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0 INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA GOIANO CAMPUS MORRINHOS CURSO DE BACHARELADO EM AGRONOMIA BIOQUÍMICA – 3º PERÍODO PROF.ª. DR.ª. CARLA DE MOURA MARTINS CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS & CARBOIDRATOS REDUTORES Morrinhos – GO 2019 Guilherme Augusto Matias Nunes João Vitor Gomes Paulino Carvalho Leonardo Eleutério da Costa Mariana Assunção da Silva CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS & CARBOIDRATOS REDUTORES Relatório apresentado ao Curso de Bacharelado em Agronomia, do Instituto Federal Goiano – Campus Morrinhos (GO), como exigência parcial para aprovação na disciplina de Bioquímica (3º Período), ministrada pela Prof.ª. Dr.ª. Carla de Moura Martins. Morrinhos – GO 2019 0 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1 2. OBJETIVO .............................................................................................................. 3 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 3 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ................................................................ 3 4.1 Materiais & Reagentes ........................................................................................ 3 4.2 Procedimentos Experimentais ............................................................................ 4 5. RESULTADOS & DISCUSSÃO ........................................................................... 6 5.1 Polissacarídeos ...................................................................................................... 6 5.2 Açúcares Redutores ............................................................................................... 9 6. QUESTIONÁRIO ................................................................................................. 11 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................... 15 7.1 Polissacarídeos .................................................................................................... 15 7.2 Açúcares Redutores ............................................................................................. 15 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 15 1 1. INTRODUÇÃO Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na Terra. Alguns carboidratos, como o açúcar e o amido, são os principais elementos da dieta em muitas partes do mundo, e sua oxidação é a principal via de produção de energia na maioria das células não fotossintéticas (NELSON; COX, 2012). Segundo Bruice (2006), em geral, os carboidratos são poliidroxialdeídos ou poliidroxicetonas, ou até mesmo substâncias que liberam tais compostos por hidrólise. O termo carboidrato denota hidratos de carbono oriunda da fórmula geral (CH2O)n apresentada pela maioria dessas moléculas, e podem ser divididos em três classes principais de acordo com o número de ligações glicosídicas. Monossacarídeos: Os monossacarídeos consistem somente de uma unidade de poliidroxialdeídos ou poliidroxicetonas, as quais podem ter de três a sete átomos de carbono, dos quais se destacam a D-glicose, uma aldose (poliidroxialdeído) e a D-frutose, uma cetose (poliidroxicetona), os dois monossacarídeos mais abundantes na Terra (SOLOMONS; FRYTHLE, 2012). Oligossacarídeos: Os oligossacarídeos são formados por cadeias curtas de monossacarídeos. Os mais comuns são os dissacarídeos, os quais têm em sua composição dois monossacarídeos unidos por uma ligação denominada glicosídica e tal ligação ocorre pela condensação entre o grupo hidroxila de um monossacarídeo com o carbono anomérico de outro monossacarídeo, dos quais se destacam a sacarose (açúcar da cana) e a lactose (açúcar do leite). (SOLOMONS; FRYTHLE, 2012). Polissacarídeos. Açúcares contendo mais de 20 unidades são denominados polissacarídeos, os quais podem possuir milhares de monossacarídeos e são a forma predominante dos carboidratos na natureza. A diferenciação é dada pela unidade monomérica, comprimento e ramificação das cadeias. Quando os polissacarídeos contêm apenas um tipo de monossacarídeo ele é denominado de homopolissacarídeo, e se estiveram presentes dois ou mais tipos de monossacarídeos, o resultado é um heteropolissacarídeo (SOLOMONS; FRYHLE, 2012). 