Edicao_10_Listik_Eduardo

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AS CARACTERÍSTICAS DOS MECANISMOS E SISTEMAS DE 
EDIÇÃO GENÔMICA 
 
LISTIK, Eduardo
1
; CARMO, Ana Carolina Viegas
2
 
eduardo.listik@usp.br 
Centro de Pós-Graduação Oswaldo Cruz; 
1
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade 
de São Paulo (ICB-USP); 
2
Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTE) 
 
 
Resumo: A edição genômica se baseia na aplicação de tecnologias que exploram, 
frequentemente, a função de nucleases programáveis, tal como as nucleases dedo de zinco, as 
meganucleases, as TALE nucleases e a Cas9 presente no sistema CRISPR-Cas9; de modo a 
introduzirem quebras nas fitas duplas de DNA. Os mecanismos de reparo endógeno, tais 
como a união terminal não-homóloga ou o reparo direcionado por homologia, podem 
condicionar a modificações no DNA (mutações, correções, deleções, inserções, knock outs) 
que possuem finalidades terapêuticas em doenças genéticas, ou até mesmo em doenças 
imunes ou neurodegenerativas. 
 
Palavras-chave: Edição genômica, Nucleases programáveis, Engenharia genética. 
 
Abstract: Genomic editing is based on technologies that frequently explore the function of 
programmable nucleases, such as zinc finger nucleases (ZNF), meganucleases, TALE 
nucleases and Cas9, which comprehends the CRISPR-Cas9 system; as a parameter to induce 
double strand breaks (DSBs) into the DNA. Mechanisms of endogenous DNA repair, as non-
homologous end-joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) can prompt DNA 
modifications (mutations, corrections, deletions, insertions, knock outs), which have many 
therapeutic values in genetic diseases, or even immune- or neurodegenerative-associated 
pathologies. 
 
Keywords: Genomic editing, Programmable nucleases, Genetic engineering. 
 
1 OS FUNDAMENTOS DA EDIÇÃO GENÔMICA 
As tecnologias baseadas na edição genômica exploram, frequentemente, a função de 
nucleases programáveis, como nucleases dedo de zinco, meganucleases, as TALE nucleases e 
a Cas9 presente no sistema CRISPR-Cas9 (HOTTA e YAMANAKA, 2015). Tais tecnologias 
possibilitam a edição genômica ao introduzirem quebras na fita dupla de DNA (em inglês, 
double strand breaks, DSBs) em loci específicos. Tais DSBs envolvem diversos mecanismos 
de reparo endógenos como a união terminal não-homóloga (em inglês, non-homologous end-
joining, NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (em inglês, homology-directed repair, 
HDR) (COX et al., 2015). 
 Após a formação da DSB, os mecanismos de reparo por HDR ou por NHEJ podem se 
suceder. O reparo por HDR (Erro! Fonte de referência não encontrada.D, E) parte do 
 
 
 
