-violeta. 
Montar. 
 
Resultado: 
Coram-se as fibras oxitalânicas. 
 
 
7.3. IMPREGNAÇÃO ARGÊNTICA (Gomori) 
 
Soluções necessárias: 
 
Solução de prata amoniacal: 
 
Preparar 20 ml de solução aquosa de nitrato de prata a 
10%. 
Preparar 3,0 ml de sol. aquosa de hidróxidode potássio 
10%. 
Preparar 50 ml de sol. aquosa de hidróxido de amônia a 
28%. 
 
Misturar 10 ml da solução de nitrato de prata em 2,5 ml da 
solução de hidróxido de potássio. 
Adicionar, gota a gota, a solução de hidróxido de amônia, 
agitando energicamente o frasco somente até o ponto em que 
o precipitado se dissolva. 
Em seguida, adicionar, gota a gota, a solução de nitrato 
de prata, até que se forme um pouco de precipitado, o qual 
se dissolve facilmente com a agitação. Completar para o 
dobro de volume com água destilada e estocar em vidro 
escuro. Filtrar antes de usar. 
Imediatamente antes de usar, diluir 1:8 em água destilada. 
 
Solução de Permanganato de Potássio a 0,5% 
 
Solução de Metabissulfito de Potássio a 2% 
 
FIBRMATR 4 
Solução de Sulfato Férrico - Amoniacal a 2% 
 
Solução de Formalina a 20% 
 
Formaldeído (37-40%)......20 ml 
Água destilada............80 ml 
 
Solução de Cloreto de Ouro a 0,2% 
 
Solução de Cloreto de ouro a 1%.......10 ml 
Água destilada........................40 ml 
Para fazer a solução de Cloreto de ouro 1% quebre a ampola 
de cloreto de ouro (15 gramas) em um béquer com 100 ml de 
água destilada. 
 
Solução de Tiossulfato de Sódio a 2% 
 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar as lâminas 
Lavar em água destilada. 
Atenção: daqui para frente, pingar as soluções sobre os 
cortes. 
Oxidar em permanganato de potássio, por 1 minuto. 
Lavar em água corrente por dois minutos. 
Diferenciar com solução de metabissulfito, por 1 minuto. 
Lavar em água corrente por 2 minutos. 
Passar na solução de sulfato férrico-amoniacal, por 1 
minuto. 
Lavar em água corrente, por 2 minutos. 
Lavar em duas passagens de água destilada, 30 segundos 
cada. 
Impregnar na solução de prata amoniacal, durante 10 
segundos a 1 minuto. 
Mergulhar em água destilada por 20 segundos. 
Reduzir na solução de formalina, por 3 minutos, agitando 
suavemente durante o primeiro minuto. 
Lavar em água corrente por 3 minutos. 
Passar em água destilada (2 a 3 banhos). 
Fazer a viragem em cloreto de ouro, por 10 minutos (até 
ficar cinza). 
Mergulhar em água destilada. 
Reduzir na solução de metabissulfito de potássio, por 1 
minuto. 
Fixar na solução de tiossulfato de sódio, por 1 minuto. 
Lavar em água corrente, por 2 minutos. 
Montar. 
 
FIBRMATR 5 
Resultado- fibras reticulares em negro, fibras colágenas 
em castanho e coloração de fundo em cinza. 
 
Observações: 
a) Este método é bastante complexo e deve ser seguido nos 
mínimos detalhes. 
b) Os frascos contendo as soluções devem ser perfeitamente 
limpos. 
c) Todos os reagentes devem ser da maior pureza possível e 
acuradamente medidos e pesados. 
d) Qualquer excesso de hidróxido de amônia na solução de 
prata amoniacal provoca perda da sensibilidade do método, 
resultando em preparados fracamente ou não corados. 
e) Devido ao fato dos reagentes empregados serem de 
natureza bastante alcalina, os cortes tendem a se soltarem 
da lâmina. Assim sendo, deve-se proceder à colagem dos 
cortes, tomando-se cuidado para não colocar colantes em 
excesso, pois resultam em formação de precipitados em 
lugares inadequados. 
f) Os reagentes devem ser sempre dissolvidos em água 
destilada ou deionizada, para evitar precipitação de sais 
de prata insolúveis. 
g) A solução de tiossulfato de sódio serve para remover o 
excesso de prata que fica no tecido sob a forma não-
precipitada. 
h) A impregnação pela prata deve ser, ao final, convertida 
em impregnação pelo ouro para resultar em um preparado 
permanente e produzir uma coloração negra de alta 
densidade. 
i) Se for utilizar soluções preparadas há mais de um mês e 
estocadas na geladeira, antes de corar o material 
desejado, core um material já testado com bons resultados, 
pois alguma das soluções pode não estar funcionando mais. 
 
 
7.4. ORCINOL - NEOFUCSINA (método usado por Cotta-Pereira 
para fibras elásticas) 
Fullmer & Lillie, 1956, 1958. 
 
Preparo da solução de orcinol-neofucsina: 
 
Colocar em ebulição 200 ml de água destilada. 
Adicionar 2 g de neofucsina (cuidado). 
Adicionar 4 g de orcinol (cuidado). 
Deixar em ebulição por 5 minutos. 
Adicionar 25 ml de solução aquosa de cloreto férrico a 
30%. 
Deixar em ebulição por mais 5 minutos. 
FIBRMATR 6 
Deixar esfriar e filtrar. 
Descartar o filtrado e dissolver o depósito retido no 
papel de filtro em 100 ml de etanol 95°. 
Estocar na geladeira, por até 3 meses. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar em solução de orcinol-neofucsina, por 15 minutos, a 
37°C (com o corante pré-aquecido a esta temperatura). 
Passar em três trocas de álcool 70°, por 5 minutos em cada 
troca. 
Desidratar, diafanizar e montar. 
 
 
7.5. ORCEINA 
 
Solução corante: 
1 g de orceína 
100 ml de álcool 70° 
0,6 ml de HCl concentrado 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar com a solução de orceína durante 30 a 60 minutos. 
Enxaguar em água destilada. 
Secar a água em excesso. 
Passar no álcool 95° para tirar o excesso de corante. 
Deixar no álcool absoluto durante 5 a 30 minutos até que o 
corte esteja castanho claro. Verificar ao microscópio se 
as fibras elásticas estão bem pretas. 
Descorar o fundo colocando os cortes no álcool ácido: 1 ml 
de HCl em 99 ml de álcool 70°; este procedimento deve ser 
feito, controlando ao microscópio, até que o fundo fique 
bem incolor. A descoloração é obtida entre 2 a 10 minutos. 
Lavar em água corrente durante 5 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
fibras elásticas coradas em castanho-preto. 
 
 
FIBRMATR 7 
7.6. PICROSSÍRIUS - HEMATOXILINA 
 
Sírius Red..............................0,2 g 
Solução saturada de ácido pícrico.......100 ml 
 
Misturar e colocar um pouco de ácido pícrico (em pó) para 
que apareça um precipitado no fundo do frasco. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e levar as lâminas até água. 
Corar durante 1 hora no Picrossírius à temperatura 
ambiente. 
Lavar em água corrente por 5 minutos. 
Corar pela Hematoxilina de Harris por 6 minutos (ou menos, 
se a hematoxilina for nova). 
Lavar por 10 minutos em água corrente. 
Montar. 
 
Observações: 
a) Trocar o corante uma vez por mês se este for muito 
utilizado. 
b) A solução deverá estar sempre saturada. 
c) Especificação do Sirius Red: F 3 B 200 (Mobay Chemical 
Co., Union, NJ). 
d) Para experimentos quantitativos deve-se omitir a 
contracoloração pela hematoxilina. 
e) Ler sobre o método do Picrossírius associado à digestão 
pela papaína em DIGESTÃO ENZIMÁTICA. 
 
 
7.7. RESORCINA-FUCSINA DE WEIGERT COM E SEM OXIDAÇÃO 
 
Solução corante: Resorcina-Fucsina 
Solução oxidante: Oxona 10% em água destilada 
 
Preparo da Solução corante: 
Água destilada ..............200 ml 
Fucsina básica ................2 g 
Resorcina .....................4 g 
Cloreto férrico a 30%..........50 ml 
Álcool 95.....................200 ml 
HCl concentrado ................2 ml 
 
Adicionar a fucsina e a resorcina na água destilada. 
Colocar esta solução em ebulição. Adicionar o cloreto 
férrico. Continuar em ebulição por 4 minutos. Esperar 
esfriar e filtrar. Descartar o filtrado e deixar secar o 
depósito retido no papel de filtro. Dissolver este 
FIBRMATR 8 
depósito em 200 ml de etanol 95° aquecido. Deixar esfriar 
e adicionar o HCl. 
Guardar a solução na geladeira. Dura um ano ou mais. 
 
A) Procedimento para os cortes que não serão oxidados: 
 
Desparafinar e hidratar até álcool 95°. 
Corar pela Resorcina-fucsina, por 1 hora, à temperatura 
ambiente. A Resorcina-fucsina deve estar à temperatura 
ambiente antes de colocar os cortes para corar. 
Lavar na água corrente durante 5 minutos. 
Colocar em duas trocas de álcool 70°durante 10 minutos no 
total. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciação. 
Desidratar, diafanizar e montar. 
Se necessário, depois do álcool 70°,remover a coloração de 
fundo passandoem uma solução de álcool-ácido a 1% (1 ml 
de HCl concentrado em 99 ml de álcool 70). Controlar ao ao 
microscópio tendo o cuidado de preservar a coloração das 
fibras mais finas; após a diferenciação em álcool-ácido 
lavar em água corrente. 
 
 
B) Procedimento para cortes que serão oxidados: 
 
Desparafinar e hidratar até água. 
Pingar sobre os cortes a solução aquosa de OXONA 10% e 
deixar oxidando durante 40 minutos (ver observação b.). 
Lavar em água corrente por 5 minutos. 
Passar pelo álcool 70°. 
Passar pelo álcool 95°. 
Corar pela Resorcina-fucsina durante 1 hora, à temperatura 
ambiente. 
Lavar na água corrente durante 5 minutos. 
Colocar em duas trocas de álcool 70°durante 10 minutos no 
total. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciação. 
Desidratar, diafanizar e montar. 
Se necessário, depois do álcool 70°,remover a coloração de 
fundo passando em uma solução de álcool-ácido a 1% (1 ml 
de HCl concentrado em 99 ml de álcool 70°). Controlar ao 
ao microscópio tendo o cuidado de preservar a coloração 
das fibras mais finas; após a diferenciação em álcool-
ácido lavar em água corrente. 
 
Resultado: nos cortes que não foram submetidos à oxidação 
coram-se fibras elásticas e elaunínicas; nos cortes 
submetidos à oxidação coram-se fibras elásticas, 
elaunínicas e oxitalânicas. 
 
FIBRMATR 9 
Observação: 
a) Se o cloreto férrico contiver impurezas, a coloração 
não sairá bem; até mesmo o cloreto férrico novo pode ter 
sais ferrosos e pode ser substituído por nitrato férrico 
que é considerado livre de sais ferrosos. 
b) Referência da OXONA: composto monopersulfato, Du Pont, 
Wilmington, Delaware, E.U.A.). 
 
7.8. HEMATOXILINA FÉRRICA DE VERHOEFF 
 
Preparo da solução corante: 
Hematoxilina..................................1 g 
Álcool 100°..................................20 ml 
Solução aquosa de cloreto férrico a 10%.......8 ml 
Solução de Lugol..............................8 ml 
 
Preparo da solução de Lugol: 
Iodo...........................2 g 
Iodeto de potássio.............4 g 
Completar para 100 ml com água destilada. 
 
Preparo do Bouin: 
Solução saturada aquosa de ácido pícrico........750 ml 
Formol 36-40%...................................250 ml 
Ácido acético glacial............................50 ml 
 
Preparo da solução diferenciadora: 
cloreto férrico...............1 g 
água destilada...............50 ml 
 
Dissolver a hematoxilina no álcool. Adicionar a solução de 
cloreto férrico. Misturar e adicionar o lugol. 
 
Procedimento: 
Desparafinar os cortes e levar até à agua. 
Colocar na solução de Bouin por 30 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Colocar na solução corante por 20 a 30 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Diferenciar por poucos segundos na solução de cloreto 
férrico, controlando ao microscópio até que estejam 
coradas somente as fibras elásticas; se diferenciar 
demais, voltar para a solução corante. 
Lavar em água corrente. 
Lavar em álcool 95° por 2 a 5 minutos para remover 
qualquer coloração devida apenas ao iodo. 
Lavar em água corrente. 
Desidratar rapidamente através do gradiente alcoólico. 
FIBRMATR 10 
Diafanizar e montar. 
 
Observações: 
a) Prepare todas as soluções na hora do uso e só core em 
solução corante recém preparada. 
b) Se o cloreto férrico contiver impurezas, a coloração 
não sairá bem; até mesmo o cloreto férrico novo pode ter 
sais ferrosos e pode ser substituído por nitrato férrico, 
que é considerado livre destes sais. 
c) O Bouin atua como mordente, aumentando o contraste das 
fibras elásticas após a diferenciação. 
 
 
7.9. TRICRÔMICO DE MALLORY 
 
Soluções corantes: 
Solução A: 
0,5 g de fucsina ácida 
100 ml de água destilada 
Solução B: 
0,5 g de azul de anilina 
2,0 g de orange G 
1,0 g de ácido fosfotúngstico 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar pela solução A durante 2 minutos. 
Passar diretamente para a solução B, corando durante 5 a 
10 minutos. 
Lavar em água corrente até tirar o excesso de corante. 
Passar pelo álcool 80° por alguns segundos. 
Desidratar e montar. 
 