2 Um exemplo de homopolissacarídeo é o amido, o qual possui função preponderante de armazenamento energético em células vegetais. O amido é composto por dois tipos de polímeros de glicose: a amilose e a amilopectina. A diferença básica entre estes é a ramificação da cadeia (NELSON; COX, 2006). Moléculas como a amilose e a amilopectina possui alto peso molecular e podem sofrer reações de complexação, com formação de compostos coloridos. Exemplo importante e que é alvo de estudo deste, é a complexação da amilose e da amilopectina com o iodo, resultando em um complexo azul e vermelho-violáceo, respectivamente. A Figura 01, a seguir, esquematiza a interação do iodo com a estrutura do amido. Figura 01 – Interação do amido com o iodo. Fonte: (SOUZA; NEVES, 200?). Outrora, outros carboidratos podem ser identificados por meio de várias reações e algumas dessas envolvem a formação de complexos corados ou não, dependendo diretamente da especificidade da estrutura do carboidrato em questão. Em prática o Reagente de Benedict foi utilizado na caracterização de açúcares redutores em diferentes amostras. Como o Reagente de Benedict contém íons Cu2+ ligados a agentes complexantes em meio alcalino, e com o aquecimento do açúcar com grupamento redutor na presença dos íons Cu2+ e OH–, o Cu2+ é reduzido a Cu+ e o açúcar e oxidado, ocorrendo a formação de precipitado de Cu2O, justificado pela Equação 01 abaixo, onde a coloração do precipitado dependerá exclusivamente do conteúdo de açúcar redutor. Equação 01 – Reação entre o Reagente de Benedict com açúcar redutor qualquer. Cu2+(aq) + 4OH–(aq) + RCHO(aq) → RCOOH(aq) + Cu2O(s) + 2H2O(l) Fonte: (KOBLITZ, 2008). 3 2. OBJETIVO Caracterizar polissacarídeos e carboidratos redutores. 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Analisar e identificar através de procedimentos o poder de redução presentes em alguns açúcares. Testar e analisar através de processos quais açúcares podem sofre complexação. 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 4.1 Materiais & Reagentes a. Caracterização de Polissacarídeos 7 tubos de ensaio; Estante para tubo de ensaio; Caneta esferográfica; 3 conta-gotas; 6 pipetas de 2 mL; 2 pipetas de 5 mL; Pipetadores e/ou peras; 1 béquer de 25 mL; Água destilada; Solução de amido 1%; Solução de glicose 2%; Solução de frutose 2%; Solução de sacarose 2%; Solução de agarose 2%; Solução de lugol; Solução de NaOH 1 g/mol; Solução de HCl 1 g/mol; Álcool etílico; Sistema para filtração simples. 4 b. Açúcares Redutores 7 tubos de ensaio; Estante para tubos de ensaio; Caneta esferográfica; 7 pipetas de 3 mL; 1 pipeta de 1 mL; Pipetadores e/ou peras; Banho-maria; Água destilada; Leite; Solução de glicose 1%; Solução de açúcar de mesa; Adoçante; Refrigerante; Solução de amido 1%; Reativo de Benedict. 4.2 Procedimentos Experimentais a. Caracterização de Polissacarídeos Parte I a. Preparou-se uma bateria de tubo de ensaio devidamente identificados de 1 a 6. b. Adicionou-se aos tubos 2 mL dos seguintes reagentes: Tubo 1: Água destilada; Tubo 2: Solução de amido; Tubo 3: Solução de glicose; Tubo 4: Solução de frutose; Tubo 5: Solução desacarose; Tubo 6: Solução de agarose. c. Acrescentou-se a cada um dos seis tubos de ensaio, contendo seus respectivos reagentes, 4 gotas da solução de lugol. d. Observou-se a coloração desenvolvida em cada tubo para futuras considerações. 