RESUMO SEMINARIO TECNOLOGIA GENETICA 6

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RESUMO SEMONÁRIO - NORTHERN BLOT 
Northern Blot é uma técnicas em análise molecular, a qual consiste em medir o nível de 
expressão gênica em um RNA mensageiro específico e o quantificar. Derivada do Sourthern 
Blot (DNA), a qual se difere pela utilização do RNA para análise. Uma variação do 
procedimento conhecida como Northern blot reverso era ocasionalmente usada. 
Procedimento usa o ácido nucléico (que era fixado à membrana) era uma coleção de 
fragmentos de DNA isolados, e a sonda era RNA extraído de um tecido e marcado 
radioativamente. Primeiramente, há duas razões significativas para medir um RNA mensageiro 
é determinar quais tecidos expressam um gene em particular, pois sua possível indicação para 
a função fisiológica da proteína codificada. E também, quais fatores regulam a expressão de 
um gene – sendo eles nutricionais, hormonais ou ambientais 
DIFERENÇAS ENTRE AS TÉCNICAS. 
SOUTHRN – Molécula alvo é o DNA, Preparação da amostra é feita por Digestão enzimática 
de extração do DNA, Separação moleculae e feita na Eletroforese, material de membrana 
usado é Nylon, material da sonda é acido nucléico com seqüência homologa alvo, método de 
detecção em filme raio-x com quimioluminescência, informação etiqueta na sonda por enzima 
radiomarcadora. 
NORTHERN – Molécula alvo é o RNA, Preparação da amostra é feita por isolação da amostra 
do RNA, Separação molecular é feita na Eletroforese, material de membrana usado é Nylon, 
material da sonda é RNA,DNA,ou Oligodeoxnucleotídeo, método de detecção em filme raio-x 
com quimioluminescência, informação etiqueta na sonda por enzima radiomarcadora. 
WESTERN – Molécula alvo é PROTEÍNA, Preparação da amostra é feita por extração da 
proteína, Separação molecular é feita na Eletroforese, material de membrana usado é 
nitrocelulose ou PVDF, material da sonda é anti corpos primários, método de detecção em 
câmera, led,sondas enzimática infra,cod. resfriação, informação etiqueta na sonda por uma 
enzima. 
O PRINCÍPIO BÁSICO DA TÉCNICA DE NORTHEN BLOT 
Separação do RNA por seu tamanho e é detectado em uma membrana de nylon por sonda de 
hibridização que terá a sequência de bases complementar ao RNAm. Deve-se ressaltar que, 
apesar do termo “Northern Blotting” se aplicar rigorosamente para a transferência de um RNA 
por eletroforese em gel a uma membrana, o procedimento total é superficialmente referido por 
esse método, é necessário seguir as oito etapas do processo corretamente. 
 PASSO 1- Extração do RNA total de um tecido a partir do DNA coletado (amostra), logo, para 
ter-se a molécula de fita simples é preciso utilizar agentes caotrópicos – moléculas capazes de 
romper as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas em macromoléculas -, como o 
isotiocianato de guanidínio. Esses agentes desnaturam as proteínas (e RNAses), interrompem 
as células e tornam solúvel o RNA. 
PASSO 2 - Isolamento do RNAm do RNA total, dando maior sensibilidade. Esse isolamento é 
necessário em razão de apenas alguns RNA do total são RNAm (sendo os RNAm que contém 
a sequência do gene-alvo que irá ser expressa, e desse modo ficará mais fácil sua 
visualização). Essa separação ocorre pela adição da cauda poli-A envolvendo uma coluna de 
oligonucleotídeos de timina, que posteriormente possibilitará a ligação da cauda poli-A ao 
RNAm; quando adicionada, inicia-se a síntese nas extremidades 3’ OH livre. Os oligo-T têm 
como função de primers, pois eles irão complementar as sequências da cauda poli-A e 
consequentemente, essas conseguirão ligar-se ao RNAm, possibilitando distingui-lo do RNA 
total. 
PASSO 3- RNA extraído, seja o total ou o RNAm+poli-A selecionado, são separados de acordo 
com o seu tamanho molecular por eletroforese em gel de agarose. Utiliza-se o gel em agarose 
para macromoléculas. Em razão dos grupamentos fosfatos, o DNA quando em meio neutro ou 
básico possui carga negativa. Para o DNA adquirir essa carga, adiciona-se uma solução 
alcalina junto do gel de agarose, e em seguida, ocorre a indução de um campo elétrico com 
dois polos: um negativo e um positivo, dessa forma, a macromolécula migrará para o polo 
positivo. A velocidade de migração e o poder de resolução do gel dependem do tamanho e 
forma da molécula – as maiores migram lentamente, enquanto as menores migram 
rapidamente -. Além disso, é obrigatoriamente implicada a utilização de agentes desnaturantes 
no gel, geralmente emprega-se o formaldeído, já que, esse reage covalentemente com os 
grupos amina de adenina, guanina e citosina, e assim, não ocorre o pareamento entre as 
bases. 