Resultado: 
Tecido conjuntivo cora-se em azul e tecido muscular em 
vermelho. 
 
 
7.10. AZAN (modificado por Heidenhaim) 
 
Soluções corantes: 
Solução A (solução de azocarmin): 
0,25 a 1,0 g de azocarmin B 
100 ml de água destilada 
1 ml ácido acético glacial 
Se for usado o Azocarmin G, saturar 100 ml de água 
destilada, por aquecimento, com 0,1 g do corante; esfriar 
e acidificar com 1 ml de ácido acético glacial. 
FIBRMATR 11 
 
Solução B (azul de anilina-orange G): 
Preparo da solução estoque: 
0,5 g de azul de anilina solúvel em água 
2,0 g de orange G 
8,0 ml de ácido acético glacial 
100 ml de água destilada 
Dissolver o orange G na água destilada; acrescentar 
lentamente e misturando sempre, o ácido acético; adicionar 
o azul de anilina e filtrar. 
Preparo da solução de trabalho: 
33 a 50 ml da solução B estoque misturados à água 
destilada que seja suficiente para 100 ml. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar na solução A, na estufa 50 a 55°, por 30 a 60 
minutos e, em seguida, continuar corando pela solução, à 
temperatura ambiente, por 1 a 2 horas. 
Lavar em água destilada. 
Mergulhar em solução de ácido acético a 1% em álcool 95°. 
Colocar em solução aquosa de ácido fosfotúngstico a 5%, 
durante 30 minutos a 3 horas (mordente). 
Lavar em água destilada durante 3 minutos. 
Corar na solução B de trabalho, durante 1 a 3 horas. 
Lavar em água destilada. 
Dar dois banhos de álcool 95°, dois banhos de álcool 100° 
e dois banhos de xilol. 
Montar. 
 
FIBRMATR 12 
Resultado: 
vermelho: núcleo, osteócitos, eritrócitos, neuroglia, 
depósitos de imunocomplexos na membrana basal de alças 
capilares glomerulares. 
vermelho alaranjado: músculo. 
azul: membrana basal, fibras colágenas, fibras 
reticulares, fibrina, muco, saliva. 
 
Observação: 
a) a solução A e a solução estoque B devem ser guardadas 
em geladeira; a solução de trabalho B deve ser descartada. 
HISTORES 1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
V. HISTORESINA 
 
HISTORES 2 
ÍNDICE 
 
 
1. FIXAÇÃO 
2. DESIDRATAÇÃO 
3. INCLUSÃO 
4. MICROTOMIA 
5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES 
6. COLORAÇÃO 
7. USO DO KNIFE-MAKER DO ADOLPHO LUTZ 
 
HISTORES 3 
 
1. FIXAÇÃO 
Uma das dimensões do material a ser fixado deverá medir no 
máximo 1 a 2 mm para que o fixador penetre bem. A fixação 
deverá ser feita em solução de paraformaldeído a 4% em PBS 
neutro ou solução de glutaraldeído a 2% isotônica e 
neutra. O tempo de fixação deverá ser de 6 a 12 horas 
(ideal é 8 horas). 
 
 
2. DESIDRATAÇÃO 
Álcool 70°, por uma noite (no mínimo por 2 horas); 
Deixar em acetona pura, por 2 a 3 dias, trocando-a 
diariamente. 
A desidratação poderá ser feita também da seguinte maneira: 
Desidratar em álcool 70°, por uma noite; 
2 banhos em álcool 95°, de 30 minutos cada 
4 banhos em álcool absoluto (total de 2 a 3 horas) 
Órgãos que contenham ar, como o pulmão, devem ser 
colocados no vácuo por aproximadamente 30 minutos, durante 
a passagem no álcool 70°. 
 
3. INCLUSÃO 
O material pode ser incluído em cápsulas de gelatina 
(formato de cápsulas de remédio) ou em forminhas 
retangulares de plástico, que se prestam mais pelo próprio 
formato e por permitirem mudar o plano de corte. 
 
HISTORES 4 
3.1. PREPARAÇÃO DA RESINA 
 
Durante o processo de inclusão são utilizadas duas 
soluções (A e B) preparadas a partir do kit para 
Historesina adquirido comercialmente: 
 
PREPARO DA SOLUÇÃO A: 
Solução de peróxido de benzoila a 1% em Tecnovit 1 ou 
Historesin (hidroxietil metacrilato), preparada da 
seguinte maneira: 
0,15 g de peróxido de benzoila 
15 ml de Tecnovit 1 
Agitar suavemente por 10 a 15 minutos. 
Usa-sea solução A para a pré-inclusão. 
Esta solução é estável à temperatura ambiente por 4 
semanas. 
Esta quantidade é suficiente para a inclusão de 10 blocos 
em cápsulas de gelatina. 
Pode-se guardar na geladeira por até uma semana. 
 
PREPARO DA SOLUÇÃO B: 
5 ml da solução A 
0,33 ml do polimerizador (Tecnovit 2). 
Misturar cerca de 5 minutos. 
Esta solução é usada para a inclusão propriamente dita e 
deve ser feita no momento de usar e colocada no gelo; caso 
HISTORES 5 
contrário, polimeriza em cerca de 10 minutos. Pode ficar 
no gelo até por 1 hora sem polimerizar-se. 
Se a resina for velha, pode-se agregar mais polimerizador, 
até 0,46 ml em 5 ml da solução A. 
Necessita-se cerca de para 0,5 ml por cápsula de gelatina. 
 
3.2.PROCEDIMENTO PARA INCLUSÃO: 
Colocar o material numa mistura 1:1 de solução A e acetona 
(ou álcool absoluto, caso a desidratação tenha sido feito 
nele), por 12 horas, girando. 
Colocar em resina pura, a 24 horas, girando. 
Encher as cápsulas de gelatina ou as forminhas de plástico 
com a solução B recém-preparada; se usar forminhas de 
plástico, untá-las com silicone antes de colocar a resina, 
para evitar que se ressequem e assim, duram mais. 
Colocar o material com a superfície de corte próxima ao 
local que vai ser cortado; se a inclusão é em cápsula de 
gelatina, deve-se colocar a superfície de corte para o 
fundo da cápsula; se é forminha de plástico, deve-se 
colocar a superfície de corte para baixo. 
Se o material se deslocar ou estiver em posição 
inadequada, pode-se posicioná-lo dentro da cápsula na 
posição desejada, com a ajuda de um alfinete ou palito de 
dente. 
Encher totalmente a cápsula com a resina ou a forminha de 
plástico (até ficar abaulado) e colocar um pedaço de 
plástico transparente na superfície; este procedimento 
HISTORES 6 
serve para que a polimerização ocorra de maneira homogênea 
em todo bloco, pois se a superfície ficar em contacto com 
o ar demora mais a se polimerizar. 
Deixar polimerizar na estufa a 37 a 45° (a estufa de 
Junqueira é a 40°), por 24 horas, no mínimo. Após as 
primeiras 6 a 8 horas, retirar o plástico da superfície 
para que a polimerização se complete. 
Depois de polimerizar, retirar a cápsula de gelatina em 
que o bloco está envolto, mergulhando-a em água morna, 
quase quente; esfregar o bloco com os dedos até que este 
não esteja mais escorregadio; secar com papel absorvente. 
Em seguida, colocar na estufa para secar; é interessante 
colocar sílica na estufa, para absorver a umidade. Se a 
inclusão for feita com forminhas de plástico, soltar os 
blocos como se retira o gelo da forma. 
 
4. MICROTOMIA EM HISTORESINA 
Como regra geral, deve-se cortar um mesmo material em 
várias espessuras (1 mm, 2 ou 3 mm e 5 mm) e pescá-los na 
mesma lâmina. 
O método para a microtomia varia de acordo com a inclusão 
do material que pode ter sido feita em cápsulas de 
gelatina (formato de cápsulas de remédio) ou em forminhas 
retangulares plásticas. 
No caso de inclusão em cápsulas, a microtomia pode ser 
feita tanto no piramitomo do Laboratório de Microscopia 
Eletrônica, quanto no micrótomo do Laboratório de 
HISTORES 7 
Microscopia Óptica (LEIKA). Se for cortar no piramitomo as 
facas de vidro devem ser aquelas feitas no Knife-maker da 
Microscopia eletrônica (são mais finas); se for cortar no 
micrótomo deve-se usar facas de vidro mais grossas, feitas 
no Knife-maker da Microscopia Óptica. 
No caso de inclusão em forminhas plásticas, a microtomia 
deve ser feita sempre no micrótomo Leica ou no micrótomo 
de parafina, para o qual foi feito um adaptador para facas 
de vidro. As facas devem ser aquelas grossas, feitas no 
Knife-maker da Microscopia Óptica. Caso necessário, saiba 
que existe um Knife-maker Dupond do Laboratório de 
Microscopia Eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, que 
também faz facas grossas. 
Os blocos provenientes de inclusão em forminhas de 
plástico devem ser colados em cubinhos de madeira (2x2x2 
cm), através de araldite. 
 
4.1. Microtomia para blocos feitos em cápsulas 
A microtomia deve ser feita no piramitomo ou no micrótomo 
Leica, de acordo com as instruções de uso destes 
aparelhos. 
 
4.2. Microtomia para blocos incluídos em forminhas 
plásticas 
As facas de vidro utilizadas no micrótomo de parafina 
devem ser feitas no knife-maker Leica da Microscopia 
Óptica ou no Dupond do Laboratório de Microscopia 
HISTORES 8 
Eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, pois são mais 
resistentes, por serem feitas em vidro mais grosso que 
aquelas feitas no knife-maker LKB da microscopia 
eletrônica. Porém, em último caso, pode-se usar as facas 
de vidro feitas neste, adaptadas ao micrótomo de parafina. 
4.2.1. Microtomia no micrótomo de parafina: 
Acopla-se o adaptador para facas de vidro ao micrótomo, 
deixando-o bem firme na posição desejada, apertando-se o 
parafuso A com a chave em forma de L. 
Desaparafusa-se o botão B, que solta o carro C. Neste, há 
uma fenda na ponta onde coloca-se a faca de vidro. Traz-se 
o carro C totalmente para a direita para facilitar a 
colocação da faca. Prende-se novamente o carro C, 
aparafusando o botão B de forma que o carro C fique 
imóvel. 
Desaparafusa-se o botão D que dá uma mobilidade 
independente à fenda. Coloca-se a faca de forma que o lado 
que não é de corte fique rente ao lado inferior da fenda, 
e o lado maior fique sobre a base larga da fenda. Aperta-
se bem o botão D, e assim, a faca e a fenda estão fixas. 
Solta-se novamente o botão B, leva-se o carro C para a 
esquerda de forma a acertar a posição da faca na frente do 
bloco. Acerta-se o ângulo desejado observando a escala de 
papel E no corpo do adaptador; o ângulo melhor é 7°. 
Aperta-se novamente o botão D, determinando-se a micragem 
desejada e pode-se iniciar a microtomia. 
 
HISTORES 9 
4.2.2. Microtomia no micrótomo Leica: 
Ligar o estabilizador de voltagem. 
Ligar o aparelho. 
Apertar o botão TRIM e ajustar a micragem desejada para 
trimar o bloco. 
Colocar o bloco no suporte. 
Ajustar a sua posição com a ajuda dos botões laterais após 
destravá-los, girando a trava em forma de L que fica em 
cima à esquerda. 
Colocar a faca e travá-la com a avalanca da direita no 
próprio suporte de faca. 
Verificar se o carrinho da faca está travado (botão na 
frente do aparelho). 
Regular a micragem desejada para o corte (botão preto à 
direita do aparelho em cima). 
Programar o curso do canhão (1, 2 ou 3). 
Proceder à trimagem. 
Desligar o botão TRIM e começar a cortar com a micragem 
estabelecida. 
OBS: Tanto para começar ou parar de trimar ou cortar deve-
se apertar o botão RUN/STOP. 
CUIDADO: o aparelho possui um sistema automática de trava 
(botào vermelho à esquerda) que serve para parar todas as 
suas funções em caso de emergência. Para que isto ocorra 
deve-se apenas empurrá-lo para dentro. Nada mais vai 
funcionar até que este botão seja novamente puxado para 
frente com um leve giro para à direita. 
HISTORES 10 
 
HISTORES 11 
5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES 
Tanto para materiais incluídos em cápsulas quanto para 
aqueles incluídos em formas plásticas, os cortes obtidos 
devem ser esticados em água limpa à temperatura ambiente. 
Para cortes difíceis de esticar, molhar a ponta de um 
pincel em clorofórmio puro e encostá-lo bem perto do corte 
na água. 
Pesca-se em lâminas limpas. Não é necessário nada para 
grudar os cortes nas lâminas. Se quando o corte está 
flutuando perceber que há bolhas de ar embaixo, prender a 
ponta do corte (segurando com uma pinça pela resina) e, 
passar um estiletedebaixo do corte para que as bolhas 
saiam; fazer isto com o corte flutuando sobre a água o 
tempo todo. 
As lâminas podem ser secas em estufa à temperatura de 
cerca de 37°C, caso não haja especificação em contrário. 
 