ponto clivado, mas exige a existência de um modelo para que este reparo seja sucedido 
(SZOSTAK et al., 1983). A HDR pode ser empregada para restaurar a funcionalidade de 
genes mutados pela sua correção, retomando sua expressão e finalidade fisiológica benéfica. 
Neste caso, o emprego de padrões de DNA exógenos que especificam o resultado do reparo 
de DSBs-alvo possibilita este emprego de ferramenta de reparo de forma terapêutica 
(CHOULIKA et al., 1995). 
O reparo em DSBs por NHEJ (Erro! Fonte de referência não encontrada.A–C), por 
outro lado está associado com o religamento direto da quebra. Este procedimento, embora 
apresente certa acurácia, está associado com eventuais mutações, quer por deleções ou 
inserções, os chamados indels (LIEBER et al., 2003). O aspecto mutagênico associado com a 
NHEJ elicita possibilidades de explorar as características desta ferramenta de reparo para a 
indução da mutagênese, knock out ou deleção de determinados genes de interesse. Em 
determinados eventos patológicos, como ocorre na distrofia muscular de Duchenne, a deleção 
de genes pode resultar na expressão de proteínas defectivas. Neste caso, a modificação de tais 
genes pelos indels a partir da NHEJ direcionada pode restaurar a função de tais proteínas 
(OUSTEROUT et al., 2013). Os reparos induzidos pela NHEJ também têm a capacidade 
introduzir códons de parada prematuros em genes de interesse, possibilitando o knock out de 
tais genes (PEREZ et al., 2008; ARONIN e DIFIGLIA, 2014). Ademais, a indução de duas 
DSBs em determinada sessão do DNA pode acarretar na deleção genômica pela NHEJ (XIAO 
et al., 2013). 
Até este ponto averiguaram-se aspectos da correção, mutação, knock out e deleção de 
genes. A inserção de genes é possível mediada quer por HDR ou NHEJ. No caso da HDR, é 
possível o uso de um modelo de DNA que apresente transgenes terapêuticos, os quais podem 
ser inseridos em determinados loci do genoma, denominados de safe harbor, fato que diminui 
os riscos de mutagênese e aumenta a expressão do gene (MOEHLE et al., 2007). Pode-se 
adicionar um transgene por NHEJ induzindo a DSB por nucleases de modo a proporcionar 
uma clivagem compatível para inserção do transgene como um indel (MARESCA et al., 
2013). 
Mecanismos de edição genômica envolvendo NHEJ (A–C) e HDR (D e E). (A) O reparo 
por NHEJ pode condicionar à inserção ou deleção (indels) de sequência em genes, 
condicionando a formação de códons de parada, promovendo o knock out de tais genes. (B) A 
indução de duas DSBs pode promover a deleção de sequências genômicas por NHEJ, de 
modo a reparar proteínas mutadas. (C) Transgenes podem ser inseridos por NHEJ em DSBs a 
partir de doadores que contenham pontos de reconhecimento. (D) A HDR também pode 
condicionar à adição de genes em loci específicos, como os safe harbor loci. A inserção é 
condicionada a partir de um modelo de DNA contendo o gene de interesse. (E) Ademais, a 
HDR permite corrigir sequências com mutações, necessitando de um modelo corretivo de 
DNA para tal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 Mecanismos de Edição Genômica 
A) Mutação/Knock out 
 
 
 
B) Deleção 
 
C) Inserção (Knock in) por NHEJ 
 
 
D) Inserção (Knock in) por HDR 
 
 
 
 
E) Correção 
 
 
 
2 AS NUCLEASES PROGRAMÁVEIS 
 
Os mecanismos de reparo do DNA quer por NHEJ ou HDR consistem em formas 
endógenas de reparo de DSBs. No entanto, tal ferramentário pode ser explorado quando 
determinadas DSBs são intencionalmente e direcionalmente realizadas. As possibilidades 
terapêuticas neste caso são vastas e abordam as inúmeras técnicas tecidas previamente. De 
forma a condicionar DSBs em pontos específicos, tem-se o papel das nucleases programáveis. 
 
2.1 Nucleases dedo de zinco 
 
Os dedos de zinco (em inglês, zinc fingers, ZFs) constituem pequenos domínios proteicos 
em que o zinco contribui para a estabilidade térmica e conformacional da estrutura. ZFs estão 
presentes em inúmeras proteínas que reconhecem sequências de DNA, atuantes como fatores 
de transcrição (KLUG, 2010). Este reconhecimento se faz tanto pela interação entre os 
aminoácidos individuais -1, 3 e 6 presentes no ZF e as bases nitrogenadas do DNA, quanto 
por potenciais ligações de hidrogênio entre o aminoácido 2 do ZF e a fita complementar de 
DNA, numa interação cruzada (em inglês, cross-strand) (PAVLETICH e PABO, 1991; 
ISALAN et al., 1997). 
Dentre a classificação dos ZFs, os da família C2H2 constituem os mais estudados. 
(IUCHI, 2001). Tais ZFs apresentam dois pares de resíduos conservados de cisteínas e 
histidinas que quelam o zinco. Estruturalmente, são compostos por um grampo β, associado a 
uma hélice em α que se desenvolve em uma unidade ββα (KRISHNA et al., 2003). 
As nucleases dedo de zinco (em inglês, zinc finger nucleases, ZFNs) consistem na 
associação de séries de ZFs C2H2 com a endonuclease de restrição FokI, a qual apresenta 
domínios de ligação no DNA (em inglês, DNA binding domains, DBDs) independentes dos 
próprios ZFs (LI et al., 1992). A associação de ZFs com a FokI forma nucleases quiméricas 
com novas propriedades e especificidades de ligação (KIM e CHANDRASEGARAN, 1994). 
Para gerar a DSB, as ZFNs devem atuar como um dímero na dupla fita (Erro! Fonte de 
referência não encontrada.) (SMITH et al., 2000). 
 
