resumo biotecnologia aplicada

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1. Identificação Molecular e comparação de sequências
1.1 Evolução
Sequências biológicas (DNA/aminoácidos) evolutivamente próximas tendem a ter mais similaridades do que diferenças.
1.2 Tipos de mutação - Inserção, Substituição e Deleção.
1.3 Técnicas 
Tradicionais 
PCR- identificar padrões de amplificação únicos para espécie ou indivíduos dentro de uma espécie (ex. análise forense, identificação de cultivars)
Revelação por eletroforese 
· Gel – manualmente
· Capilar - automatizada
Sequenciamento - Barcoding 
Barcode - sequências de DNA padronizadas usadas para identificação de espécies
Comparação em um banco de dados de espécies identificadas é usado para a determinação da espécie de um organismo não-identificado.
Determinação de um barcode
· A sequência deve estar presente em todas as espécies do grupo taxonômico de interesse
· Variação relevante entre as espécies
· Tamanho relativamente curto
Barcodes mais comuns:
· Animais: citocromo c-oxidase I (COI)
· Bactérias: RNA ribossomal 16s
· Fungos: espaçador interno transcrito (ITS)
Plantas: tirosina-proteína quinase (MATK)
1.4 Homologia
· Genes homólogos compartilham um ancestral comum
· Homologia costuma indicar semelhanças funcionais
· Paralogia: homologia entre genes em uma mesma espécie
· Ortologia: homologia entre genes de espécies diferentes
· Analogia: semelhança funcional sem relação evolutiva (NÃO é uma forma de homologia)
2. Sequenciamento de DNA
é o processo de determinação da sequência de nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.
2.1 Sequenciamento de Sanger
 O DNA alvo é copiado muitas vezes, produzindo fragmentos de comprimentos diferentes. Nucleotídeos “terminadores de cadeia” fluorescentes marcam os finais dos fragmentos e permitem que a sequência seja determinada.
Produção de muitas cópias de uma região alvo de DNA.
Aplicações
Regiões de DNA com até 900 pares de base de comprimento, fragmentos individuais de DNA, como fragmentos usados na Clonagem de DNA ou gerados por PCR.
Ingredientes
Uma enzima DNA polimerase;
Um primer, que se liga ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a polimerase;
Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
O DNA molde a ser sequenciado;
Nucleotídeos Dideoxi, ou terminadores de cadeia, (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), marcada com um corante de uma cor diferente;
Processo
O DNA molde é colocado em um tubo com o primer, DNA polimerase e nucleotídeos de DNA (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP). E os terminadores de cadeia em concentração muito menor que a dos nucleotídeos comuns.
1. Aquecimento para a abertura do DNA molde;
2. Resfriamento para a ligação dos primers ao DNA molde;
3. Aumento da temperatura para a DNA polimerase sintetizar um novo DNA a partir do primer. Isso ocorrerá até se adicionar nucleotídeos dideoxinucleotídeo.
4. Este processo é repetido em um número de ciclos.
5. Os fragmentos são levados através de um longo e fino tubo contanto uma matriz de gel em um processo chamado de electroforese capilar em gel.
6. Cada fragmento, do menor ao maior, cruza o gel no final do tubo, ele é iluminado por um laser, e o corante anexado é detectado.
7. Os dados registrados pelo detector consistem em uma série de picos em intensidade de fluorescência.
8. A sequência de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma.
Usos e limitações
Caro e ineficiente para projetos de larga escala, como o sequenciamento de um genoma inteiro ou metagenoma.
Adequado para projetos menores
2.2 Next generation sequencing
Novas abordagens feitas em grande escala que aumentam a velocidade e diminuem os custos do sequenciamento.
Conduz um grande número de pequenas reações Sanger de sequenciamento em paralelo.
Característica
· Alto paralelismo: muitas reações de sequenciamento ocorrem ao mesmo tempo;
· Microescala: reações são pequenas e muitas podem ser realizadas de uma vez em um chip;
· Rapidez: pelas reações serem feitas em paralelo, resultados são obtidos muito mais rápido;
· Baixo custo: sequenciar um genoma é mais barato do que com o sequenciamento Sanger;
· Menor comprimento: leituras tipicamente variam entre 50 -700nucleotídeos de comprimento;
Vantagem
Grandes quantidades de DNA podem ser sequenciadas de forma muito mais rápida e barata com métodos de próxima geração do que com sequenciamento Sanger.
