Relatorio - Determinação quantitativa de proteínas

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Instituto Politécnico de Beja
Escola Superior Agrária
Curso técnico superior de Análises Laboratoriais
Determinação quantitativa de proteínas 
Doseamento de proteínas totais 
Ana Filipa Dâmaso Coelho
Maria Leonor Soares Zorro Medinas
Pedro Sebastião Mendes Gomes Tundo
Rute Santos Ribeiro
Tiago Alexandre Guerreiro Costa
Beja
2020
Índice
Objetivo	6
Fundamentação teórica	7
Materiais e Métodos	11
Reagentes	11
Material	11
Procedimentos	12
Resultados experimentais e tratamento e resultados	14
Cálculos	14
Discussão de Resultados	16
Conclusão	17
Bibliografia	18
Índice de figuras
Figura 1- Reação de condensação	7
Figura 2- Comprimentos de onda	9
Figura 3- Esquema do Espetrofotómetro	9
Figura 4- Formação do complexo corado	10
Índice de tabelas
Tabela 1 Resultados experimentais, concentração e absorvância	14
Índice de gráficos
Gráfico 1 Curva de calibração	15
Objetivo
Esta atividade prática tem como objetivo o doseamento de proteínas totais através do Método do Biureto.
Fundamentação teórica
As proteínas são polipéptidos naturais com peso molecular superior a 5000. Estas macromoléculas apresentam grande diversidade nas propriedades físicas, variando entre enzimas solúveis em água e cumprem uma variada gama de funções biológicas. A estrutura e propriedades das proteínas dependem da sequência de aminoácidos nos polipéptidos. As proteínas conjugadas contêm também outros compostos para além dos aminoácidos. A parte que não é constituída por aminoácidos chama-se grupo prostético e a parte proteica é designada apoproteína. As glicoproteínas e os proteoglicanos contêm um hidrato de carbono ligado covalentemente, enquanto as lipoproteínas contêm um lípido como grupo prostético.
Nas moléculas de proteínas os α-aminoácidos estão ligados numa sequência linear. O grupo α-carboxilo de um aminoácido está ligado a um grupo α-amino do aminoácido seguinte através de uma ligação amida especial conhecida por ligação peptídica. A ligação peptídica é formada por uma reação de condensação, que requer absorção de energia (figura 1).
Figura 1- Reação de condensação
Após a condensação, o carácter ácido e básico dos grupos carboxilo e amina que tomam parte na ligação é perdido. A hidrólise da ligação peptídica para a obtenção dos aminoácidos livres é um processo espontâneo, mas é normalmente muito lento em solução neutra.
1.1. Características físico-químicas das proteínas
1.1.1. Solubilidade
A solubilidade das proteínas depende não apenas das propriedades físico-químicas da molécula, mas também do pH, da força iônica, da temperatura, do tipo de solvente utilizado, e da proporção dos grupos polares (hidrofílicos) e dos apolares (hidrofóbicos) na molécula.  Dessa forma, muitas proteínas são solúveis em água ou soluções salinas. Desde que uma proteína possua muitos grupos carregados positiva e negativamente provenientes de cadeias laterais dos aminoácidos, as moléculas irão interagir umas com as outras, com pequenos iões de cargas opostas e com água. Assim, ocorrem interações proteína-proteína e proteína-água. Se a interação proteína-proteína é grande e a interação proteína-água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel. Por outro lado, se a interação proteína-água é alta, a proteína tenderá a ser solúvel. A desnaturação em geral decresce a solubilidade das proteínas.
1.1.2. Tamponamento
Em função do caráter anfótero (ácido-básico) dos aminoácidos constituintes, algumas proteínas têm a capacidade de controlar variações de pH do meio. 
1.1.3. Desnaturação e renaturação
A desnaturação protéica é a perda da funcionalidade biológicas das proteínas em decorrência de uma alteração conformacional, originada pela rutura de algumas ligações de sua estrutura (em nível de estruturas quaternária, terciária e secundária). A desnaturação de uma proteína pode ser reversível ou irreversível. Os fatores que podem ocasionar a desnaturação proteica são variações de temperatura e pH. 
1.1.4. Ponto isoelétrico (pI): 
A carga elétrica total de uma proteína é dada pelo somatório das cargas dos R dos aminoácidos, as quais dependem, por sua vez, dos pkas e do pH do meio. O ponto isoelétrico de uma proteína corresponde ao valor de pH em que a molécula se encontre eletricamente neutra, ou seja, quando o número de cargas positivas for igual ao número de cargas negativas
Espetrofotometria
A espetrofotometria pode ser definida como uma técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria. A base da análise espetrofotométrica é a medição da fração da radiação que é absorvida (absorvância). É uma classificação muito ampla porque a medição da absorção de energia radiante pode ser feita numa gama de comprimentos de onda, muito larga do espetro eletromagnético.