 
Figura 1 Funcionamento das nucleases dedo de zinco.As ZFs Cys2His2 são pequenos 
domínios proteicos estabilizados pelo zinco cuja interação direta na fita 3’-5’ (aminoácidos ou 
a.a. -1, 3 e 6 do ZF) ou cruzada com a fita 5’-3’ (a.a. 2 do ZF) permitem o reconhecimento de 
 
 
 
elementos da fita dupla, especialmente em regiões ricas em guanina (em amarelo, verde e azul 
claro). As ZFNs consistem em ZFs associados à FokI, que reconhece a sequência 5’-GGATG-
3’, induzindo à clivagem da fita (região em vermelho). A atuação de dímeros de ZFNs 
condiciona à formação de DSBs. 
 
 
 
2.2 Meganucleases 
 
Meganucleases, também conhecidas como endonucleases teleguiadas (em inglês, homing 
endonucleases, HEs), consistem em endonucleases capazes de reconhecer grandes e 
específicas sequências de DNA, normalmente com mais de 14 pares de bases, e clivar a fita 
formando DSBs em tais loci (SMITH et al., 2006). O uso de HEs tem se baseado na correção 
de determinados genes a partir do reparo por HDR (DONOHO et al., 1998). 
As HEs podem ser divididas em cinco famílias com base em sua sequência e motivos 
estruturais: His-Cys box, GIY-YIG, HNH, PD-(D/E)XK e LAGLIDADG, sendo esta última a 
mais estudada e tendo sido verificada em todos os reinos biológicos. HEs da família 
LAGLIDADG possuem, normalmente, a capacidade de facilitar a corte-junção (splicing) de 
suas próprias regiões intrônicas; ou de agir como endonucleases altamente específicas, 
capazes de clivar a junção exon-exon onde seu intron reside (SILVA et al., 2011). 
Dois grupos de HEs da famílias LAGLIDADG largamente empregados são os de único 
motivo proteico, I-CreI (Figura 3A), ou de duplo motivo proteico, PI-SceI, que apresentam o 
domínio da endonuclease na estrutura αββαββα, a qual promove um centro catalítico 
bipartido. No caso da I-CreI, há a formação de um homodímero composto pelos domínios α/β, 
ao passo que na PI-SceI, uma HE monomérica, dois domínios estão presentes, em que um 
formado por α/β apresenta a função de endonuclease e outro, formado por folhas β, está 
associado com modificações transcricionais (DUAN et al., 1997; HEATH et al., 1997). 
O que se averigua das HEs é a sua capacidade de identificar, com grande especificidade, 
grandes sequências de DNA e promover DSBs. Em HEs sintéticas, busca-se redesenhar tais 
endonucleases, de modo a redefinir as sequências de clivagem, mas de modo que a 
estabilidade e estrutura terciária das proteínas sejam mantidas. O intuito de tal é promover o 
reparo de distintas regiões mutadas do DNA por meio da HDR e proporcionado o aspecto 
terapêutico. 
 
 
 
 Arnould e colaboradores descreveram um método para a obtenção de I-CreI mutantes 
capazes de reconhecer sequências de DNA distintas. Em primeira instância, induzem-se 
mutações nos distintos DBDs de cada domínio da I-CreI, e posteriormente combinam-se as 
regiões mutantes para originar complexos I-CreI homodiméricos mutantes. Pode-se, por fim, 
combinar heterodímeros de modo a criar HEs com especificidades completamente 
modificadas ( 
B). (ARNOULD et al., 2007). 
 