 
6. COLORAÇÃO 
 
6.1. AZUL DE TOLUIDINA - FUCSINA BÁSICA 
 
Solução corante de Azul de toluidina 0,1% em solução 
aquosa 
 
Preparo da solução: 
0,3 g de Toluidina 
HISTORES 12 
300 ml de água destilada 
 
Filtrar no dia seguinte. Deixar o frasco imóvel, à 
temperatura ambiente. 
Pode-se usar o azul de toluidina usado para corar os 
cortes grossos da microscopia eletrônica, porém o 
Junqueira não recomenda. 
 
Solução corante de fucsina básica: solução aquosa de 
fucsina básica (pararosaniline ou fucsina diamante) a 0,1 
ou 0,2%. 
 
Preparo da solução: 
0,1 ou 0,2 g de fucsina básica (pararosaniline da Sigma ou 
fucsina diamante) 
100 ml de água destilada 
Filtrar. 
 
Procedimento para coloração: 
 
Colocar a solução de azul de toluidina sobre as lâminas 
utilizando-se uma pipeta Pasteur comum e deixar corando 
por 1 a 4 minutos (conforme o material: por exemplo, 
órgãos como o baço, o fígado e pâncres, devem corar por 
cerca de 1,5 minutos, enquanto que órgãos cujas células 
tem pouco RNA devem ficar corando por mais tempo). O 
frasco com o corante, depois de filtrado, deve ser mantido 
HISTORES 13 
imóvel (nunca tirá-lo do lugar, nem levantá-lo, nem 
sacudí-lo). Além disso, deve-se tomar o cuidado de retirar 
a solução sempre do meio do frasco: não enfiar a pipeta 
até o fundo do frasco e nem retirar o corante da 
superfície. 
Lavar jogando água destilada sobre os cortes com uma 
pisseta. 
Colocar uma gota de água destilada e deixar sobre o corte 
por 30 segundos. Escorrer. 
Cobrir os cortes com a solução de fucsina, por 6 a 30 
segundos. A fucsina diferencia ligeiramente o azul de 
toluidina; assim sendo deve-se colocar a fucsina sobre o 
corte e ficar observando; quando começar a sair uma nuvem 
azulada retirar imediatamente a fucsina. 
Lavar jogando água destilada sobre os cortes com uma 
pisseta. 
Colocar uma gota de água destilada e deixar sobre o corte 
por 30 segundos. Escorrer. A fucsina deve ser bem lavada 
para não formar uma semi-lua de corante em volta do corte. 
Depois de lavar, cobrir os cortes com uma solução aquosa 
de molibdato de sódio a 0,1%, por 30 segundos; escorrer 
bem, agitando bem ao ar, para que não fique depósito. 
Secar, com um papel de filtro, ao redor do corte. 
Colocar na estufa a 37°,para secar. 
Montar. 
 
Resultado: 
HISTORES 14 
Coram-se em azul as substâncias ácidas, como ácidos 
nucléicos e alguns grânulos de secreção; coram-se em 
fucsia as mitocôndrias e outros grânulos de secreção. 
 
HISTORES 15 
Observação: 
a) Pode-se corar somente com o azul de toluidina, pulando-
se a coloração pela fucsina. Se não for corar pela fucsina 
deve-se deixar no azul de toluidina por somente 1 a 2 
minutos, para não corar demasiadamente. 
b) É importante passar pelo molibdato; caso contrário, o 
azul de toluidina descora com o tempo. 
 
 
7. USO DO KNIFE-MAKER LEICA 
 
Este Knife maker deve ser usado para fazer facas de vidro 
grossas para microtomia de blocos de historesina que foram 
incluídos tanto em forminhas retangulares plásticas como 
em cápsulas de gelatina e que serão cortados no micrótomo 
Leica ou no micrótomo de parafina antigo usado com 
adaptador. 
Manipular os vidros pegando sempre nas superfícies, nunca 
dos lados. 
Lavar as barras de vidro com detergente fraco em água em 
água fria e secar com lenço de papel. 
Cortar as barras em retângulos sucessivamente menores 
(sempre nas metades) até obter quadrados. Para isto 
colocar o botão 1 na posição "barras". Levantar a alavanca 
3; colocar a barra de forma a encostá-la no pino à 
esquerda e encaixá-la no suporte preto; observe que o 
risco do fabricante deve ficar para baixo. Abaixar a 
HISTORES 16 
alavanca 3 com um pouco de pressão; puxar o riscador 2 e 
girar a alavanca 4, segurando-a com um pouco depressão até 
que o vidro se quebre. Como o vidro vai ficando cada vez 
menor e deve ser cortado sempre na metade usar os outros 
dois pinos guias para apoiar o vidro. 
Os quadrados devem agora ser cortados em triângulos, que 
serão as facas propriamente ditas. Para isto, deve-se 
mudar o botão 1 para a posição "losango com uma barra 
atravessando-o de um lado para o outro totalmente"; 
levanta-se a alavanca 3; coloca-se o quadrado de vidro com 
a parte mais perfeita voltada para o aparelho e não para o 
operador; coloca-se a pinça 6 sob o quadrado de vidro e 
abaixa-se a alavanca 3; traz-se com cuidado o botão 6 para 
a frente até encostar no vidro. Ajuste-se a alavanquinha 5 
de modo a somente prender o vidro, sem apertá-lo (este 
procedimento tem por função segurar as facas para que no 
final elas não caiam e quebrem). Abaixe a alavanca 3 com 
leve pressão dos dedos de cima para baixo na parte 
superior (branca); risca-se o vidro, trazendo-se o 
riscador 2 para frente; coloca-se devagar a alavanca 4 
para a direita até que faca começe a quebrar; a partir 
daí, esperar até que a faca se quebre sozinha. 
 
8. USO DO KNIFE-MAKER DUPOND DO ADOLPHO LUTZ 
 
Este knife-maker está no Laboratório de Microscopia 
Eletrônica do Instituto Adolpho Lutz e deve ser usado para 
HISTORES 17 
fazer facas de vidro para microtomia de blocos de 
historesina que foram incluídos em forminhas retangulares 
de plástico. 
 
Manipular os vidros pegando sempre nas superfícies, nunca 
dos lados. 
Lavar com detergente fraco em água fria e secar os 
retângulos de vidro (10x5 cm). 
Cortar os retângulos de vidro em quadrados grandes de 5x5 
cm. 
Cortar os quadrados grandes em retângulos de 2,5 x 5 cm e 
estes, por sua vez, em quadrados de 2,5 x 2,5 cm. 
 
PROCEDIMENTO PARA CORTAR OS VIDROS: 
Passar pincel a superfície do aparelho para eliminar 
esquírolas de vidro. 
Centrar o retângulo grande no aparelho com a parte riscada 
pelo fabricante para baixo. Abaixar a alavanca (1), 
rodando a manivela no sentido do relógio até encostar as 
borrachas laterais no vidro. Nesta altura a manivela 
endurece. A partir daí girar a manivela mais uma volta e 
meia, para prender bem o vidro. 
Trazer o controle (2) para fora. 
Puxar o riscador de vidro (3) para fora, apertar o botão 
desse riscador e impulsionar de maneira contínua e 
ininterrupta o riscador para dentro. Esta etapa é crítica; 
se o botão for apertado demais o risco será fundo e 
HISTORES 18 
irregular e não se obtém facas boa; se apertar pouco, o 
vidro não risca. A intensidade do aperto do botão depende, 
pois, da experiência. Colocar a tampa de plástico (medida 
de segurança). 
Rodar o apertador de vidro (4) sempre em sentido horário, 
gradualmente, por etapas até quebrar o vidro. Este 
processo deverá ser lento. Após cortar o retângulo, virar 
a manivela (1) em sentido anti-horário, e retirar o vidro. 
Nunca girar o apertador de vidro (4) em sentido anti-
horário (ele volta à posição inicial sozinho). 
Seguir sempre o mesmo procedimento de cortar o vidro até 
obter quadrados de 2,5 x 2,5 cm. 
 
OBTENÇÃO DAS FACAS DEFINITIVAS: 
Colocar os quadrados de 2,5 x 2,5 com o canto mais regular 
e mais perpendicular olhando para o aparelho. A borda 
irregular do vidro deve ser colocada para cima, isto é, ao 
contrário do que foi feito até agora. 
Centrar o quadrado na sua posição correta empurrando para 
a frente o centrador preto. Com o centrador preto 
pressionando a faca, prender o quadrado, girando a 
manivela(1) como descrito anteriormente. 
Apertar o controle (2) para dentro do aparelho, trazer o 
riscador (3) para fora, apertar o botão e riscar o vidro, 
colocar a tampa de plástico e girar o apertador (4) 
lentamente até quebrar o vidro. 
PROCE-ME 1 
 
 
 
VI. PROCESSAMENTO DE MATERIAL 
 PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA 
DE TRANSMISSÃO 
 
 
 
 
PROCE-ME 2 
ÍNDICE 
1. FIXAÇÃO 
 1.1. Glutaraldeído 
 1.2. Tetróxido de Ósmio 
 1.3. Acetato de Uranila 
 1.4. Rotina de Fixação 
2. DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO 
 2.1. Em araldite 6005 
 2.2. Em Resapol 
 2.3. Em Medcast 
 2.4. Em Araldite CY-205 
3. MICROTOMIA 
 3.1. Uso do piramitomo para desbastar o bloco 
 3.2. Uso do ultramicrótomo para desbastar o bloco 
 3.3. Obtenção dos cortes finos 
 3.4. Coloração dos cortes finos 
 3.5. Obtenção de cortes ultra-finos 
 3.6. Coloração de cortes ultra-finos 
4. CARBONIZAÇÃO 
5. PREPARAÇÃO DE TELAS 
 5.1. Lavagem de telas 
 5.2. Cobertura da tela com parlódio 
6. MÉTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS 
BACTERIANOS EM PREPARADO TOTAL 
 
 
PROCE-ME 3 
1. FIXAÇÃO: 
 
Os fixadores usados rotineiramente são: glutaraldeído, 
ósmio e uranila. O glutaraldeído fixa as proteínas, o 
tetróxido de ósmio fixa principalmente lipídeos, enquanto 
que o acetato de uranila reduz a extração de ácidos 
nucléicos, fosfolipídeos, proteínas. 
 
1.1. GLUTARALDEÍDO 2,0 % EM TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO E 
 POTÁSSIO 0,15M, pH 7,2 
 
1.1.1. PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 
 
Solução A: solução 1M de KH2PO4 (PM = 136,09): 
13,6 g/100 ml de água destilada 
34,0 g/250 ml de água destilada 
 
Solução B: 
solução 1M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) 
17,8 g/100 ml de água destilada 
44,5 g/250 ml de água destilada 
ou 
solução 1M de Na24PO4.7H2O (PM = 267,98) 
26,8 g/100 ml de água destilada 
67,0 g/250 ml de água destilada 
ou 
solução 1M de Na2HPO4.12H2O (PM = 357,98) 
35,8 g/100 ml de água destilada 
89,5 g/250 ml de água destilada 
 
Guardar as soluções A e B no congelador. 
PROCE-ME 4 
Na hora de usar, descongelar as soluções estoques e 
misturá-las de acordo com a tabela abaixo para fazer 
solução tampão sódio-potássio 0,15M; pH = 7,0 a 7,2 
 
Solução A Solução B Completar com H2O para 
28,5 ml 71,5 ml 660 ml 
14,25 ml 35.75 ml 330 ml 
04,75 ml 11,91 ml 110 ml 
 
Medir o pH do tampão e corrigí-lo, se necessário. 
Congelar de novo as soluções estoques. 
 
1.1.2. PREPARO DO GLUTARALDEÍDO: 
 
Existem várias embalagens de glutaraldeído: frascos 
grandes de 250 ml e ampolas de 10, 25 e 70 ml com 
glutaraldeído. Nestas embalagens o glutaraldeído pode 
estar em diferentes porcentagens: 10, 25, 50 ou 70%. 
No caso de ampolas, deve-se lavá-las bem com EXTRAN e 
enxaguar abundantemente; deixar secar. 
Colocar luvas e quebrar a ampola envolvendo-a em uma gaze 
limpa, para não deixar a gordura da mão no vidro. Evitar 
qualquer contato manual. Deve ser feito em capela, pois é 
tóxico. 
No caso de frascos com grande quantidade de líquido, deve-
se retirar a quantidade de glutaraldeído desejada com um 
pipeta muito bem lavada (com Extran ou solução 
sulfocrômica), muito bem enxaguada e seca. 
 
PROCE-ME 5 
1.1.3. PREPARO DO GLUTARALDEÍDO A 2%: 
 
Colocar o tampão fosfato 0,15M, pH 7,0 a 7,2, em uma 
proveta e por cima despejar o glutaraldeído com um pipeta 
muito limpa, misturar e dividir em vidrinhos. 
Se a ampola de GA for a 70%, misture 10 ml GA em 340 ml de 
tampão; 
Se a ampola de GA for a 50%, misture 10 ml GA em 240 ml de 
tampão; 
Se a ampola de GA for a 25%, misture 10 ml GA em 115 ml de 
tampão. 
Estocar em vários vidrinhos de tamanhos diversos (10 ml, 
20 ml, 40 ml) e deixar rotulado (nome, data, pessoa que 
fez a solução), no congelador. 
Observação: se não for diluir todo o glutaraldeído que 
tinha na ampola, deve-se vedar o frasco muito bem e 
colocar no congelador, rotulado. Porém, uma vez aberta a 
ampola, sempre é melhor diluir todo o seu conteúdo e 
estocar o glutaraldeído já a 2%. 
 