5 Parte II a) Adicionou-se ao tubo 2, ao qual continha amido e lugol, 5 gotas de NaOH 1M. b) No mesmo tubo, acrescentou-se 5 gotas de HCl 1M. c) Observou-se o efeito em ambas adições para futuras considerações. Parte III a. Pipetou-se em um novo e limpo tubo de ensaio 5mL da solução de amido. b. Acrescentou-se 5 mL de álcool etílico e agitou-se. c. Filtrou-se a mistura com papel filtro. d. Testou-se separadamente, no filtrado e no precipitado, a presença de amido a partir da adição de 4 gotas da solução de lugol. b. Açúcares Redutores Parte I a. Preparou-se uma bateria de tubos de ensaio devidamente identificados de 1 a 7. b. Adicionou-se aos tubos 3 mL das seguintes amostras: Tubo 1: Água destilada; Tubo 2: Leite; Tubo 3: Solução de glicose; Tubo 4: Solução de açúcar de mesa; Tubo 5: Adoçante; Tubo 6: Refrigerante; Tubo 7: Solução de amido. c. Acrescentou-se a cada um dos sete tubos de ensaio, contendo suas respectivas amostras, 1 mL do reativo de Benedict para futuras considerações. d. Observou-se o efeito do reativo de Benedict a frio sobre cada amostra. e. Aqueceu-se os tubos de ensaio por aproximadamente cinco minutos à 79 ºC em Banho-maria, e observou-se o efeito do reativo de Benedict para futuras considerações. 6 5. RESULTADOS & DISCUSSÃO 5.1 Polissacarídeos Parte I – Caracterização A Tabela 01, a seguir, mostra as observações feitas quanto a reação das respectivas amostras com a solução de lugol. Tabela 01 – Observação feitas após adição do lugol sobre as diferentes amostras. TUBOS 1 2 3 4 5 6 REAGENTE (2mL) + LUGOL (4 gotas) Água + Lugol Amido + Lugol Glicose + Lugol Frutose + Lugol Sacarose + Lugol Agarose + Lugol OBSERVAÇÕES Assumiu coloração translucida do lugol, e sem formação de precipitados. Assumiu coloração azul. Assumiu coloração translucida do lugol, e sem formação de precipitados. Assumiu coloração translucida do lugol, e sem formação de precipitados. Assumiu coloração translucida do lugol, e sem formação de precipitados. Assumiu coloração opaca do lugol, e com formação de precipitados preto. A Figura 02 abaixo registra os ensaios realizados entre as diferentes amostras com a solução lugol. Figura 02 – Ensaios das diferentes amostras com a solução de lugol. Fonte: (os autores). 7 Como podemos observar pela Figura 02, apenas a amostra contida no Tubo 02, solução de amido, sofreu reação de complexação, caracterizando-a assim como um polissacarídeo. Analisando o Tubo 06, o qual continha a solução de agarose, observamos a formação de precipitados com a coloração semelhante ao do complexo formado no Tubo 02. A agarose é classificada como sendo um heteropolissacarídeo, ou seja, contém em sua estrutura dois tipos diferentes de monossacarídeos, como mostra a Figura 03 abaixo. Figura 03 – Estrutura da Agarose. Fonte: (NELSON; COX, 2012). Porém, nem todos os polissacarídeos, apesar de serem moléculas grandes, darão complexos coloridos ao reagirem com o iodo. E isso se deve necessariamente que a molécula do açúcar em questão deve apresentar uma conformação que propicie o encaixe com o iodo, contido na solução de lugol. Dentre as diferentes amostras analisadas pelo teste do iodo, apenas as contidas em Tubos 02 (amido) e 06 (agarose) são classificadas como polissacarídeos. Demais amostras foram classificadas, a partir de pesquisas e conhecimentos adquiridos em aulas teóricas, como monossacarídeos (glicose e frutose) e dissacarídeos (sacarose). Parte II – Solubilidade e Hidrólise Ácida A Figura 04 registra os resultados obtidos a partir da reação do complexo amido + lugol com o NaOH e HCl, respectivamente. 