Figura 2 Características estruturais e de reconhecimento de meganucleases (A) e princípios 
da confecção de HEs mutantes (B). (A) A I-CreI é uma HE da família LAGLIDADG, cuja 
estrutura é formada por domínios α/β, permitindo a estrutura em dois DBDs específicos 
(marcados de amarelo e verde). A ação da endonuclease é atingida com a estrutura 
homodimérica da I-CreI, onde a clivagem ocorre na região destacada em vermelho 
(CHEVALIER et al., 2002). (B) Método de síntese de meganucleases mutantes para 
reconhecimento de sequências distintas do DNA. Selecionam-se I-CreI com mutações em 
regiões específicas (A/A’, B/B’, C/C’ e D/D’), e posteriormente realiza-se a combinação para 
formar I-CreI homodiméricas mutantes (AB/B’A’ e CD/D’C’). Por fim, heterodímeros são 
confeccionados por co-expressão (AB/D’C’). 
 
 
 
2.3 TALE Nucleases 
 
TALENs (em inglês, transcription activator-like effector nucleases) consistem em DBDs 
cutomizáveis associadas a uma FokI não-específica. As DBDs, neste caso, consistem em 
repetições altamente conservadas derivadas dos efetores pseudo-ativador de transcrição (em 
inglês, transcription activator-like effectors, TALEs), proteínas secretadas pela Xanthomonas 
(JOUNG e SANDER, 2013). 
A forma com a qual as TALEs efetivam o reconhecimento de sequências do DNA se 
baseia no pareamento de bases com dois resíduos hipervariáveis, normalmente nas posições 
12 ou 13 do domínio (BOCH et al., 2009). Desta forma, sequência de resíduos de asparagina-
isoleucina (NI) reconhece a adenina (A); a de histidina-aspartado (HD) reconhece a cisteína 
 
 
 
(C), e assim por diante (MOSCOU e BOGDANOVE, 2009). Uma timina (T), no entanto, 
sempre precede as repetições. A repetição de asparagina-asparagina (NN) reconhece 
preferencialmente a guanina (G), mas também pode reconhecer A. A repetição de resíduos 
hipervariáveis asparagina-histidina (NH) possui uma afinidade levemente maior pela guanina 
que NN (STREUBEL et al., 2012) (Erro! Fonte de referência não encontrada.). 
Similarmente às ZFNs, TALENs podem ser empregadas para promover edição genômica 
por NHEJ ou HDR. Mutações induzidas por NHEJ foram utilizadas para efetuar o knock out 
de diversos genes, de modo a originar modelos para enfermidades humanas, ou realizar 
deleções e inversos de grandes sequências de DNA em gado (CARLSON et al., 2012). As 
correções de mutações genéticas por HDR também podem ser precidas por DSBs geradas por 
TALENs (HOCKEMEYER et al., 2011). 
 
Figura 3 Esquema de uma TALE nuclease genérica. A proteína que constitui a DBD do 
complexo apresenta sequências repetidas, em que dois resíduos hipervariáveis, normalmente 
nas posições 12 e 13, efetuam o reconhecimento de bases nitrogenadas do DNA (NI – A; NG 
– T; HD – C e NN/NH – G). Uma timina precede a primeira base associada à repetição da 
TALE. A FokI encontra-se em um domínio não-específico para realizar a clivagem e 
introduzir DSBs no DNA. Para que isto ocorra, as TALENs devem atuar como dímeros. 
 
 
 
2.4 Sistema CRISPR-Cas9 
 
O sistema CRISPR (em inglês, clusteres regularly interspaced short palindromic 
repeats)-Cas9 (em inglês, CRISPR-associated 9) consiste num dos sistemas mais simples e 
eficientes de aplicação para edição genômica (HAEUSSLER e CONCORDET, 2016). Neste 
sistema, DSBs podem ser geradas pela associação da Cas9, uma endonuclease, com o 
CRISPR RNA (crRNA) e o crRNA de ativação em trans (em inglês, trans-activating crRNA, 
tracrRNA) (Erro! Fonte de referência não encontrada.A). Jinek e colaboradores 
demonstraram que a Cas9 pode ser programada com a incorporação de um RNA sintético 
como transcrito único, quimérico, o sgRNA (em inglês, single guide RNA), para clivar 
sequências de DNA de interesse. O sgRNA consiste nos crRNA e tracrRNA hibridizados com 
uma ponte GAAA os unindo (JINEK et al., 2012) (Erro! Fonte de referência não 
encontrada.B). 
A Cas9 apresenta dois domínios característicos com função de nuclease: a RuvC e a 
HNH. O domínio da RuvC apresenta três subdomínios (I-III), em que RuvC I encontra-se na 
 