PROCE-ME 6 
1.1.4. FIXAÇÃO DE FRAGMENTOS DE TECIDO POR GLUTARALDEÍDO 
 
 Descongelar os vidrinhos de glutaraldeído, 
imediatamente antes da cirurgia, aquecendo-os apenas com o 
calor da mão. Colocar os fragmentos em vidrinhos contendo 
glutaraldeído a 2% em tampão fosfato 0,15M, pH 7,2, e 
deixar por 2 horas, à temperatura ambiente. 
 Se o material for usado para o estudo das fibras do 
sistema elástico deve-se dissolver 0,1% de ácido tânico na 
solução fixadora de glutaraldeído 2%, na hora de usar, 
para aumentar o contraste. Em todo caso, deve-se sempre 
fixar fragmentos com e sem ácido tânico. 
 O fragmento a ser fixado deve ter um dos lados com 1 
mm de espessura, para permitir a penetração do fixador. 
Aconselha-se a cortar o material na forma de um palito de 
cerca de 3 a 5 mm de comprimento, 1 mm de lagura e 1 mm de 
espessura. 
 Após as duas horas, cada minuto a mais que o material 
ficar no fixador, só contribui para piorar sua qualidade; 
assim sendo é essencial que ele seja submetido à rotina de 
fixação (lavagem, tratamento pelo tetróxido de ósmio, 
seguido de lavagem e colocação no acetato de uranila: ver 
ROTINA DE FIXAÇÃO). 
 Se por acaso, o material for entregue ao Laboratório 
no final da tarde e na impossibilidade de alguém ficar por 
cerca de 1 hora a mais para seguir a rotina até o acetato 
de uranila, então deve-se esperar completar as duas horas 
de fixação, lavar em solução de lavagem por um minuto e 
deixar em solução de lavagem por, no máximo, 40 horas, 
tendo-se o cuidado de retomar o quanto antes a rotina de 
fixação. 
PROCE-ME 7 
1.1.5. FIXAÇAO DE CULTURA DE CÉLULAS 
 
Tratar cada garrafa ou tubo de cultura com 2,0 ml de EDTA 
0,02% em PBS, por tempo suficiente para descolar a 
monocamada. 
Colher a suspensão de células num tubo de ensaio, tipo 
"Ependorff" ou similar, centrifugar a baixa rotação para 
formar um "pellet". A centrifugação deve ser feita por 4 
minutos a ½ ponto da centrífuga CELM, cerca de 200 a 500 
giros por minuto. 
Escoar o sobrenadante. 
Ressuspender, adicionando glutaraldeído 2% em tampão 
fosfato; com delicadeza, deve-se descolar o "pellet" das 
paredes do tubo; deixar no fixador por 5 minutos. 
Centrifugar novamente e seguir as demais etapas da rotina 
de fixação. 
 
 
1.1.7. APROVEITAMENTO PARA ME DE PEÇAS INCLUÍDAS EM 
PARAFINA 
 
Desbastar o bloco, retirando o máximo de parafina. 
Escolher a região que vai ser incluída para microscopia 
eletrônica. 
Com um bisturi, separar a região escolhida do resto do 
bloco. 
Deixar overnight no xilol para dissolver a parafina. 
No dia seguinte, recortar para o tamanho adequado para 
Microscopia eletrônica e hidratá-lo, segundo a bateria a 
seguir: 
 1 banho de álcool 100° por 15 minutos. 
 1 banho de álcool 95° por 15 minutos. 
 1 banho de álcool 70° por 15 minutos. 
Ápos a hidratação, lavar em solução de lavagem. 
Colocar no glutaraldeído a 2% em tampão fosfato. 
Seguir a rotina de fixação, desidratação e inclusão. 
PROCE-ME 8 
 
 
1.2. TETRÓXIDO DE ÓSMIO 
 
Fazer uma solução-mãe de tetróxido de ósmio a 4% (1,0 g de 
ósmio para 25 ml de água deionizada). Para isto: 
Lavar bem a ampola de tetróxido de ósmio, com Extran, 
lavar em água corrente por 3 minutos (ou deixar de molho 
por 4 horas em solução sulfocrômica e lavar por 1 hora em 
água corrente). Passar por água deionizada e deixar secar. 
Colocar 10 ml de água deionizada no frasco onde será feita 
a solução-mãe, colocar a ampola dentro e quebrá-la com 
auxílio de bastão de vidro. Acrescentar 15 ml de água 
deionizada. Não filtrar(deixar a ampola quebrada dentro 
do frasco). 
Colocar na geladeira e só usar no dia seguinte, quando 
deverá estar totalmente dissolvido. 
A solução de tetróxido de ósmio deve ser guardada na 
geladeira na seguinte embalagem: 
Dentro de um vidro coberto com papel alumínio, com tampa 
fechada com fita crepe e coberta com papel alumínio; 
colocar este vidro dentro de uma embalagem hermética. 
Rotular (nome, quantidade, data e quem fez a solução). 
Sempre que usar, marcar quem usou, quantidade e data. 
 
Solução de trabalho de tetróxido de ósmio: 
Na hora de usar, preparar solução de tetróxido de ósmio a 
1%, diluindo a solução-mãe 1:3 em solução de lavagem. 
 
PREPARO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM: 
NaCl.....................6,0 g 
Sacarose................73,0 g 
PROCE-ME 9 
Água destilada......... completar para 1 litro 
GUARDAR NA GELADEIRA 
Verificar se não tem fungo antes de usar a solução de 
lavagem. 
 
 
1.3. ACETATO DE URANILA PARA FIXAÇÃO 
 
Fazer uma solução mãe de acetato de uranila a 3% (3 g de 
acetato de uranila em 100 ml de água deionizada). Não 
filtrar. 
Estocar sempre em vidro com tampa de rosca; não usar tampa 
de vidro para evitar contaminação. 
Guardar na geladeira envolvido por papel alumínio e 
rotulado. 
 
Solução de trabalho de acetato de uranila para fixação: 
Na hora de usar, diluir a solução-mãe para 1%, misturando 
2 ml solução de lavagem e 1 ml de uranila a 3%. 
 
 
1.4. ROTINA DE FIXAÇÃO 
 
Fazer toda a manipulação dentro da capela 
1) Deixar o material na solução fixadora de glutaraldeído 
2% em tampão fosfato sódio-potássio 0,15M, pH 7,2, à 
temperatura ambiente por 2 horas; jogar o fixador em um 
vidro de descarte de glutaraldeído. 
2) Lavar 3 vezes em solução de lavagem: tempo total de 1 
minuto; jogar a solução de lavagem usada no vidro de 
descarte de glutaraldeído. 
PROCE-ME 10 
3) Para cada vidro com material colocar 2 ml de solução de 
tetróxido de ósmio a 1% e deixar 1 hora na geladeira. 
Jogar o descarte em um vidro de ósmio usado. 
4) Lavar três vezes em solução de lavagem, 1 minuto cada 
lavagem, colocando o descarte num vidro de ósmio usado. 
5) Para cada vidro com material colocar 2 ml de solução de 
acetato de uranila a 1% e deixar "overnight" na 
geladeira. 
6) Lavar três vezes em solução lavagem. 
 
 
2. DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO 
 
Este processo deve ser feito em um único dia, não podendo 
ser interrompido em nenhuma etapa. 
A inclusão pode ser feita em diversos tipos e marcas de 
resina e o procedimento para a desidratação varia de 
acordo com a resina. 
As resinas ficam estocadas na geladeira juntamente com o 
óxido de propileno e devem ser retiradas da geladeira duas 
horas antes do uso. 
Enquanto o material está na estufa em resina pura, colocar 
resina nas forminhas próprias para inclusão, de maneira a 
encher totalmente a barquinha. 
Neste momento, coloque também um pedacinho de papel 
vegetal (ou manteiga) com o número do registro do 
material; escrever com tinta nanquim ou à lápis. 
Deixar à temperatura ambiente. 
Retire os frascos da estufa e, com o auxílio de um palito 
de dente, retire o material e coloque-o nas forminhas na 
posição adequada (de acordo com a orientação desejada). 
PROCE-ME 11 
Após a polimerização (ver o tempo para cada tipo de 
resina), retirar os blocos da forminha como se fossem 
cubos de gelo; se estiverem grudados, deixe de um dia para 
outro à temperatura ambiente. Se os blocos estiverem 
grudando sempre, passe um pouco de silicone na forminha 
antes de colocar a resina. 
Arquive os blocos que não serão cortados imediatamente. 
 
 
PROCE-ME 12 
2.1. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO COM ARALDITE 
6005 
 
2.1.1. Desidratação 
 1 banho de acetona 30°, por 10 minutos 
 1 banho de acetona 70°, por 10 minutos 
 1 banho de acetona 95°, por 10 minutos 
 2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada 
 2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada 
 
2.1.2. Preparação do Araldite 6005 
Quando o material estiver no primeiro banho de óxido de 
propileno, prepare a resina. 
Esta receita dá para a inclusão completa de 4 frascos 
contendo material a ser processado. 
 10 g de Araldite 6005 
 9,0 g de DDSA (plastificador) 
 0,46 ml de BDMA (endurecedor) 
 
2.1.3. Infiltração do Araldite 6005 
Preparar uma solução de resina diluída em óxido de 
propileno, na proporção de 1:2, em quantidade suficiente 
para colocar-se 2 ml desta solução em cada frasco contendo 
material. 
Colocar esta solução nos frascos contendo material e 
deixar durante 30 minutos no girador. 
Após este tempo, retire a solução 1:2 e coloque 2 ml de 
solução de resina diluída em óxido de propileno, na 
proporção de 1:1, em cada frasco. Deixar no girador por 2 
horas. 
Após as duas horas, retirar a solução de resina diluída em 
óxido de propileno e colocar cerca de 2 ml de resina pura, 
PROCE-ME 13 
em cada frasco de material. Deixar 40 minutos na estufa 
58°C. 
Incluir o material(Ver Ítem Desidratação e Inclusão). 
Manter na estufa 58/60°, por 72 horas, antes de cortar. 
 
 
2.2. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM RESAPOL 
 
2.2.1. Desidratação 
 1 banho de acetona 30°, por 10 minutos 
 1 banho de acetona 70°, por 10 minutos 
 1 banho de acetona 95°, por 10 minutos 
 2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada 
 
2.2.2. Preparação do Resapol 
Fazer uma solução que contenha 80% de Resapol 8001 (duro) 
e 20% de Resapol T208 (mole). Adicionar peróxido de 
benzoila anidro, na proporção de 0,5 g para cada 100 ml de 
resina. 
Fazer uma quantidade de Resapol que seja suficiente para 
colocar em cada frasco 5,5 ml de solução até a fase 
overnight e 0,4 ml de resina pura por bloco. 
 
2.2.3. Infiltração e Inclusão em Resapol 
Colocar nos frascos com o material as seguintes soluções, 
nesta ordem: 
Solução de Resina Resapol + acetona (1:3), por 30 minutos 
Solução de Resina Resapol + acetona (1:1), por 30 minutos 
Solução de Resina Resapol + acetona (3:1), por 30 minutos 
Resina Resapol pura, na estufa a 55°, por 12 horas. 
Incluir o material (Ver Ítem Desidratação e Inclusão) 
PROCE-ME 14 
Deixar 3 a 4 dias na estufa 60° para endurecer, antes de 
cortar. 
 
 
PROCE-ME 15 
2.3. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM MEDCAST 
 
2.3.1. Desidratação 
 1 banho de acetona 30°, por 10 minutos 
 1 banho de acetona 70°, por 10 minutos 
 1 banho de acetona 95°, por 10 minutos 
 2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada 
 2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada 
 
2.3.2. Preparação do Medcast 
Misturar nesta ordem: 
Medcast (resina)..........11,9 g (equivalente a 9,8 ml) 
DDSA (plastificador).......2,3 g (equivalente a 2,4 ml) 
NMA (endurecedor).........10,1 g (equivalente a 0,3 ml) 
DMP-30 (acelerador)........0,4 g (equivalente a 0,4 ml) 
 
2.3.3. Infiltração e Inclusão em Medcast 
Colocar nos frascos contendo material uma mistura de óxido 
de propileno e resina Medcast, na proporção de 1:1. 
Deixar por 1 hora, no girador. 
Em seguida, dar 2 banhos de resina Medcast pura, com a 
duração de 30 minutos cada, no vácuo. 
Incluir o material (Ver ítem Desidratação e Inclusão) 
Deixar 3 a 4 dias na estufa a 60°, antes de cortar. 
 
 
2.4. DESIDRATAÇÃO, INFILTRAÇÃO E INCLUSÃO EM ARALDITE CY-
205 
 
2.4.1. Desidratação: 
 1 banho de acetona 30°, por 10 minutos 
 1 banho de acetona 70°, por 10 minutos 
PROCE-ME 16 
 1 banho de acetona 95°, por 10 minutos 
 2 banhos de acetona 100°, de 10 minutos cada 
 2 banhos de óxido de propileno, de 15 minutos cada.2.4.2. Preparação do Araldite CY-205: 
Araldite CY-205...........10 g 
DDSA........................8 g 
DMP30......................0,6 ml 
Dibutil fitalato.........0,035 ml 
Misture na seqüência acima e coloque para homogeinizar na 
batedeira em rotação lenta (em torno de 30 ac.volts),para 
que não se formem bolhas. 
Esta receita é suficiente para a inclusão de seis 
vidrinhos contendo material. 
 