 
Figura 2- Comprimentos de onda
Nesta técnica utiliza-se um espetrofotómetro de Ultravioleta Visível, que serve para medir e comparar a quantidade de luz absorvida por uma solução em análise e uma solução padrão.
Fig.7 Esquema do funcionamento de um espetrofotómetro de Ultravioleta Visível 
Figura 3- Esquema do Espetrofotómetro
1.1. Método do biureto 
O método de biureto é frequentemente utilizado para determinar a concentração de proteínas em materiais biológicos. A reação do biureto é essencialmente um indicador das ligações peptídicas existentes, uma vez que a reação só ocorre quando existem pelo menos três aminoácidos numa cadeia peptídica.
	Estas cadeias peptídicas quando reagem com sulfato de cobre II (CuSO4), na presença de hidróxido de sódio (NaOH), formam um complexo de coloração violeta, cujo espetro apresenta um máximo de absorção de 510 nm. O nome da reação deriva da substância de biureto (CONH2CONHCONH2), que é o composto mais simples capaz de formar o complexo de cor violeta com CuSO4.
Figura 4- Formação do complexo corado
 Das substâncias presentes em sistemas biológicos, as proteínas são, geralmente, as únicas substâncias que dão uma reação positiva neste teste, embora haja várias substâncias que podem interferir na reação.
Recorre-se a este método para determinar a concentração de proteínas porque estas não absorvem significativamente na região visível do espetro, mas o complexo corado formado, na reação das proteínas com o biureto, absorve nesta gama, permitindo efetuar a sua quantificação facilmente.
Materiais e Métodos
Reagentes
· Reagente de biureto
· Desoxicolato de sódio a 10%
· NaOH a 0,2%
· Ureia-Timol
· NaCl 0.9% (soro fisiológico)
Material
· Pipetas 1mL
· Pipetas 2mL
· Tubos de ensaio
· Suporte de tubos
Procedimentos
1º Passo: 
2º Passo:
Resultados experimentais e tratamento e resultados
	Tubos
	Concentração
(mg/L)
	Absorvância
(555nm)
	A
	------
	0,058
	P1
	70000
	0,048
	P2
	52,5
	0,045
	P3
	35
	0,021
	P4
	17,5
	0,010
	Branco
	0
	0,000
Tabela 1 Resultados experimentais, concentração e absorvância
Cálculos
Solução mãe é 7g por 100ml
Cálculo do P2
Cálculo do P3
Cálculo do P4
Gráfico 1 Curva de calibração
Concentração em proteínas da solução de trabalho
Discussão de Resultados
Através dos resultados efetuados, podemos afirmar que houve uma má realização dos padrões feita por nós, nomeadamente no padrão P2 que é o que mais saí da nossa linha de tendência.
Através da curva de calibração criada por nós, podemos calcular, usando a equação da reta, a concentração em proteínas da nossa amostra de fígado que nos deu 84857.14mg/L
Conclusão
O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: plasma sanguíneo, líquido cérebro espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinogénio e tecido animal. Apesar de este ser um método rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método de Biureto não é muito sensível, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias.
Bibliografia
https://wp.ufpel.edu.br/aquitembioquimica/files/2018/06/Resumo-sobre-Propriedades-das-Prote%C3%ADnas.pdf
https://www.google.com/search?q=rea%C3%A7%C3%A3o+glicina+%2B+alanina&client=firefox-b-d&sxsrf=ALeKk002imAOPvHSYT5s32PfZJHMsgh6Jg:1584614015053&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=2ahUKEwiBp-Sbq6boAhUuyYUKHRD-ASMQ_AUoAXoECAwQAw&biw=1505&bih=878#imgrc=KimSHSS79E1pwMhttps://wp.ufpel.edu.br/aquitembioquimica/files/2018/06/Resumo-sobre-Propriedades-das-Prote%C3%ADnas.pdf
https://www.infoescola.com/bioquimica/desnaturacao-e-precipitacao-de-proteinas/
https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/bioquimica-tampao-e-proteinas/59346
http://proteicolando.blogspot.com/2015/11/a-solubilidade-das-proteinas.html
Curva de calibração
70000	52500	35000	17500	0	4.8000000000000001E-2	4.4999999999999998E-2	2.1000000000000001E-2	0.01	0	Concentração em proteinas mg/L
ABS
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