PASSO 4- Borrão (blotting) na membrana de nylon ocorre. As membranas de nylon são 
utilizadas de preferência à de nitrocelulose por serem carregadas positivamente, aumentando a 
capacidade de ligação aos ácidos nucleicos e da sua maior robustez no manuseamento. Esse 
borrão pode ser a vácuo (transferência mais rápida e com maior reprodutibilidade) ou capilar 
(sem o uso de nenhum equipamento especial). Pelo arrasto que as macromoléculas fazem ao 
serem atraídas para o polo positivo, cria-se esse borrão e assim, fornece uma reflexão precisa 
na membrana com os RNAs separados no gel de agarose. Entretanto, como o gel é muito frágil 
para ser sondado diretamente e as sondas de hibridização não penetram diretamente nos géis, 
é necessário imobilizar o RNA. 
PASSO 5- RNA é imobilizado na membrana, seja assando no forno a temperaturas elevadas 
(95°C por minuto) ou por exposição UV leve. Essa imobilização irá resultar na ligação 
covalente do RNA para a membrana, a qual impedirá que o ácido nucleico seja lavado durante 
o processamento. 
PASSO 6- A sonda de hibridização deve ser preparada. A hibridização de um ácido nucleico 
requer que a sonda tenha a complementaridade de sua sequência de RNAm alvo, ocorrendo o 
pareamento das bases com a sonda marcada por radioisótopo ou corante fluorescente. Há 
duas formas principais de hibridização: a por DNA complementar (cDNA) ou por 
oligonucleotídeos anti-sentido. A hibridização por cDNA tem suas vantagens por ser simples 
(necessitando o isolamento de plasmídeos para quantificação do gene específico) e ter seu 
tempo reduzido, por essas razões, é o método mais utilizado no Northern Blot. Entretanto, o 
cDNA está mais propenso a ter discriminação por RNAses. 
PASSO 7- A sonda hibridiza com a membrana de nylon, seguida pela pós-hibridização. Após a 
hibridização na membrana ter sido concluída, ocorre várias lavagens a rigor (feitas com 
solução tampão adstringente) para assegurar que a sonda está ligada especificamente ao 
RNAm alvo e que esteja ligada insignificantemente aos outros RNAm. 
PASSO 8- Detecção da hibridização, observando se houve ou não a identificação do gene-
alvo. Os sinais são então detectados, em maioria por filmes de raios X (por radioatividade ou 
quimiluminescência) e quantificados por densitometria, que é a medição da densidade óptica 
em chapas fotográficas. Essa quantificação é baseada em unidades arbitrárias e mudanças 
relativas entre grupos experimentais e de controle. 
Detecção das sondas ocorre com ou sem radioatividade. 
Com a radioatividade, utiliza-se a sonda marcada com o radioisótopo 32P ou com corantes 
fluorescentes, que ao receberem filmes de raios X, emitem radiação necessária para 
identificação do gene marcado. Sem a radioatividade, utiliza-se a quimiluminescência, que se 
baseia na degradação de substâncias químicas específicas, sendo seus substratos catalisados 
por fosfatase alcalina pela emissão de luz. Essas enzimas podem ser conjugadas a uma sonda 
ou serem marcadas por um ligante - o mais utilizado é a digoxigenina - que será localizada por 
seu anticorpo, ao qual está ligada à fosfatase alcalina. 
 
 
QUAIS SÃO AS VANTAGENS E DESVANTAGENS DA TÉCNICA DE NORTHERN BLOT? 
VANTAGENS – Simples, Alta especificidade, Sequência homologa parcial podem ser usadas 
como sondas hibrizadoras,Consegue detectar o tamanho do RNA pode ser verificado 
facilmente depois da eletroforensee antes de todo processamento, blot pode ser guardado por 
muitos anos. 
DESVANTAGENS – Riscos de degradação do RNAm durante a eletroforese ( quantidade e 
quantificação da expressão gênica são afetados), Exposição a altas doses de radioatividade e 
formoldeido são potencialmente nocivos a saúde de quem estiver manipulando,Sensibilidade 
do northern blot e relativamente baixa se for comparado com outras técnicas, Detecção de 
varias técnicas e difícil. 
QUAIS OS CUIDADOS DE EXECUÇÃO DA TÉCNICA BIOQUIMICAMENTE FALANDO? 
Toda técnica bioquímica é requerido cuidados em sua execução, no Northern Blot há sua 
particularidade, a problemática particular desse método está com o potencial de degradação do 
RNA através das RNAses. Essas enzimas estão distribuídas amplamente nos tecidos e sua 
contaminação ambiental ocorre facilmente nos estágios de análise, principalmente pelos 
dedos. Para evitar essa contaminação, deve-se esterilizar por cozimento adequado os 
materiais metálicos, as vidrarias e soluções a serem utilizados nas etapas, usar luvas novas de 
látex sem talco e inibidores de RNAses, evitando assim, a perda ou a redução do RNA 
coletado.