2.4.3. Infiltração e inclusão em Araldite CY-205: 
Colocar o material em uma mistura (1:1) de resina e óxido 
de propileno e deixar no girador por 2 a 3 horas à 
temperatura ambiente. 
A sguir, retirar a mistura anterior dos vidrinhos, colocar 
resina pura e colocar na estufa a 37º, por 1 hora. 
Retirar da estufa e incluir o material nas barquinhas (ver 
ítem Desidratação e Inclusão). 
Deixar na estufa a 60º, por 72 horas. 
 
 
3. MICROTOMIA 
 
3.1. FAZER FACAS DE VIDRO NO KNIFE-MAKER LKB 
 
3.1.1. Corte do retângulo maior: 
PROCE-ME 17 
Lavar os vidros com detergente neutro (nunca segurá-lo 
pelas laterais) e secar com lenço de papel. 
O ângulo do Knife-maker deve estar entre 90 e 100° para 
que sejam obtidas facas de 50 graus, que são as que se 
usam normalmente para microtomia. 
Colocar o vidro inteiro no Knife Maker com o lado 
serrilhado do fabricante para cima, o vidro deve estar 
rente a chapa bege de plástico (A), que determina o 
ângulo, e a extremidade direita da faca deve estar na 
mesma direção do pontinho (B) no próprio Knife Maker à 
direita do suporte do vidro (C). Nesta fase o botão 
seletor (1) acima do riscador deve estar nos risquinhos. 
Baixar a braçadeira de pressão (2) através da alavanca (3) 
fazendo uma leve pressão segurando-a para não dar tranco 
sobre o vidro. 
Puxar o riscador (4), e girar o botão preto (5) para fazer 
pressão até que se possa observar uma "barriguinha" no 
interior do vidro; esperar; cortar e separar o retângulo 
em dois menores. 
 
3.1.2. Obtenção dos losangos 
Colocar um dos retângulos menores de vidro rente a chapa 
(A); conforme descrito anteriormente, sendo que a 
extremidade esquerda do vidro deve estar encostada no 
primeiro pininho de metal à esquerda do riscador (4) e 
seguir normalmente como descrito anteriormente até que os 
losangos estejam prontos. 
 
3.1.3. Obtenção das facas 
Os losangos obtidos devem ser colocados no Knife Maker: 
PROCE-ME 18 
a) com o lado serrilhado do fabricante para baixo, e os 2 
pontos observados no vidro do lado que foi cortado devem 
estar para cima, para esquerda e para frente. 
b) o botão seletor (1) acima do riscador, deve estar no 
25. 
c) a escala atrás do vidro deve estar sempre no 2. 
d) Encaixe do losango: 
 prender o botão (6) que está na lateral do aparelho 
 baixar a braçadeira de pressão (2) 
 puxar o riscador (4) 
 girar o botãozinho de escala (35,45,55) (6) até final. 
 fazer pressão com botão preto (5) até que se possa 
observar a formação de "barriguinha" no vidro, o barulho 
que indica que o vidro quebrou deve ser seco e oco. 
 
3.2. DESBASTAR O BLOCO 
 
Primeiramente deve-se desbastar o excesso de resina do 
bloco. 
Para isto pode-se usar o piramitomo ou então, prender o 
bloco no ultramicrótomo e apará-lo com uma gilete. 
 
3.2.1. USO DO PIRAMITOMO PARA DESBASTAR O BLOCO 
Regras Gerais: 
- Travar (LOCKED) 41, cada vez que for mexer nos 
parafusos. 
- Quando começar a aparecer vermelho na janela (33), 
travar e com o 40 voltar tudo até o branco total. 
- Após trimar cada face, recuar o braço pora-bloco; para 
isto, zerar a escala de espussura, travar o braço e voltar 
com o 40. 
 
PROCE-ME 19 
Procedimento: 
No caso do material ser pequeno, e portanto estar sobrando 
muita resina ao seu redor, antes de colocar no piramitomo, 
dar uma debastada com a serra ou lima retirando a resina 
ao redor do material e também da superfície. 
Colocar o bloco no suporte do piramitomo (20) e prender 
bem, apertando os três parafusos. 
Colocar o suporte na peça 22 do piramitomo. 
Colocar a faca de vidro (17) na peça 14 e olhando na lupa, 
acertar o fio da faca no eixo X. 
Aproximar a faca soltando alavanca 13, e empurrando todo o 
suporte (12) colocar a escala em 90° do lado esquerdo do 
aparelho. Dessa maneira expõe-se o material a ser cortado. 
Colocar o 29 na posição indicada pelo diagrama mexendo o 
último parafuso (30). 
Começar a cortar com a manivela 42, acertando a micragem 
desejada no pino da direita (39). 
Aproximar e cortar até chegar na peça. 
Afastar a faca. 
Acertar o cabeçote com desenho da base menor na marca da 
esquerda. 
Para fazer as bases e os lados colocar sempre o suporte no 
60° do lado esquerdo do aparelho. 
Faca a 60°. 
Aproximar e cortar até que entre base maior e menor tenha 
0,3 mm no aumento I (escala na objetiva da esquerda). 
Acertar cabeçote com desenho de um dos lados de pirâmide 
na marca da esquerda. 
Faca a 60°. 
Aproximar e cortar até chegar bem perto da peça. 
Afastar a faca. 
PROCE-ME 20 
Mudar cabeçote para a posição com o desenho do outro lado 
da pirâmide na marca da esquerda. 
Ver esquema no interior da tampa do aparelho (38). 
Aproximar e cortar até chegar bem perto da peça e medir na 
escala, deixando entre um lado e outro 0,6 mm tomando por 
referência a base maior (aumento 1 X). 
Afastar faca, retirar faca, retirar bloco, escovar 
aparelho, desligar luz e cobrir o aparelho com o plástico. 
 
 
3.2.2. USO DO ULTRAMICRÓTOMO PARA DESBASTAR O BLOCO 
Acoplar o bloco no suporte apropriado para blocos do 
ultramicrótomo e, olhando na lupa, aparar a superfície e 
as laterais com uma gilete. 
 
 
3.3. OBTENÇÃO DE CORTES SEMI-FINOS 
 
São cortes de cerca de 1 a 2 mm, também chamados de cortes 
grossos, e podem ser obtidos tanto no ultramicrótomo como 
no piramitomo. 
 
3.3.1. NO PIRAMITOMO 
Coloca-se o bloco de maneira apropriada para cortar-se a 
superfície, calibrar para cortes de 2 mm e cortar. 
Colocar o corte na superfície de água destilada em uma 
cuba; o corte vai esticar. Juntar cerca de 4 a 5 cortes e 
colhê-los mergulhando uma lâmina sob os cortes; arrumá-los 
com o auxílio de um pincel fino. Secar rapidamente a 
lâmina em chapa aquecida ou na estufa. Está pronta para a 
coloração. 
 
PROCE-ME 21 
3.3.2. NO ULTRAMICRÓTOMO 
Acopla-se o bloco no suporte do ultramicrótomo e procede-
se à microtomia, obtendo-se cortes esverdeados (cerca de 2 
mm). Os cortes cairão automaticamente na água da barquinha 
acoplada à própria faca de vidro utilizada no 
ultramicrótomo. 
Com auxílio de uma alça de platina ou de um pelo duro 
(cílio ou cabelo de japonês) na ponta de um palito, colher 
os cortes em uma lâmina. Secar e corar. 
 
 
4. COLORAÇÃO DE CORTES SEMI-FINOS 
 
Solução corante: Azul de Toluidina a 0,25% em solução 
aquosa de borato de sódio a 1% 
Preparo da Solução: 
1 g de Toluidina 
4 g de Borato de Sódio 
4 ml de álcool absoluto 
400 ml de água destilada 
Dissolver 1 g de Azul de toluidina em 4 ml de álcool 
absoluto. 
Dissolver 4 g de borato de sódio em 400 ml de água 
destilada. 
Misturar as 2 soluções e filtrar. 
 
PROCE-ME 22 
Procedimento para coloração: 
À FRIO: Colocar 1 gota sobre os cortes (que deverão estar 
sobre uma lâmina de vidro) e deixar corar por cerca de 1 
minuto. Lavar em água destilada. Secar no papel de filtro. 
À QUENTE: Colocar 1 gota sobre os cortes, aquecer na chapa 
rapidamente até formar um halo metalizado. Lavar em água 
destilada. Secar no papel de filtro. 
Se quiser, pode montar a lâmina com lamínula e resina de 
montagem. 
 
5. OBTENÇÃO DE CORTESULTRAFINOS (ULTRAMICROTOMIA) 
 
Aparar o bloco de modo a conter o local desejado na 
superfície de corte. 
Colocar o bloco no porta-espécime e fixá-lo no braço do 
ultramicrótomo. 
Colocar a faca (de vidro ou de diamante) no suporte. 
Verificar o grau de inclinação na escala ao lado do 
suporte da faca: para facas de vidro deve marcar dois 
traços a partir do zero e para facas de diamante deve-se 
seguir as instruções do fabricante da faca que estão na 
sua embalagem. 
Colocar água destilada na barquinha da faca, acertando a 
quantidade de água até obter uma superfície espelhada em 
função do ângulo de iluminação. Procure obter o máximo de 
superfície espelhada 
PROCE-ME 23 
Para aproximar a faca em relação ao bloco, procure o 
reflexo na superfície do bloco; para isto movimente o 
bloco e desloque a fonte de luz. 
Aproximar a faca lentamente em relação ao bloco, 
utilizando sempre a lupa, até o reflexo na superfície do 
bloco desaparecer. 
Procurar de novo a maior superfície espelhada possível na 
água e cortar. 
Desprezar os primeiros cortes. Os cortes deverão sair em 
tiras, de cor prateada. 
Pescar mais ou menos 4 a 5 cortes com o auxílio de uma 
pinça em uma tela de cobre, coberta pelo Parlódio (Ver 
PREPARO DAS TELAS). 
A faca de diamante só deve ser usada para quem já tem 
prática em usar faca de vidro. 
 
 
6. COLORAÇÃO DOS CORTES ULTRAFINOS 
 
6.1 PRERARO DA SOLUÇÃO DE URANILA 
Uranila................0,4g 
Etanol 70%.............20 ml 
Estocar em geladeira. 
 
6.2. PREPARO DA SOLUÇÃO DE REYNOLDS 
PROCE-ME 24 
Coloque num béquer limpo 500 ml de água destilada e deixe 
ferver até chegar a 250 ml; deixe esfriar um pouco até 
ficar morna. 
Num balão volumétrico contendo 1,76 g de citrato de sódio 
e 1,33 g de nitrato de chumbo, colocar 30 ml de água morna 
e agitar na mão por 30 minutos. Esta solução deverá ficar 
leitosa. Colocar 8 ml de NAOH 1,0N (preparada no momento 
do uso) e a solução ficará transparente. Completar com 
água até 50 ml. Agitar sem fazer bolhas e medir o pH, que 
deve ser cerca de 12 ou 13. Guardar à temperatura 
ambiente; quando começar a ficar turvo jogar fora e fazer 
outro; antes de desprezar, precipitar o chumbo com algumas 
gotas de ácido acético glacial. 
 
PROCE-ME 25 
6.3. PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO 
Atenção: os cortes devem estar secos e tomar cuidado para 
não respirar sobre as telas. 
1) Corar com uranila 2% em etanol 70%. 
Colocar numa placa de Petri parafinada uma gota da solução 
de uranila para cada tela e enfiar a telinha na gota de 
maneira que fique coberta. Deixar 30 minutos no escuro. 
2) Pegar a tela com uma pinça e sobre um béquer ir 
pingando água destilada com uma pinseta, por cerca de 40 
segundos. Isto deve ser feito pingando-se a água sobre a 
pinça de maneira que ela escorra da pinça para a tela. 
3) Deixar secar cerca de 5 minutos numa placa de Petri 
forrada com papel de filtro e tampada. 
4) Corar com citrato de chumbo (solução de Reynolds). 
Para isto, proceder como com a solução de uranila, 
deixando a tela mergulhada em uma gota de Reynolds por 15 
minutos. 
A placa de Petri onde faz-se a coloração pelo chumbo deve 
conter umas 20 pastilhas de NaOH para absorver o CO2. 
5) Como no caso da uranila, lavar as telas sobre um bequer 
durante cerca de 40 segundos. 
Ao final, colocar o bequer na pia e deixar escorrer 
bastante água. 
6) Deixar as telas secarem em placa de Petri tampada por 
30 minutos e carbonizá-las. 
 