 
 
porção amino-terminal da Cas9, e RuvC II/III circundam o domínio HNH próximo à região 
central da proteína. Quando esta não se encontra associado ao DNA alvo ou ao RNA, a 
endonuclease se autoinibe, com o domínio da RuvC bloqueando o da HNH (JINEK et al., 
2014). Ademais, a Cas9 está atrelada exclusivamente com o locus da CRISPR do tipo II, o 
qual é subdividido em três subtipos (IIA-C). Ao passo que o tipo de locus da CRISPR indica o 
tipo de gene da cas, de arranjos de CRISPR e tracrRNA, o subtipo revela a arquitetura e 
organização de cada locus da CRISPR. Os locus da CRISPR do tipo II normalmente 
apresentam genes da cas9, ca1 e cas2. Os subtipos IIA e B apresentam quatro genes cas, e o 
IIC apenas três (CHYLINSKI et al., 2013). Uma característica marcante do sistema Cas9 é o 
motivo adjacente ao protoespaçador (em inglês,protospacer adjacent motif, PAM), o qual 
flanqueia o terminal 3’ do DNA alvo e consititui o mecanismo de busca da proteína. Embora 
o PAM seja específico para cada ortólogo de Cas9, sua especificidade pode ser modificada 
com domínios flexíveis como 5’-NGG-3’ (HSU et al., 2014; NISHIMASU et al., 2014). 
O sistema CRISPR-Cas9 pode induzir a DSBs a serem reparadas quer por NHEJ ou 
HDR. A aplicação de tal sistema mostra-se promissora, quer para criar novos modelos 
animais para experimentação, quer para novas possibilidades de terapias. Long e 
colaboradores demonstraram que o uso do sistema CRISPR/Cas9 poderia ser utilizado para a 
remoção de um éxon de distrofina incorreto, possibilitando o tratamento da distrofia muscular 
em camundongos (LONG et al., 2016). Averiguam-se ainda as probabilidades de tratamento 
com tal sistema para as doenças de Huntington, associada com a expansão poliQ, e de 
Parkinson, que pode estar associada com o gene da α-sinucleína mutante (YANG et al., 
2016). Tal sistema apresenta diversas vantagens em relação às outras nucleases programáveis. 
A Erro! Fonte de referência não encontrada. compara vantagens e desvantagens entre os 
sistemas de edição genômica discutidos nesta revisão. 
 
Figura 4 Representação do sistema CRISPR-Cas9. (A) O sistema nativo CRISPR do tipo II 
envolve a Cas9, uma endonuclease, e duas pequenas sequências de RNA: crRNA (CRISPR 
RNA) e tracrRNA (trans crRNA) para mediar a clivagem em regiões específicas do DNA e 
promover DSBs. (B) As duas sequências de RNA podem ser unidas em um RNA quimérico 
tracrRNA:crRNA unidos por uma ponte GAAA e formando o sgRNA (single guide RNA), 
que pode ser sintetizado, de forma a permitir o reconhecimento do sistema a partir de uma 
região de 20 nucleotídeos de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 1 Quadro comparativo das nucleases programáveis (ZFNs, meganucleases, TALENs 
e sistema CRISPR-Cas9), expondo vantagens e desvantagens de cada uma. 
 