8 Figura 04 – Complexo reagindo com NaOH e HCl, respectivamente Complexo Complexo + NaOH Complexo + HCl Fonte: (os autores). A solubilidade dos carboidratos depende da disponibilidade dos grupos hidroxila para formar ligações de hidrogênio com a água. No caso em questão, ou seja, do amido, a solubilidade é muito baixa devido à grande quantidade de ligações de hidrogênio, fato este que minimiza a interação com a água. Assim, a solubilização só é obtida por meio da hidrólise ácida, ou seja, em pH ácido. Fato este comprovado quando adicionado HCl após adição do NaOH. Parte III – Precipitação. A Figura 05 registra o resultado obtido nesta etapa, ou seja, há ou não presença de amido. Figura 05 – Identificação de amido em sobrenadante e precipitado, respectivamente. Fonte: (os autores). 9 Como podemos observar pelas colorações adquiridas, e como já era esperado, somente houve a presença de amido no precipitado formado devido a coloração assumida, já que para a obtenção do sobrenadante, o mesmo se deu após filtração da solução obtida entre o amido + álcool etílico, assumindo coloração amarelo-laranjado devido ao iodo do lugol, pressupondo-se assim, que não há presença de amido. 5.2 Açúcares Redutores Parte I – Caracterização. A Tabela 02, a seguir, mostra as observações feitas quanto a reação das respectivas amostras com o Reativo de Benedict. Tabela 02 – Observação feitas após adição do Reativo de Benedict sobre as diferentes amostras. TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 AMOSTRAS (3 mL) + REATIVO DE BENEDICT (1 mL) Água + Reativo de Benedict Leite + Reativo de Benedict Glicose + Reativo de Benedict Açúcar + Reativo de Benedict Adoçante + Reativo de Benedict Refrigerante + Reativo de Benedict Amido + Reativo de Benedict OBSERVAÇÕES (A frio) Não houve alterações. Não houve alterações. Não houve alterações. Não houve alterações. Não houve alterações. Não houve alterações. Não houve alterações. OBSERVAÇÕES (A quente) Não houve alterações. Alteração de cor e formação de precipitado. Alteração de cor. Alteração de cor. Não houve alterações. Alteração de cor. Não houve alterações. A Figura 06 abaixo registra os ensaios realizados entre as diferentes amostras com o Reativo de Benedict a frio. 10 Figura 06 – Ensaios das diferentes amostras com o Reativo de Benedict a frio. Fonte Fonte: (os autores). Foi observado que após a adição do Reativo de Benedict a temperatura ambiente, ou seja, a frio, não houve nenhuma alteração, seja ela física ou química. Assim, conforme solicitado em roteiro, todas as amostras foram levadas a banho-maria, por aproximadamente 5 minutos a uma temperatura de 78 ºC. E após, obtivemos os resultados aos quais a Figura 07 abaixo registra. Figura 07 – Ensaios das diferentes amostras com o Reativo de Benedict a quente. Fonte: (os autores). Como podemos observar pela Figura 07, as amostras contidas nos Tubo 01, 05 e 07, mesmo levadas ao banho-maria não sofreram alterações quanto a mudança de cores, concluindo assim que estas não são açúcares redutores, ou seja, não apresentam a 11 hidroxila livre no carbono anomérico, C-1. Por outro lado, as amostras contidas nos Tubos 02, 03, 04 e 06 sofreram mudanças consideráveis após retiradas do banho-maria, comprovando assim que estas são açúcares redutores, ou seja, possuem OH livre no carbono anomérico, C-1, para sofrerem processo de oxidação. 