 
PROCE-ME 26 
4. CARBONIZAÇÃO 
 
4.1. Uso do carbonizador (ou evaporador) 
1) Apontar os carbonos e alinhar os suportes. Verificar a 
mola que pressiona os eletrodos para que as pontas dos 
carbonos estejam em contato. 
2) Ligar a chave geral na parede 
3) Ligar a água 
4) Colocar a válvula 2 vias para cima 
5) Ligar o marcador de tempo (Voltar o botão até zerar o 
timer) 
6) Ligar a bomba mecânica (na segunda chave da esquerda 
para a direita). Esperar 3 minutos. 
7) Voltar com a válvula 2 vias para a posição preliminar. 
Esperar 5 minutos. 
8) Colocar a válvula 2 vias em vácuo bomba 
9) Ligar a bomba difusora e esperar 2 a 3 minutos 
10) Abrir válvula alto vácuo 
11) Ligar o vacuômetro de vácuo preliminar e esperar 
chegar no final da escala (seta verde) 
12) Ligar o vacuômetro de alto vácuo e esperar marcar 
entre 10-4 e 10-5 na escala de cima (seta verde). Até aqui 
gasta-se cerca de 45 minutos. 
13) Desligar os dois vacuômetros 
14) Colocar o seletor em 2 
15) Ligar a voltagem (Volt) 
PROCE-ME 27 
16) Girar lentamente o variador de voltagem até o nº 32 e 
esperar até a marca do carbono ficar semelhante à da 
sombra. 
17) Desligar o variador de voltagem (girando rapidamente) 
18) Desligar a voltagem 
19) Voltar o seletor para o 0 
20) Fechar a válvula de alto vácuo 
21) Desligar a bomba difusora e esperar 25 minutos 
22) Colocar a válvula 2 vias em preliminar 
23) Desligar a bomba mecânica 
24) Apertar o botão de entrada de ar (rapidamente no 
início e mais lentamente depois) até parar o barulho de 
entrada de ar. 
25) Tirar a campânula, com cuidado para não batê-la nos 
suportes do carbono. 
26) Desligar o marcador de tempo 
27) Desligar a chave geral 
28) Esperar 20 minutos e fechar a torneira da água. 
 
 
PROCE-ME 28 
5. PREPARAÇÃO DAS TELAS: 
 
5.1. LAVAGEM DE TELAS 
As telas utilizadas em microscopia eletrônica podem ser 
novas ou reaproveitadas e devem ser processadas da 
seguinte maneira: 
Tela nova: 
Passar pela acetona 5 minutos e secar em papel de filtro 
em placa de Petri. Deixar na estufa 1O minutos. 
 
Tela reaproveitada: 
Ferver as telas a serem reaproveidas em Extran 2%. 
Colocar no Ultrasom, durante 5 minutos. 
Lavar bem em água corrente. 
Colocar em amoníaco 10% no ultrasom, durante 3 minutos. 
Lavar uma vez em água corrente e duas vezes em água 
destilada. 
Passar em acetona pura, por uma vez. 
Secar em papel filtro na placa de Petri a 60° C, por 10 
minutos. 
 
5.2. COBERTURA DAS TELAS COM PARLÓDIO 
 
Não colocar os dedos no Parlódio para não engordurá-lo; 
pegar com luvas ou pinças. 
PROCE-ME 29 
Num frasco de vidro com tampa colocar: 
Parlódio................................... 1 g 
Acetato de amila anidro (geladeira)........ 5O ml 
Atenção: quebrar as tiras deparlódio sem contacto manual. 
Deixar de um dia para o outro para dissolver. Separar em 
frasquinhos de 5ml e deixar a temperatura ambiente. 
ATENÇÃO: o PARLÓDIO não pode ser jogado na pia. 
No dia de cobrir as telas com a película, se for fazê-lo 
na sala do microscópio eletrônico, desligar o ar 
condicionado da sala (não esquecer de desligar o ME e 
deixar o deumidificador ligado). A umidade relativa do ar 
deverá estar em torno de 50%. 
Na capela da sala do ME, colocar dentro de uma bandeja de 
plástico um pirex com água até a boca (até transbordar). 
Com uma fonte de luz ver se a água está suja e limpá-la 
passando um papel de limpeza de lentes (lens clean paper) 
sobre sua superfície. 
Com uma pipeta Pasteur de ponta boa colocar uma gota de 
parlódio na água (desprezando as primeiras gotas na 
bandeja). Na superfície da água vai se formar uma película 
de parlódio. 
Observe que a tela tem duas faces: uma brilhante e uma 
fôsca. Entortar a tela ligeiramente, com auxílio de uma 
pinça, de modo a fazer uma concavidade do lado brilhante. 
Colocar cerca de dez telas com o lado fosco em contato com 
a película. Cobrí-las com um pedaço de Parafilm e com uma 
pinça mergulhar as bordas do Parafilm de modo que o 
PROCE-ME 30 
parlódio recubra todo o perímetrodo Parafilm. Puxar na 
direção da pessoa, de uma só vez, tirar sem água e sem 
encostar no pirex. Evitar contaminar a água com os dedos. 
Em uma placa de Petri com papel de filtro, colocar o 
Parafilm para baixo, as telas para cima. Deixar secar até 
o dia seguinte, à temperatura ambiente, coberto com tampa. 
Verificar se a película está boa, olhando as telas no ME. 
Se quiser película mais grossa, colocar 2 gotas de 
PARLÓDIO na água do pirex, em vez de uma só. 
 
 
6. MÉTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS 
BACTERIANOS EM PREPARADOS TOTAIS 
 
6.1. SUPORTE: 
- Montar uma câmara úmida, contendo um suporte de papel 
parafilm ou parafina. 
- Utilizar telas de cobre de "300 mesh" previamente 
recobertas com película de formvar-carbono. Recomenda-se 
empregar Bacitracina (0,01ug/ml em água destilada) como 
agente umectante. 
- Empregar pinças e vidraria de boa qualidade, limpas, 
pipetas descatáveis e tubos Ependorff estéreis. 
 
PROCE-ME 31 
6.2. SUSPENSÕES: 
 
6.2.1. Bacteriana 
- Partir de uma suspensão de bactérias padronizadas por 
método imunológico (por exemplo Imuno DotBlot). 
Para o H. influenzae, utilizou-se uma densidade óptica 
(DO) = 0,25 p/ 540nm, após a diluição em PBS 0,1M, pH 7,2. 
 
6.2.2. Antissoro 
- Determina-se anteriormente a concentração ótima para se 
obter melhor título, por método imunológico (Imunno 
DotBlot), para que todos os sítios antigênicos estejam 
saturados pelo soro policlonal. Empregou-se a diluição 
1:100 do anti-25kD (sub-unidade proteica de fímbria 
bacteriana) em PBS 0,1M, pH 7,2. 
 
6.2.3. Proteina A-Au (Sigma): 
Empregou-se a diluição 1:50 do complexo numa solução 
contendo BSA 1,0% em PBS 0,1M de pH 7,2 (nesta diluição o 
Au está em excesso e é capaz de saturar, todos os sítios 
Fc das Imunoglobulinas). 
 
6.2.4. Solução para contrastação 
Solução de sílico-tungstato de sódio (SST) a 1,0% em água 
de pH 6,4 até 7,2. 
 
PROCE-ME 32 
6.3. PROCEDIMENTO 
 
1) Colocar uma gota (40ul) da suspensão bacteriana no 
suporte e sobre ela uma tela (filme voltado para a 
suspensão) durante 30 minutos à temperatura ambiente 
(aproximadamente 25oC); retirar o excesso com papel de 
filtro; 
2) Em seguida, colocar a grade sobre uma gota (10ul) do 
antissoro específico diluido, durante 60 minutos à 
temperatura ambiente (aproximadamente 25oC); retirar o 
excesso com papel filtro; 
3) Colocar imediatamente a grade sobre uma gota (10ul) da 
suspensão de Proteínas A-Au diluida 1:50, durante 20 
minutos à temperatura ambiente (aproximadamente 25oC). 
4) Lavar a preparação com PBS 0,1M de pH 7,2 durante 1 
minuto, empregando-se um jato suave de pipeta Pasteur e 
logo em seguida com um jato suave de água bidestilada ou 
deionizada durante 1 minuto. 
5) Contrastar pelo sílico-tungstato de sódio 1,0% de pH 
7,2. 
Obs: A contrastação é opcional uma vez que esta promove a 
remoção das partículas de ouro. 
6) Recobrir com carvão e observar ao M.E. 
 
GUIA-TP 0 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
X. GUIA DE TRABALHOS PRÁTICOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GUIA-TP 1 
ATIVAÇÃO ESPERMÁTICA, REAÇÃO DO ACROSOMA E 
FECUNDAÇÃO IN VITRO. 
 
 
a) Obtenção e manuseio de gametas in vitro 
 
Superovulação 
 
Injetam-se fêmeas adultas de hamster com 25 u.i. de PMSG 
(Pregnant mare's Serum Gonadotropin) no dia de post-
estro (Orsini, 1961) e com 25 u.i. de HCG (Human 
Chorionic Gonadotrophin) na tarde do 3º dia após a 
descarga de post-estro. As fêmeas são sacrificadas por 
deslocamento cervical entre 12 e 16 horas após a injeção 
de HCG. 
 
Procede-se a uma laparotomia através da linha medio-
ventral, rejeitando as alças intestinais para um lado e 
expondo-se a via genital feminina. Uma vez isolados, os 
ovidutos são postos em uma placa de cultura de tecido 
contendo BMOC - 2 ou BWW (meios de cultura). Com um par 
de pinças de relojoeiro rompe-se a ampola do oviduto 
para que saiam os ovócitos com células do cúmulo. Também 
pode-se lavar o oviduto com o mesmo meio usando uma 
seringa com agulha Nº 30 e de ponta romba. 
Se os óvulos são recém ovulados, coloca-se a agulha na 
extremidade uterina do oviduto, porém se são passadas 24 
horas ou mais após a ovulação faz-se a lavagem desde a 
fímbria. 
 
 
b) Remoção das células foliculares 
 
Prepara-se uma solução de hialuronidase a 0,01% em BMOC-
2 na qual se colocam as massas do cúmulo. Ao cabo de 
GUIA-TP 2 
poucos minutos pode-se observar ao microscópio de 
contraste de fase que os ovócitos se desnudam das 
células foliculares. 
 
Os ovócitos devem ser manipulados com pipetas de vidro 
de 5 cm de comprimento e cujo diâmetro distal não 
ultrapasse 0,2 a 0,3 mm. Pode-se usar a pipeta acionada 
mediante uma chupeta (fig. 2) ou com a boca. 
Com ajuda da pipeta com pouco fluído, os ovócitos ou 
ovos fecundados são colocados em uma lâmina com dois 
fios de parafina-vaselina paralelos. 
Coloca-se a lamínula sobre os fios de parafina, tendo 
cuidado para que a gota não se desloque para um dos 
extremos. Comprimem-se suavemente os fios de parafina-
vaselina, obtendo-se entre lâmina e lamínula uma câmara 
de altura adequada para a observação (recomenda-se uma 
altura de 20 a 40 um). 
 
c) Obtenção dos espermatozóides 
 
Machos adultos de fertilidade comprovada são 
sacrificados por deslocação cervical. Com uma incisão 
médio-ventral expôem-se os testículos e respectivos 
epidídimos. Com um par de tesouras corta-se a porção 
mais caudal do epidídimo, evitando contaminá-lo com 
sangue e logo coloca-se em uma placa de Petri contendo o 
meio de cultura cobrindo-se com azeite mineral. Em 
seguida, juntam-se 0,2 a 0,3 ml de meio de cultura para 
permitir a dispersão dos espermatozóides. Após 5 a 10 
min retiram-se os epidídimos ficando só a suspensão de 
espermatozóides. Calcula-se a concentração com um 
hemocitômetro e ajusta-se para que na solução de 
incubação fique 106 espermatozóides/100 microlitro de 
meio. 
 
d) Capacitação dos espermatozóides 
GUIA-TP 3 
 
Incubam-se 104 espermatozóides/1 ml de soro sanguíneo 
(ver mais adiante) a 370C por 3 ou 4 horas em uma placa 
de cultura. Cobrir com azeite mineral. Ao cabo desse 
tempo pode-se examinar os espermatozóides com o 
microscópio de contraste de fases para avaliar a 
ativação e reação do acrosoma (ver Barros, 1974). 
 
e) Inseminação artificial 
 
Fêmeas induzidas a ovular ou superovular são 
anestesiadas com Avertina, Nembutal ou éter e, através 
de uma incisão médio-ventral, injetam-se nos cornos 
uterinos 0,2 ml de uma suspensão de espermatozóides (2 
epidídimos para 4 cornos uterinos). Em seguida liga-se o 
corno uterino cranialmente da entrada da agulha. Sutura-
se o animal e, aos diferentes tempos desejados, obtém-se 
os ovos fecundados. Para uma maior segurança (não muita) 
convém inseminar umas 12 horas após a injeção de HCG. 
 
f) Preparação do soro sanguíneo 70oC 
 
Deixa-se coagular sangue humano obtido sem 
anticoagulante e depois o submete a centrifugação para a 
obtenção do soro. Aquece-se em banho-maria a 70oC por 1 
hora o soro obtido com a centrifugação. Passa-se este 
soro coagulado por homogenizador e centrifuga-se 
novamente a 15 000 rpm (± 27 000 g) durante 30 minutos. 
Obtém-se um sobrenadante fluído que, depois de ser 
esterilizado por filtração, pode ser envasado em 
alíquotas de 1cc a -40oC. Uma vez descongelado, o soro 
só deve ser usado uma única vez. 
 
g) Fecundação "in vitro" 
 
GUIA-TP 4 
Espermatozóides capacitados (ver ítem d) são utilizados 
para inseminar ovócitos "in vitro". O tempo de incubação 
durante o qual ficarão ambos os gametas depende do 
estágio da fecundação que se deseja,. Ao término da 
incubação observa-se com o microscópio de contrastede 
fase. 
 
REFERÊNCIAS 
 
ORSINI, M.W. (1961) The external vaginal phenomena 
characterizing the stages of the oestrous cycle, 
pregnancy, pseudopregnancy, lactation and the anestrous 
hamster Mesocricetus auratus, Waterhouse. Proc. Anim. 
Car. Panel 11: 193. 
 