Nucleases programáveis Vantagens Desvantagens 
ZFNs  As DSBs originadas 
podem ser usadas para 
reparar o genoma por NHEJ 
ou HDR. Podem ser 
aplicadas em células 
somáticas ou células-tronco 
pluripotentes. 
 O desenho é caro e 
trabalhoso e requer o uso de 
regiões ricas em guanina 
(GNN), que ocorrem 
raramente na maioria dos 
alvos desejados 
(BITINAITE et al., 1998). 
Meganucleases  A menor classe de 
nucleases sintéticas, 
podendo facilitar seu 
transporte. Proporciona a 
formação de um gancho na 
fita 3’ propício para o reparo 
por HDR. 
 Difícil de separar os 
domínios de clivagem das 
DBDs. A funcionalidade de 
tais nucleases está mais 
associada com correção de 
genes mutados. 
TALENs  Similar às ZFNs, as DSBs 
originadas podem ser usadas 
para reparar o genoma por 
NHEJ ou HDR, mas o 
domínio da FokI não é 
específico e a DBD é mais 
customizável. 
 Dificuldade de se construir 
plasmídeos que codifiquem 
TALENs, devido ao 
tamanho do complexo. 
CRISPR-Cas9  O sistema é de simples 
confecção e escalonamento, 
além de não ser tão caro. 
Sistemas de reparo pela 
NHEJ e HDR podem ser 
explorados. 
 Pode induzir a mutações e 
rearranjos fora do alvo 
desejado. Levando a 
preocupações quanto a sua 
aplicabilidade terapêutica 
 
 
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
As ferramentas de edição genômica, como as nucleases programáveis, trouxeram grandes 
facilidades e inovações no âmbito da engenharia genética. Busca-se, assim, aprimorar e 
enriquecer o arsenal de modelos de doenças, para que estas sejam melhor compreendidas e 
prevenidas. Por outro lado, a busca por novas formas terapêuticas também é um objetivo e a 
manipulação das ferramentas de edição genômica permite que seja possível grande 
flexibilidade para a busca por novos tratamentos. 
 
 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
 
ARNOULD, S. et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC 
gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. J Mol Biol, v. 371, n. 1, 
p. 49-65, Aug 3 2007. ISSN 0022-2836 (Print) 
0022-2836 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17561112 >. 
 
ARONIN, N.; DIFIGLIA, M. Huntingtin-lowering strategies in Huntington's disease: 
antisense oligonucleotides, small RNAs, and gene editing. Mov Disord, v. 29, n. 11, p. 1455-
61, Sep 15 2014. ISSN 1531-8257 (Electronic) 
0885-3185 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25164989 >. 
 
BITINAITE, J. et al. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U 
S A, v. 95, n. 18, p. 10570-5, Sep 1 1998. ISSN 0027-8424 (Print) 
0027-8424 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9724744 >. 
 
BOCH, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. 
Science, v. 326, n. 5959, p. 1509-12, Dec 11 2009. ISSN 1095-9203 (Electronic) 
0036-8075 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19933107 >. 
 
CARLSON, D. F. et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proc Natl 
Acad Sci U S A, v. 109, n. 43, p. 17382-7, Oct 23 2012. ISSN 1091-6490 (Electronic) 
0027-8424 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23027955 >. 
 
CHEVALIER, B. S. et al. Design, activity, and structure of a highly specific artificial 
endonuclease. Mol Cell, v. 10, n. 4, p. 895-905, Oct 2002. ISSN 1097-2765 (Print) 
1097-2765 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12419232 >. 
 
CHOULIKA, A. et al. Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes 
by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, v. 15, n. 4, p. 1968-
73, Apr 1995. ISSN 0270-7306 (Print) 
0270-7306 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7891691 >. 
 
CHYLINSKI, K.; LE RHUN, A.; CHARPENTIER, E. The tracrRNA and Cas9 families of 
type II CRISPR-Cas immunity systems. RNA Biol, v. 10, n. 5, p. 726-37, May 2013. ISSN 
1555-8584 (Electronic) 
1547-6286 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23563642 >. 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17561112
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25164989
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9724744
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19933107
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23027955
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12419232
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7891691
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23563642
 
 
 
 
COX, D. B.; PLATT, R. J.; ZHANG, F. Therapeutic genome editing: prospects and 
challenges. Nat Med, v. 21, n. 2, p. 121-31, Feb 2015. ISSN 1546-170X (Electronic) 
1078-8956 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25654603 >. 
 
DONOHO, G.; JASIN, M.; BERG, P. Analysis of gene targeting and intrachromosomal 
homologous recombination stimulated by genomic double-strand breaks in mouse embryonic 
stem cells. Mol Cell Biol, v. 18, n. 7, p. 4070-8, Jul 1998. ISSN 0270-7306 (Print) 
0270-7306 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9632791 >. 
 