6. QUESTIONÁRIO 6.1 Compare e discuta as cores entre os diferentes tubos. Indique em quais tubos o teste de Benedictfoi positivo. Pelo resultado obtido na Figura 07, temos: Tubo 01: Água destilada – Cor inalterada / Resultado negativo. Tubo 02: Leite – Cor alterada e com formação de precipitado / Resultado positivo. Tubo 03: Solução de glicose – Cor alterada / Resultado positivo. Tubo 04: Solução de açúcar de mesa – Cor alterada / Resultado positivo. Tubo 05: Adoçante – Cor inalterada / Resultado negativo. Tubo 06: Refrigerante – Cor alterada / Resultado positivo. Tubo 07: Solução de amido – Cor inalterada / Resultado negativo. A coloração inicial do Reativo de Benedict é azul. Na presença de um agente redutor, e após devido aquecimento obtém-se o aparecimento de uma coloração castanha opaca e/ou precipitado da mesma coloração. Esse fenômeno é justificado pela seguinte reação: Cu2+(aq) + 4OH–(aq) + RCHO(aq) ∆ → RCOOH(aq) + Cu2O(s) + 2H2O(l) A coloração da solução e do precipitado dependerá exclusivamente do conteúdo de açúcar redutor. 6.2 Qual foi o tubo que apresentou maior quantidade de carboidratos redutores? Após realização do teste do Reativo de Benedict, observou-se que o Tubo 06, o qual continha refrigerante, assumiu uma coloração laranjada mais concentrada, como mostrou a Figura 07, e isso se deu pelo motivo da grande quantidade de sacarose presente em sua composição. 12 6.3 Dê a estrutura de cada um dos carboidratos presentes em cada tubo de ensaio. Figura 08 – Estruturas da composição do amido (amilose e amilopectina). Fonte: (NELSON; COX, 2012). Figura 09 – Estrutura cíclica da 𝛽-D-Glicose (𝛽-D-Glicopiranose). Fonte: (NELSON; COX, 2012). Figura 10 – Estrutura cíclica da 𝛽-D-Frutose (𝛽-D-Frutofuranose). Fonte: (NELSON; COX, 2012). Figura 11 – Estrutura da Sacarose (𝛽-D-Frutofuranosil-𝛼-D-Glicopiranosídeo). Fonte: (NELSON; COX, 2012). 13 Figura 12 – Estrutura da Agarose. Fonte: (NELSON; COX, 2012). Figura 13 – Estrutura da Lactose (𝛽-D-Galactopiranosil-(1→4)-𝛽-D-Glicopiranose). Fonte: (NELSON; COX, 2012). 6.4 Explique para que serve o reagente de Benedict. O teste de Benedict é uma modificação do teste de Fehling desenvolvido pelo químico americano Stanley Rossiter Benedict e é usado para detectar a presença de açúcares redutores. Uma característica do teste de Benedict é que este é muito mais sensível que o teste de Fehling, podendo detectar a presença de carboidratos em menores concentrações e apresentando uma graduação de cores do azul, passando pelo verde, amarelo, laranja e vermelho para as mais concentradas. 6.5 Quais foram os açúcares redutores identificados nessa prática. Perante ao teste usando o Reativo de Benedict, pudemos identificar os açúcares redutores. Foram eles: Tubo 02: leite. Tubo 03: glicose. Tubo 04: açúcar de mesa. Tubo 06: refrigerante. Assim, estes açúcares, possuem OH livre no carbono anomérico, C-1, para sofrerem processo de oxidação. 14 6.6 Por que predomina a coloração azul na reação amido + iodo, se o amido é uma mistura de dois polissacarídeos diferentes? O amido é composto por amilose, cadeia não ramificada, e amilopectina, cadeia ramificada, como mostrou a Figura 08. O complexo esquematizado na Figura 01 e Figura 02 / Tubo 02, apresentam coloração azul intensa, desenvolvida pelo aprisionamento do iodo nas cadeias lineares da amilose, assim, a amilose forma micelas hidratadas que adsorvem o iodo, presente na solução de lugol, em suas espirais helicoidais apresentando a coloração azul intensa. 6.7 Por que ocorre precipitação do amido quando, em solução aquoso, é tratado com etanol? O etanol é um solvente orgânico e possui grande solubilidade na água, assim, quando adicionado à solução de amido ele se solubiliza rompendo as interações amido- água (ligações de hidrogênio), fazendo com que este se precipite. 