BARROS, C. (1974) - Capacitation of mammalian spermatozoa. 
En Physiology and Genetics of Reproduction, part B, 
capítulo 27 (E.M. Coutinho & F. Fuchs, eds). Plenum 
Publ. Corp., New York. 
GUIA-TP 5 
TRANSFERÊNCIAS EMBRIONÁRIAS EM COELHOS 
 
 
1- COLETA DE OVOS 
 
a) Superovulação: As coelhas doadoras superovulam quando 
procede-se à injeção de gonadotrofinas combinadas da 
seguinte maneira: 
 Primeiramente faz-se uma injeção intramuscular ou sub-
cutânea de 150 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum 
Gonadotrophin). Após 66 a 72 horas procede-se à 
inseminação artificial (ou pareamento natural com dois 
machos férteis) e aplica-se uma injeção endovenosa de 50 
UI de HCG. 
 Um outro procedimento que também provoca a 
superovulação é a aplicação de duas injeções diárias 
intramuscular ou sub-cutânea, durante 3 dias, de 0,5mg 
de FSH (Hormônio Folículo Estimulante). No 4º dia 
proceder à inseminação artificial (ou pareamento 
natural) e aplicar uma injeção endovenosa de no mínimo 
1,5mg de LH por quilo de peso do animal. Consegue-se 
assim cerca de 40 a 60 ovulações. 
 
A sobre-estimulação reduz a porcentagem de recuperação 
embrionária pois os estrógenos endógenos influem sobre o 
transporte através do trato genital feminino. Além 
disto, alguns ovos permanecem nos folículos. A 
superovulação também pode ser induzida em fêmeas 
imaturas, por exemplo nos coelhos brancos neo-holandeses 
as 12 semanas de idade e nas fêmeas holandesas listradas 
as 16 semanas de idade. 
 
GUIA-TP 6 
Os animais doadores são sacrificados por deslocamento 
cervical ou por comoção cerebral, golpeando a nuca com 
um pau ou com a mão. Os ovos podem ser recuperados 
(colhidos) entre 40 e 50 horas "post-coitum" (após 
pareamento); extraem-se os ovidutos que são colocados em 
placas de Petri esterilizadas e a seguir lavados com uma 
solução fisiológica estéril e soro homólogo. Também 
podem ser colhidos ovos de coelhos anestesiados, 
insertando uma cânula no orifício infundibular do 
oviduto e injetando-se líquido pelo vértice do corno 
uterino: os embriões devem ser contados e examinados 
(para poder-se distinguir anomalias grosseiras) com a 
ajuda do microscópio estereoscópico binocular. Os 
blastocistos uterinos também podem ser recolhidos in 
vivo. 
 
b) Manipulação dos ovos: Tipos distintos de soluções têm 
sido utilizadas para manipular ovos incluindo a solução 
de Krebs e a soluçõo de Ringer-Dale tamponada com 
fosfato contendo glicose. As pipetas de vidro e todo 
material utilizado para manipular ovos devem estar 
esterilizados e mantidos entre 30 e 37oC, seja em uma 
platina térmica ou em uma incubadora. Os ovos devem ser 
manipulados em uma placa de cultura parcialmente fechada 
e isenta de luz ultravioleta; deve-se também evitar, na 
medida do possível, exposiçõo ao sol ou luz elétrica. 
Para exposições prolongadas, recomenda-se a luz 
vermelha, pois as menores exposições à luz ultravioleta 
podem inibir a segmentação. 
 
c) Seleção dos ovos: As anormalidades estruturais dos ovos 
podem resultar de fatores citológicos, genéticos, do 
meio circundante ou patológicos; os três primeiros são 
aparentemente os responsáveis pela variação no êxito do 
armazenamento dos ovos. As anormalidades dos ovos 
GUIA-TP 7 
incluem: aberrações de tamanho, forma e grau de 
granulação ou pigmentação citoplasmática. 
 
 
2- ARMAZENAMENTO DOS OVOS 
 
a) Meios de armazenamento: A maior parte dos meios de 
armazenamento são compostos de solução salina, soro, 
proteínas e antibióticos. Por curtos períodos, a solução 
fisiológica (0,9% NaCl aquoso) mantém a tonicidade do 
ovo; porém não sendo tampão e não contendo os íons 
orgânicos não apresenta uma ótima pressão coloido-
osmótica. As soluções fisiológicas se utilizam como: 
1. líquidos para lavar o tracto genital, que mantenham a 
tonicidade do vitelo; 
2. tampão que mantém limite de pH fisiológico (entre 7,2 
e 7,6); 
3. meios iônicos aquosos imprescindíveis para o metabo-
lismo celular. Os meios de armazenamento rotineiros 
contém entre 25 e 50% do soro de coelho. Soro de 
outras espécies também têm sido utilizados: os de 
cavalo, cachorro, cobaia, rato e porco são adequados 
para ovos de coelhos, enquanto que o soro do homem, 
ovelha, vaca, cabra e aves contém um fator ovicida. O 
soro congelado, o soro reconstituído depois de 
liofilizado, liquor de blastocistos e a solução de 
gema de ovo citratada, podem substituir o soro 
fresco. O sangue do coelho se obtém por punção 
cardíaca ou da veia marginal da orelha. Assim obtido, 
permite-se coagular à temperatura ambiente (durante 
30 minutos) antes de ser centrifugado por 20 a 3000 
rotações por minuto. O soro é decantado, 
centrifugado, filtrado através de um filtro milipore 
de 0,45 u e, em seguida, a este volume de soro 
adiciona-se igual volume de solução salina 
fisiológica estéril. 
GUIA-TP 8 
 Tudo isto se mantém entre 3 e 4oC. Recomenda-se a 
adição de 7% de gelatina ao meio de armazenamento: 
prepara-se um meio de gelatina a 14% dissolvendo 14 g 
de gelatina em 100 ml de solução fisiológica e 
autoclavando-o imediatamente para evitar crescimento 
bacteriano; a este meio logo se junta solução de 
soro: salina na concentração de 1:1 (quer dizer 
volume a volume). Depois de armazenar em gelatina a 
7% a porcentagem de implantações dos ovos de coelho 
ainda se mantém em 53% até 7 dias, porém 
transcorridos 14 dias vai declinando gradualmente até 
3%. 
A sobrevida dos embriões não é afetada pelo 
armazenamento a baixas temperaturas quando a solução 
contém 7,5 mg de estreptomicina, 4 mg de 
cloromicetina, 6,5 mg de paranomicina e 23,9 mg de 
penicilina por mililitro de meio líquido. Porém, 
concentrações mais altas de antibióticos são tóxicas 
para os ovos. 
 
b) Recipientes para o armazenamento: Os ovos são 
armazenados em tubos de vidro de 4 ml de capacidade com 
um diâmetro interno de 8 mm. A gelatina, a solução 
salina fisiológica e o soro são medidos e transferidos 
aos tubos com seringas estéreis. Mistura-se 
cuidadosamente usando uma pipeta de vidro com chupeta de 
borracha. Tem-se que ter o cuidado de evitar que se 
formem bolhas de ar. Se os tubos são cheios 
completamente até a boca, a evaporação e condensação do 
meio não vai acontecer durante o armazenamento. Em um 
destes tubos podem armazenar-se entre 10 e 100 ovos. 
Também usam-se ampolas de vidro seladas que contenham 
0,3 ml de meio e entre 10 e 15 ovos. 
 
c) Temperatura e duração do armazenamento: A temperatura 
ótima para o armazenamento é 10oC. O choque "a frigori" 
GUIA-TP 9 
reduz a viabilidade embrionária e isto pode ser evitado 
por aclimatação, ou seja, um esfriamento lento. A 
velocidade do esfriamento de 0,01oC por minuto pode ser 
obtida colocando-se os tubos de armazenamento (que 
contém ovos) dentro de um banho de 20oC, que é colocado 
em um esfriador que o mantenha a 10oC constante. 
Os ovos de coelho são armazenados sem que percam sua 
vitalidade por períodos maiores que qualquer outro ovo 
de mamífero. Está claro que os ovos de coelho diferem 
daqueles da maior parte das outras espécies no fato de 
que durante seu transporte ao longo do oviduto são 
recobertos por uma camada de mucina. Ainda que não haja 
nenhuma evidência que demonstre isto, pode ser que esta 
camada de mucina proteja os ovos de coelho durante sua 
manipulação e armazenamento in vitro. Depois de 5 dias 
de armazenamento aparece um acentuado declínio na 
porcentagem de sobrevida dos ovos de coelho, porém é 
possível armazenar-se ovos com este método e com grande 
êxito até14 dias. 
 
3- TÉCNICA DE TRANSFERÊNCIA 
 
Os ovos têm que ser examinados microscópicamente antes 
de serem transferidos a uma receptora apropriada, sã, e 
de fertilidade conhecida. O estadio do ciclo reprodutivo 
do animal receptor deve corresponder ao estadio do 
desenvolvimento do ovo. Por exemplo, se na transferência 
o ovo tem dois dias de idade, o receptor terá que ser 
injetado intravenosamente com 20 U.I de hormônio 
gonadotrófico coriônico (HCG) dois dias antes da 
transferência. 
O receptor deve ser anestesiado e os ovos transferidos 
ao oviduto por meio de uma laparotomia medial ou por 
duas incisões nos flancos. As incisões nos flancos são 
as mais recomendadas porque é mais fácil encontrar-se o 
oviduto e o animal sofre menos trauma. O tecido adiposo 
GUIA-TP 10 
que rodeia a ampola é levado para fora da cavidade 
corporal o que expõe o ovário e o infundíbulo. 
Transfere-se entre 3 e 6 ovos à ampola utilizando uma 
pipeta pasteur cujos bordos tenham sido arredondados 
pelo fogo e que mantenham um diâmetro de 2 mm na ponta. 
O volume do fluido que acompanha o ovo terá que ser o 
mínimo possível. É conveniente evitar a deposição de 
grandes bolhas de ar no oviduto, apesar de que pequenas 
bolhas possam ser utilizadas para marcar a posição do 
ovo na pipeta. Para transferência ao útero usa-se uma 
pipeta cujos bordos não tenham sido arredondados pelo 
fogo. Assim pode-se picar a parede do útero para a 
deposição do ovo em seu lúmen. Para transferir 
blastocistos grandes utiliza-se uma pipeta maior (de 3 
mm de diâmetro na ponta) e torna-se necessária uma 
pequena incisão da parede uterina para passar essa 
pipeta tão grossa; a incisão deve ser fechada com catgut 
após a transferência. Os animais receptores são 
laparotomizados 8 dias "post-coitum" para contagem do nº 
de implantações e, em seguida, sacrifica-se na data que 
tenha sido planejada pelo experimentador, antes do 
nascimento, para contar-se o nº de fetos viáveis. Nas 
fêmeas prenhas em que se desejam, ou que se necessitam 
as crias, pode-se permitir a parição. Para laparotomias 
e cirurgia menores é imprescindível conhecer algumas 
técnicas de anestesias e manter a esterilidade 
cirúrgica. 
 
ANESTESIA 
 
Os estudos sobre coelhos freqüentemente requerem 
procedimentos cirúrgicos para os quais necessitamos de 
uma anestesia adequada. O pentobarbital sódico é 
injetado via intravenosa à razão de 30 mg por Kg/peso. 
Pode ser utilizado apenas o pentobarbital ou sua 
associação com éter. Um simples catéter pode ser 
GUIA-TP 11 
utilizado para injeção intravenosa (quer dizer um tubo 
de polietileno de 30 cm de comprimento unido a uma 
agulha em uma ponta e na outra extremidade uma seringa). 
O barbiturato e/ou o éter podem produzir colapso 
respiratório e/ou convulsões que provocam fraturas nas 
vértebras ou nos membros. Conseqüentemente tanto a 
propiopromazina como o diazepam em combinação com o 
paraldeido são recomendáveis para anestesia geral. Pode-
se usar um tranqüilizante e o nembutal. Paraldeído 1 mg 
por Kg/peso pode ser injetado intramuscularmente ou 
intraperitonealmente. O lugar preferido para a injeção é 
a região cranial da coxa. 
Utilizam-se o reflexo conjuntival e o reflexo do 
beliscão para ver a profundidade da anestesia. Quando a 
conjuntiva do canto medial do olho é tocada com o dedo o 
movimento das pálpebras indica que o animal ainda não 
alcançou o plano cirúrgico de anestesia. Se as almofadas 
plantares dos pés e das mãos forem beliscadas com as 
unhas, um movimento de flexão dos membros indica que o 
coelho não está convenientemente anestesiado. Há 
variações individuais quanto as raças que sào 
responsáveis pelas acentuadas diferenças no que diz 
respeito aos anestésicos. 
 
LAPAROTOMIAS 
 
Os receptores são anestesiados e laparotonizados através 
de uma incisão medial. Cortam-se os músculos sub-
peritoniais ao mesmo tempo expondo os órgãos viscerais, 
os ovários e os ovidutos se localizam afastando os 
órgãos para fora da cavidade. 
 
Deve-se manipular o mesosalpinx e não tocar no oviduto. 
Para fechar a cavidade abdominal deve-se reunir os 
bordos peritoneais e os músculos abdominais e suturar 
GUIA-TP 12 
com catgut cromado (00). Os bordos da pele devem ser 
reunidos com clips metálicos. 
 