DUAN, X.; GIMBLE, F. S.; QUIOCHO, F. A. Crystal structure of PI-SceI, a homing 
endonuclease with protein splicing activity. Cell, v. 89, n. 4, p. 555-64, May 16 1997. ISSN 
0092-8674 (Print) 
0092-8674 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9160747 >. 
 
HAEUSSLER, M.; CONCORDET, J. P. Genome Editing with CRISPR-Cas9: Can It Get 
Any Better? J Genet Genomics, Apr 24 2016. ISSN 1673-8527 (Electronic) 
1673-8527 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27210042 >. 
 
HEATH, P. J. et al. The structure of I-Crel, a group I intron-encoded homing endonuclease. 
Nat Struct Biol, v. 4, n. 6, p. 468-76, Jun 1997. ISSN 1072-8368 (Print) 
1072-8368 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9187655 >. 
 
HOCKEMEYER, D. et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE 
nucleases. Nat Biotechnol, v. 29, n. 8, p. 731-4, Aug2011. ISSN 1546-1696 (Electronic) 
1087-0156 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127 >. 
 
HOTTA, A.; YAMANAKA, S. From Genomics to Gene Therapy: Induced Pluripotent Stem 
Cells Meet Genome Editing. Annu Rev Genet, v. 49, p. 47-70, 2015. ISSN 1545-2948 
(Electronic) 
0066-4197 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26407033 >. 
 
HSU, P. D.; LANDER, E. S.; ZHANG, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 
for genome engineering. Cell, v. 157, n. 6, p. 1262-78, Jun 5 2014. ISSN 1097-4172 
(Electronic) 
0092-8674 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24906146 >. 
 
ISALAN, M.; CHOO, Y.; KLUG, A. Synergy between adjacent zinc fingers in sequence-
specific DNA recognition. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 94, n. 11, p. 5617-21, May 27 1997. 
ISSN 0027-8424 (Print) 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25654603
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9632791
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9160747
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27210042
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9187655
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26407033
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24906146
 
 
 
0027-8424 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9159121 >. 
 
IUCHI, S. Three classes of C2H2 zinc finger proteins. Cell Mol Life Sci, v. 58, n. 4, p. 625-
35, Apr 2001. ISSN 1420-682X (Print) 
1420-682X (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11361095 >. 
 
JINEK, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive 
bacterial immunity. Science, v. 337, n. 6096, p. 816-21, Aug 17 2012. ISSN 1095-9203 
(Electronic) 
0036-8075 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22745249 >. 
 
JINEK, M. et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational 
activation. Science, v. 343, n. 6176, p. 1247997, Mar 14 2014. ISSN 1095-9203 (Electronic) 
0036-8075 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24505130 >. 
 
JOUNG, J. K.; SANDER, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome 
editing. Nat Rev Mol Cell Biol, v. 14, n. 1, p. 49-55, Jan 2013. ISSN 1471-0080 (Electronic) 
1471-0072 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23169466 >. 
 
KIM, Y. G.; CHANDRASEGARAN, S. Chimeric restriction endonuclease. Proc Natl Acad 
Sci U S A, v. 91, n. 3, p. 883-7, Feb 1 1994. ISSN 0027-8424 (Print) 
0027-8424 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7905633 >. 
 
KLUG, A. The discovery of zinc fingers and their applications in gene regulation and genome 
manipulation. Annu Rev Biochem, v. 79, p. 213-31, 2010. ISSN 1545-4509 (Electronic) 
0066-4154 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20192761 >. 
 
KRISHNA, S. S.; MAJUMDAR, I.; GRISHIN, N. V. Structural classification of zinc fingers: 
survey and summary. Nucleic Acids Res, v. 31, n. 2, p. 532-50, Jan 15 2003. ISSN 1362-
4962 (Electronic) 
0305-1048 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12527760 >. 
 
LI, L.; WU, L. P.; CHANDRASEGARAN, S. Functional domains in Fok I restriction 
endonuclease. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 89, n. 10, p. 4275-9, May 15 1992. ISSN 0027-
8424 (Print) 
0027-8424 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1584761 >. 
 
