Real Time PCR

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PCR em tempo real
A tecnologia de PCR em Tempo Real é uma evolução do método de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase). Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises.
A técnica de PCR convencional possibilita a síntese de fragmentos de DNA. A DNA polimerase sintetiza uma sequência complementar a partir de um Primer, resultando em uma amplificação do DNA com milhões de cópias, é um método qualitativo. Ocorre em 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão, ou polimerização. Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até atingir milhões de cópias. Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado.
A técnica de PCR em tempo real é um método quantitativo. Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado, utilizada para detecção de agentes infecciosos.
Na qPCR, o resultado é visualizado imediatamente, dispensando a eletroforese. Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR. A amplificação do DNA-alvo é monitorada durante o processo de qPCR. À medida que o DNA é amplificado, o nível de fluorescência cresce proporcionalmente.
O equipamento é capaz de detectar a fluorescência eventualmente produzida pela amostra e assim a técnica permite acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real. Além disso, por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original. A qPCR pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em uma amostra, podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo.
Aplicada para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e bacterianas, em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil ou até mesmo impossível. Este método não depende do isolamento ou crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o agente. É utilizada também no diagnóstico de doenças genéticas, identificando mutações e pré-disposição genética para determinadas doenças, como é o caso da trombose.