COLORAÇÃO DE GRAM- relatório

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ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA
AULA 03: TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM
1-TEMA: Coloração de GRAM
2-OBJETIVOS:
- Realizar a técnica de coloração de Gram.
- Diferenciar bactérias gram positivas de gram negativas.
3-PROCEDIMENTO:
3.1 - Preparo do esfregaço
Colher uma pequena amostra de material bacteriano (cultura em placa, iogurte, mucosa da boca).
Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.
3.2 - Aplicação do corante primário
Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso de corante ou enxaguar a lâmina com água.
3.3 - Aplicação do fixador
Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso do fixador ou enxaguar a lâmina com água. 
3.4 - Descoloração
Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este procedimento não pode exceder a cinco segundos, pois o descolorizador poderá remover o corante cristal violeta das células Gram-positivas. Em seguida, enxaguar a lâmina com água para remover excesso de solvente.
3.5 - Aplicação do corante secundário
Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica; deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.
3.6 - Microscopia
Examinar a amostra ao microscópio óptico. Na aplicação da técnica de coloração de Gram de organismos desconhecidos, pode-se utilizar como controles uma bactéria Gram-positiva e uma Gram-negativa, conhecidas, preparando-se lâminas com três esfregaços, sendo o esfregaço central o da bactéria desconhecida. Desta forma, as bactérias controles indicarão se a técnica foi ou não bem sucedida. 
1) Complete a tabela a seguir:
	
	Morfologia
	Arranjo
	Gram
	Iogurte
	Bacilos
	Bacilo
	Positivo
	Cultura em placa
	Bacilos
	Estreptobacilos
	Negativo
	Mucosa bucal
	Bacilos
	Diplobacilo
	Positivo
2) Observe duas das lâminas preparadas com coloração de Gram ao microscópio óptico, na objetiva de 100x com óleo de imersão e registre o observado.
3) Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixação do esfregaço, as bactérias G+ passam a se comportar como G-. Por que isso ocorre?
Isto ocorre pois a alta temperatura acaba alterando a estrutura da parede celular das bactérias, fazendo que com o corante Cristal Violeta e o lugol não se fixem de maneira satisfatória.
4) Em geral, os corantes não penetram nas células vivas. Qual a relação entre esta informação e as etapas que você seguiu para realizar a coloração de Gram?
Os corantes combinam-se quimicamente com protoplasma bacteriano; se a célula ainda não estiver morta, o próprio processo de coloração irá destruí-la. Por conseguinte, trata-se de um processo drástico, possível de produzir artefatos.
5) Quem idealizou o método de Gram? Qual a primeira bactéria a ser visualizada com esta técnica?
Foi inicialmente descoberta pelo médico dinamarquês Hans Chistian Joachim Gram (1853 - 1958) em 1884 buscando melhorias na visualização microscópica de amostras infectadas.
6) Qual a função da coloração de Gram?
Consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
7) Pesquise sobre a coloração negativa para cápsulas bacterianas e coloração para endósporos (indique função e corantes usados).
Coloração Negativa para Cápsulas: Alguns microorganismos possuem um revestimento gelatinoso denominado cápsula que se pode determinar a virulência do organismo.Esta coloração é mais difícil, pois a materiais capsulares são solúveis em água, que podem ser desalojados ou removidos durante a lavagem. Assim, pode-se fazer uma solução coloidal fina de partículas coradas (tinta nanquim ou nigrosina) para fornecer um fundo escuro e depois corar por coloração simples, por safranina, por exemplo. Devido a composição química, a cápsula nega a maioria dos corantes biológicos, como a safranina, e o uso do nanquim faz uma coloração negativa, evidenciando o contraste entre o fundo, circundante, e a cápsula.
Coloração para Endósporos: Em condições ambientais adversas, forma-se dentro da célula, uma estrutura resistente, dormente, o Endósporo (Esporo). Os esporos não podem ser corados por métodos comuns, de forma que é usado a técnica de Schaeffer – Fulton, onde o verde malaquita é aplicada em esfregaço por calor e aquecido por 5mim (aproximadamente), lava-se por 30 segundos e em seguida aplica-se a safranina para corar as partes da célula que não é endósporo.
Ocular: 10
Objetiva: 100
Aumento: 1000
A que grupo (Gram) pertence o micro-organismo visualizado?
A cultura em placa observada é Gram Negativo.
Ocular: 10
Objetiva: 100
Aumento: 1000
A grupo que (Gram) pertence o micro-organismo visualizado?
A cultura presente no Iogurte é de Gram Positivo.