LIEBER, M. R. et al. Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-
joining. Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 4, n. 9, p. 712-720, Sep 2003. ISSN 
1471-0072. Disponível em: < <Go to ISI>://WOS:000185061500014 >. 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9159121
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11361095
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22745249
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24505130
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23169466
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7905633
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20192761
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12527760
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1584761
 
 
 
 
LONG, C. et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse 
model of muscular dystrophy. Science, v. 351, n. 6271, p. 400-3, Jan 22 2016. ISSN 1095-
9203 (Electronic) 
0036-8075 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26721683 >. 
 
MARESCA, M. et al. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed 
nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Res, v. 
23, n. 3, p. 539-46, Mar 2013. ISSN 1549-5469 (Electronic) 
1088-9051 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23152450 >. 
 
MOEHLE, E. A. et al. Targeted gene addition into a specified location in the human genome 
using designed zinc finger nucleases (vol 104, pg 3055, 2007). Proceedings of the National 
Academy of Sciences of the United States of America, v. 104, n. 14, p. 6090-6090, Apr 3 
2007. ISSN 0027-8424. Disponível em: < <Go to ISI>://WOS:000245657600069 >. 
 
MOSCOU, M. J.; BOGDANOVE, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL 
effectors. Science, v. 326, n. 5959, p. 1501, Dec 11 2009. ISSN 1095-9203 (Electronic) 
0036-8075 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19933106 >. 
 
NISHIMASU, H. et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target 
DNA. Cell, v. 156, n. 5, p. 935-49, Feb 27 2014. ISSN 1097-4172 (Electronic) 
0092-8674 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24529477 >. 
 
OUSTEROUT, D. G. et al. Reading frame correction by targeted genome editing restores 
dystrophin expression in cells from Duchenne muscular dystrophy patients. Mol Ther, v. 21, 
n. 9, p. 1718-26, Sep 2013. ISSN 1525-0024 (Electronic) 
1525-0016 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23732986 >. 
 
PAVLETICH, N. P.; PABO, C. O. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a 
Zif268-DNA complex at 2.1 A. Science, v. 252, n. 5007, p. 809-17, May 10 1991. ISSN 
0036-8075 (Print) 
0036-8075 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2028256 >. 
 
PEREZ, E. E. et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing 
using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol, v. 26, n. 7, p. 808-16, Jul 2008. ISSN 1546-1696 
(Electronic) 
1087-0156 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18587387 >. 
 
SILVA, G. et al. Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: 
perspectives and challenges for gene therapy. Curr Gene Ther, v. 11, n. 1, p. 11-27, Feb 
2011. ISSN 1875-5631 (Electronic) 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26721683
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23152450
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19933106
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24529477
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23732986
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2028256
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18587387
 
 
 
1566-5232 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21182466 >. 
 
SMITH, J. et al. Requirements for double-strand cleavage by chimeric restriction enzymes 
with zinc finger DNA-recognition domains. Nucleic Acids Res, v. 28, n. 17, p. 3361-9, Sep 1 
2000. ISSN 1362-4962 (Electronic) 
0305-1048 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10954606 >. 
 
SMITH, J. et al. A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving 
chosen sequences. Nucleic Acids Res, v. 34, n. 22, p. e149, 2006. ISSN 1362-4962 
(Electronic) 
0305-1048 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17130168 >. 
 
STREUBEL, J. et al. TAL effector RVD specificities and efficiencies. Nat Biotechnol, v. 30, 
n. 7, p. 593-5, Jul 2012. ISSN 1546-1696 (Electronic) 
1087-0156 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22781676 >. 
 
SZOSTAK, J. W. et al. The double-strand-break repair model for recombination. Cell,v. 33, 
n. 1, p. 25-35, May 1983. ISSN 0092-8674 (Print) 
0092-8674 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6380756 >. 
 
XIAO, A. et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and 
CRISPR/Cas in zebrafish. Nucleic Acids Res, v. 41, n. 14, p. e141, Aug 2013. ISSN 1362-
4962 (Electronic) 
0305-1048 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23748566 >. 
 
YANG, W. et al. CRISPR/Cas9: Implications for Modeling and Therapy of 
Neurodegenerative Diseases. Front Mol Neurosci, v. 9, p. 30, 2016. ISSN 1662-5099 
(Electronic) 
1662-5099 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27199655 >. 
 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21182466
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10954606
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17130168
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22781676
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6380756
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23748566
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27199655