Tipos
454 Life Sciences/Roche – “a mudança”
· Primeiro sequenciador de larga escala comercializado (2004)
· 2008 - 500 Mb sequencias (~500 bp)/ corrida
· Corrida = 8 amostras /10 h
· Pirosequenciamento, beads e microplacas
· Baixa taxa de erro, dificuldades com homopolímeros- AAAA
Illumina
· 600 Gb/11 dias
· Original – Solexa (2006) – atual Illumina 
· Baixa taxa de erro, algumas mudanças de bases
Ion torrent – baixo custo (variação no pH)
Pacific Biosciences – longas sequencias
Nanopore 
· Sequenciamento em tempo real
· DNA e RNA
· Altamente escalável
	Sanger
	NGS
	Nanopore
	Sequências longas
Bom custo-benefício para projetos pequenos (1-20 alvos)
	Grande volume de dados
Boa resolução
	Grande volume de dados
Sequências longas
Escalabilidade
	Baixo volume de dados
Baixa escalabilidade
	Sequências curtas
Alto custo para projetos com poucos alvos
	Propensão a erros
Poucas ferramentas
3. Aplicações da PCR
Um método in vitro rápido, sensível e versátil para amplificação seletiva de sequencias definidas de DNA (ou RNA) a partir de amostras complexas de ácido nucleico. Gerando quantidade de DNA suficiente para manipulação e análises subsequentes.
3.1 Ingredientes
· DNA Molde
• Primers ou Oligonucleotídeos Iniciadores
• Taq DNA Polimerase
• DNTP
• MgCl2
• Tampão
• Água
3.2 Funcionamento
1. Etapa de desnaturação – aumento da temperatura, próximo dos 96ºC, para realizar a abertura das fitas duplas do DNA molde;
2. Etapa de anelamento – Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples. Entre 55-65ºC;
3. Etapa de extensão – aumento da temperatura, próximo dos 72ºC, para ação da taq polimerase e formação de novas cópias. 
3.3 Aplicações
Detecção de transgênico, Bioinformática, Clonagem genômica, Projeto Genoma Humano, análises bioforense.
3.4 Tipos
PCR Aninhado – utilizado quando tem pouco DNA alvo disponível. Ex. Detecção de Transgênicos, detecção de Patógenos, Diagnóstico Pré-natal, diagnóstico de doenças.
PCR em tempo real - utilizando sistema de sondas fluorescentes dispensa a corrida do gel após a amplificação. Quando ocorre a amplificação fluorescência na reação é alterada, permite a quantificar o RNAm produzido por determinado organismo – (síntese de cDNA e PCR).
Marcadores Moleculares 
 RAPD - utiliza primers curtos que se anelam aleatoriamente no genoma do organismo.
 Microsatélites - utiliza primers curtos que se anelam em regiões que flanqueiam DNA repetitivo
Engenheira Genética
Introdução de Mutações – sítio específica
Introdução de Mutações – aleatória
4. Marcadores Moleculares
Auxilia na discriminação de animais, plantas, micro-organismo e humanos. Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples
Aplicações
	Vegetais – banco de germoplasma; Melhoramento genético
	Micro-organismo - Análise da diversidade genética em um ambiente.
	Animais – Diagnóstico forense
4.1 Marcadores Genéticos Bioquímicos
Produtos da expressão de genes. Ex - Proteínas ou compostos secundários. Isoenzimas
4.2 Marcadores Genéticos Moleculares
Derivam da análise de do polimorfismo presentes no DNA. Ex. RFLP, AFLP, SSR, SCARS, SNIP
Marcadores Genéticos
Dominantes – quando indivíduos heterozigotos não podem ser identificados na análise
Codominantes – quando pode se identificar o indivíduo heterozigoto.
Origem do Polimorfismo Molecular
· Mutações pontuais – SNPs – alteração em 1 base;
· Pequenas deleções e/ou inserções - InDels
4.3 Isoenzimas
São diferentes formas moleculares de uma enzima catalizando a mesma reação na célula, as quais podem ser identificadas por migração e coloração
Vantagens
Simplicidade, baixo custo e codominantes
Limitações do uso de isoenzimas
· As enzimas mais frequentemente utilizada como marcadorestendem ser aquelas de fácil extração e as que ocorrem em altas concentrações na célula.
· Técnica limitada a enzimas solúveis.
· Somente são detectadas substituições de as que resultam em diferenças na mobilidade eletroforética da proteína.
· Modificações pós-transcrição;
· Alelos Nulos;
· Baixo nível de polimorfismo, quando comparados a marcações moleculares como os microssatélites;
4.4 RFLP
RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos
• Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção
• Utiliza-se DNA celular total
• Requer DNA puro de alto peso molecular
Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel
4.5 MINISATÉLITES