 
4- TRANSFERÊNCIA DE OVOS A OUTRAS ESPÉCIES 
 
O ovo de uma espécie pode temporariamente estar 
armazenado no oviduto ou útero de outras espécies e logo 
transferido a um receptor apropriado. Porém os ovos de 
furão dividem-se e desenvolvem-se apenas no oviduto de 
coelho e os ovos de coelho não sobrevivem nem no oviduto 
nem no útero de furão. Os ovos ovinos de dois 
blastômeros vivem pelo menos cinco dias e se desenvolvem 
até o estadio de blastocisto no tracto genital do 
coelho. Esses ovos sobrevivem melhor no coelho do que 
quando armazenados durante três dias in vitro a 7oC. 
Esse "incubador" pelo que tem sido demonstrado é útil 
para transportar ovos ovinos de um continente a outro. 
 
5- CULTIVO DO EMBRIÃO 
 
Existem vários métodos para cultivo de ovos "in vitro" 
que facilitam o desenvolvimento do ovo antes da 
implantação; estes métodos têm sido especialmente 
utilizados para estudar o efeito dos hormônios e dos 
compostos que produzem antifertilidade sobre o ovo. 
Utilizam-se micropipetas acopladas a seringas para 
transplantar ovos à câmara anterior do olho. Os ovos 
intra-oculares mostram desenvolvimento normal até o 
estágio de mórula, porém, se cultivados em uma câmara 
rodeados por filtros de milipore, ou em placas de Petri 
cobertos por azeite mineral, se desenvolvem até o 
estágio de blastocisto. 
 
 
BIBLIOGRAFIA 
GUIA-TP 13 
 
Hafez, E.S.E (ed). Reproduction and breeding techniques 
for laboratory animals. Philadelphia, Lea & Febiger, 
1970. 
 
 
 
GUIA-TP 14 
OBTENÇÃO DA CAMADA MUSCULAR INTERNA DE 
INTESTINO DELGADO DE CACHORRO 
 
 
I. MATERIAL NECESSÁRIO: 
 
01 cachorro vivo anestesiado. 
2 ampolas (0,5 mg cada) de atropina 
Recipiente com 300 ml de água destilada a 37ºC 
Recipiente com 300 ml de salina a 37ºC mais 0,5 mg de 
atropina. 
Éter etílico 
Gelo 
1 seringa de 1 ml com agulha 
1 seringa de 5 ml com agulha 
1 seringa de vidro de 10 ml com agulha 
Material cirúrgico (bisturi, tesoura, pinças dente de 
rato, pinças anatômicas) 
 
II. PROCEDIMENTO: 
 
 Aplicar 1 ml de atropina no animal. Se for por via 
intramuscular deve ser aplicado 15 minutos antes do animal 
ser sacrificado. Se for por via intravenosa deve ser 
aplicado 5 minutos antes do sacrifício. 
 Para sacrificar o animal deve ser aplicado 
aproximadamente 10 ml de éter em seu pulmão. Caso o animal 
não morra deve-se aplicar um pouco mais de éter por via 
intravenosa em sua língua. 
 Assim que o animal tenha morrido, passa-se álcool 70% 
em seu abdomem evidenciando a linha mediana do corpo na 
altura do umbigo. 
 O animal deve ser aberto nessa região com um corte de 
aproximadamente 15 cm de comprimento, até alcançar a 
cavidade abdominal. Nesta encontra-se primeiramente o 
GUIA-TP 15 
epiplon que deve ser afastado ou retirado; a seguir 
encontra-se o intestino delgado de aspecto liso e claro. 
 Com o auxílio de uma tesoura, retirar um pedaço de 
aproximadamente 30 cm de intestino delgado e recortá-lo em 
pedaços de aproximadamente 5 cm de comprimento. Esses 
fragmentos devem ser imediatamente lavados em água a 37ºC. 
 Após a retirada do conteúdo intestinal, o material 
deve ser transferido para um recipiente com salina e 
atropina. Observando o relaxamento total do intestino este 
deve ser virado com o auxílio de uma pinça dente de rato 
de tal modo que tenhamos a luz do intestino (mucosa) 
voltada para o lado externo. Depois deste procedimento 
todos os fragmentos devem ser mantidos sob baixa 
temperatura (gelo). 
 A seguir, deve-se retirar a mucosa juntamente com a 
submucosa.Para isto, deve-se fazer, com uma lâmina de 
aço, um corte firme e pequeno no sentido longitudinal de 
tal maneira alcançar a submucosa (de aspecto branco e 
rígido; abaixo dela encontra-se a camada muscular interna 
que apresenta estriações no sentido transversal em forma 
de anéis). 
 Assim que tenha alcançado a submucosa este corte deve 
ser prolongado no sentido longitudinal com o auxílio de 
duas pinças dente de rato que irão ampliando a separação 
da submucosa produzida pelo corte até obtermos o corte 
completo no sentido longitudinal. 
 A camada interna deve então ser desprendida da sub-
mucosa com o auxílio de uma pinça anatômica. 
 Em seguida, deve-se "revirar" o intestino, com auxílio 
de uma pinça dente de rato, de tal modo que tenhamos a 
serosa do intestino novamente voltada para fora. Então 
junto a porção onde estava inserido o mesentério deve-se 
fazer um pequeno corte no sentido longitudinal (com 
cuidado para cortar somente a camada muscular externa, que 
apresenta estriações no sentido longitudinal, enquanto a 
GUIA-TP 16 
camada interna apresenta estriações no sentido 
transversal. 
 Após esse pequeno corte a camada externa deve ser 
"rasgada" com auxílio de duas pinças e ser desprendida da 
camada interna com auxílio de uma pinça anatômica. 
 A camada interna é obtida em forma de anéis. O 
importante é não deixar nenhum resíduo da camada externa e 
da submucosa, podendo-se, para isto, até perder um pouco 
da camada interna. 
 
 
GUIA-TP 17 
PROCESSAMENTO DE ENCÉFALO DE RATOS: 
CONGELAÇÃO E PARAFINA 
 
 
 
I. SOLUÇÕES 
 
1. Solução Salina Tamponada 
 
- 9 g de cloreto de sódio 
- 100 ml de Tampão Fosfato 0,1 M 
Dissolver e filtrar. 
 
2. Tampão fosfato 0,2M (ph 7,4) 
 
A: Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.H2O) 
 12,5 g para 2 litros de H2O 
 
B: Fosfato de sódio Dibásico (Na2HPO4.7H2O) 
 83 g para 2 litros de H2O 
 
Misturar os dois e filtrar. 
 
3. Corante de Nissl 
 
Tampão I: 
 H2O destilada - 994 ml 
 Ác. acético glacial - 6 ml 
 
Tampão II: 
 Acetato de sódio - 13,6 g 
 H2O destilada - 1000 ml (completar para) 
 
Solução de Cresil Violeta: 
...100 ml de H2O destilada 
 1 g de cresil violeta 
 Aquecer sem deixar ferver. 
 
Corante de Nissl: 
 Tampão I.....................230 ml 
 Tampão II.....................20 ml 
 Solução de Cresil Violeta.....12,5 ml 
 
GUIA-TP 18 
4. Subbing Solution 
 
 250 ml de H2O 
 0,16 g de Sulfato de Potássio e Cromo 
 1,25 g de gelatina 
Misturar à temperatura de 70°C e depois filtrar a solução. 
 
 
5. Solução de Montagem 
 
 200 ml de H2O aquecida 
 0,5 g de gelatina 
 50 ml de álcool absoluto 
 50 ml de Tampão Fosfato 0,1M 
 200 ml de Tampão Fosfato 0,2M 
 
Dissolver a gelatina em 200 ml de água aquecida a 70°C, 
acrescentando 200 ml de Tampão Fosfato 0,2M, 50 ml de 
Tampão Fosfato 0,1M e 50 ml de álcool absoluto. Filtrar. 
 
6. Solução de Sacarose a 30% 
 
 30 g de Sacarose 
 100 ml de Tampão Fosfato 0,1M 
 
Misturar os dois e filtrar. Autoclavar. 
 
II. MÉTODOS 
 
1. Obtenção do encéfalo 
 
Perfundir o animal com Solução Salina e posteriormente com 
Formol a 10% em H2O destilada. A perfusão é feita pela 
aorta, fechando-se a veia cava. Com isso economizam-se as 
soluções de perfusão e tempo, já que, dessa maneira, 
perfunde-se somente a parte de cima do animal. Gasta-se 
nisso, aproximadamente 200 ml de cada uma das duas 
soluções. Essa perfusão é melhor executada com a ajuda de 
uma bomba peristáltica. 
 Após isso feito, retirar o cérebro e mantê-lo por 4 
horas em Formol a 10%. Colocá-lo na solução de sacarose, 
na geladeira, até o momento de ser cortado (no máximo um 
mês, porque funga). 
 
GUIA-TP 19 
2. Cortes por congelamento 
 
Preparação das lâminas 
 
- Lavar as lâminas com sabão de côco 
- Enxaguar com H2O corrente e depois com H2O destilada 
- Deixar em álcool após a lavagem 
- Enxaguar em H2O destilada e secar com um pano limpo 
- Passar as lâminas na “Subbing Solution” 
- Deixar secar por 24 horas 
 
Cortes no micrótomo de congelação 
 
 O cérebro retirado da solução de sacarose é aparado na 
região posterior, de modo a que tenha uma base reta para 
poder ser fixado (com a solução fixadora Tissue Tek ou com 
a própria sacarose congelada) no suporte do micrótomo de 
congelação. Cobre-se o material com gelo seco triturado 
por, aproximadamente, 3 minutos. Esse processo de 
congelação deve ser repetido sempre que necessário. Tira-
se o gelo da parte superior do cérebro e inicia-se a 
microtomia (cortes de 3mm). Os cortes obtidos são 
colocados, com a ajuda de um pincel fino, na solução de 
montagem. Novamente, com a ajuda do pincel, “pescam-se” os 
cortes nas lâminas previamente preparadas. Deixam-se as 
lâminas secando em estufa a 37°C por 24 horas. Corar com 
Cresil Violeta: 
 
Coloração dos cortes por congelamento: 
 
Passar os cortes por: 
- Água destilada - 3 a 5¢ 
- Corante de Nissl - 5¢ 
- Água destilada - lavar o excesso de corante 
- Álcool 75° - 3¢ 
- Ácido Acético + Álcool 95° (1:10) - diferenciar até 
quanto 
 se queira 
- Álcool 95° - 3 a 5¢ 
- Álcool Butílico + Álcool Absoluto (1:1) - 3¢ 
- Álcool Absoluto - 3 a 5¢ 
- Xilol - 5¢ 
- Montar as lâminas 
 
GUIA-TP 20 
3.Inclusão em parafina 
 
Fixação: 
 
- Formol a 10% - 24 h 
 
Desidratação 
 
- H2O corrente - 3 h 
- Álcool 70° - 3 h 
- Álcool 95° - 12 h 
- Álcool Absoluto - 12 h 
- Álcool Absoluto - 12 h 
- Álcool Absoluto + clorofórmio (1:1) - 2 h 
- Benzol (2 h) 
- Benzol (2 h) 
- Benzol (1 h) 
 
Inclusão 
 
- Parafina 58-60°C (1,5 h) 
- Parafina 58-60°C (1,5 h) 
- Parafina 58-60°C (1,5 h) 
- Incluir 
- Cortar 
 
Coloração de cortes em parafina 
 
- Desparafinar e levar até a água 
- 20¢ no corante de Nissl 
- Deixar escorrer (± 2¢) 
- Lavar 3 vezes em água 
- ± 10¢ fora 
- 3 vezes no álcool 70° (diferencia muito o corante. Deve-
se 
 passar rapidamente) 
- 3 vezes no álcool 96° 
- 3 vezes no álcool absoluto 
- ± 10¢ fora 
- ± 10¢ xilol 
- ± 10¢ xilol 
- ± 10¢ xilol 
- Montar 
 
GUIA-TP 21 
INTERAÇÃO COLÁGENO-PROTEOGLIGANAS 
 
 
1. Com cortes de parafina 
 
Usar 14 lâminas: 7 controles e 7 digeridas pela papaína. 
 
Proceder à digestão pela papaína. 
Corar as lâminas pelo Picrossírius durante uma hora. 
Lavar em água corrente. 
Lavar duas vezes com água destilada. 
Deixar as lâminas secarem bem, cobertas, na estufa. 
Raspar os cortes com uma gilete transferindo-os para 
pequenos tubos de ensaio. 
Retirar o corante dos cortes colocando NaOH 0,1N no tubo 
de ensaio. A quantidade de NaOH depende do tamanho dos 
cortes, porém deve-se colocar a mesma quantidade para os 
cortes controles e os digeridos. 
Esperar alguns minutos para que o corante reaja com o 
NaOH. 
Ler a absorbância em espectofotômetro em comprimento de 
onda de 540 nm. 
Se possível, ler alguns cortes controles e alguns 
digeridos com a papaína em citofotômetro ou em um 
analisador de imagens digital. 
 
Para calcular a interação colágeno-proteoglicanas: 
 
Absorbância digerido = 100% (máxima captação do 
Picrossírius pelo colágeno, sem bloqueio pelas 
proteoglicanas). 
Absorbância do controle = X (captação do Picrossírius 
possível, com bloqueio do colágeno pelas proteoglicanas) 
100 - X = % de captação do Picrossírius que foi impedida 
pelas proteoglicanas, portanto este é um índice da 
interação do colágeno com as proteoglicanas.