6.8 Pesquise o princípio da reação de Molisch e que acontece quando é aplicada a um polissacarídeo? Esse princípio foi aplicado nesse experimento? O teste de Molisch é um teste geral para carboidratos desenvolvido pelo botânico austríaco Hans Molisch. O teste se baseia na desidratação do carboidrato pelo ácido sulfúrico concentrado, formando furfural no caso das pentoses ou 5- (hidroximetil)-furfural para as hexoses. O reagente de Molisch é composto por uma solução alcoólica de α–naftol a 5%. Sendo assim, ao adicionar este em carboidratos as ligações glicosídicas presentes nas moléculas de polissacarídeos são facilmente rompidas resultando em monossacarídeos. Este princípio não foi aplicado nesse experimento. 6.9 Pesquise em como se dá a interação química do amido com o iodo. O amido é um carboidrato, sendo polímero da glicose, composto por amilose, cadeia não ramificada, e amilopectina, cadeia ramificada. A interação entre ambos resultada em um complexo azul intenso, e isso acontece, pois, o iodo se aloja no interior das hélices da amilose ou das hélices formadas nas partes lineares da amilopectina, formando o complexo em questão. Em outas palavras, a coloração azul intensa é desenvolvida pelo aprisionamento do iodo nas cadeias lineares da amilose, assim, a amilose forma micelas hidratadas que adsorvem o iodo, presente na solução de lugol, 15 em suas espirais helicoidais apresentando a coloração azul intensa, sendo assim o amido possui conformação perfeita para o encaixe do iodo, contido na solução de lugol. 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 7.1 Polissacarídeos Os resultados experimentais obtidos coincidiram com os apresentados na literatura. Com a técnica utilizada, teste do iodo, pôde-se caracterizar dentre as amostras analisadas quais eram polissacarídeos, e como resultado obtivemos a solução de amido (Tubo 02) e solução de agarose (Tubo 06), visto que o amido é facilmente detectado pela formação do complexo azul com íon triiodeto e a agarose por não possuir uma conformação que propicie o encaixe com o iodo, contido na solução de lugol, precipita igualmente com a quantidade de lugol adicionado. Demais amostras foram classificadas, a partir de pesquisas e conhecimentos adquiridos em aulas teóricas, como monossacarídeos (glicose e frutose) e dissacarídeos (sacarose). 7.2 Açúcares Redutores Os resultados experimentais obtidos se assemelharam com os apresentados em literatura. Com a técnica utilizada, teste do Reativo de Benedict, foi possível identificar dentre as amostras estudadas quais eram açúcares redutores, e como resultado obtivemos o leite (Tubo 02), solução de glicose (Tubo 03), solução de açúcar de mesa (Tubo 04) e o refrigerante (Tubo 06). Fato que comprova este resultado é que em suas estruturas químicas todos estes açúcares possuem a hidroxila livre no carbono anomérico, C-1, para sofrerem processo de oxidação, resultando na mudança cor. Demais amostras não sofreram processo oxidação devido os carbonos anoméricos de suas estruturas já estarem em estado máximo de oxidação. REFERÊNCIAS BRUICE, P. Y. Química orgânica. 4. ed. v.2. São Paulo, SP: Pearson Prentice Hall, 2006. KOBLIZT, M. G. B. Bioquímica de alimentos: Teoria e aplicações práticas. Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 2008. NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. 6ª.ed. Porto Alegre, RS: Artmed, 2011. 16 SOLOMONS, T. W. G.; FRYHLE, C. B. Química orgânica. 10. ed. v.2. Rio de Janeiro, RJ: LTC, 2012. SOUZA, K. A. F. D.; NEVES, V. A. Experimentos de bioquímica. Pesquisa de polissacarídeos: reação com iodo. 200?. Disponível em: http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/teste_amido.htm. Acesso em: 30/03/2019. http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/teste_amido.htm
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