Estrutura Tridimensional das Proteínas

Prévia do material em texto

Estrutura Tridimensional das Proteínas 
Níveis Estruturais das 
Proteínas 
As proteínas são polímeros que 
consistem de aminoácidos ligados por 
ligações peptídicas. Muitas conformações 
(estruturas tridimensionais) diferentes 
são possíveis para as proteínas. Devido à 
essa complexidade, tornou-se usual a 
definição de quatro níveis de estruturas 
para as proteínas. 
A estrutura primária é a ordem na 
qual os aminoácidos estão ligados, como 
por exemplo o peptídeo: 
Leu-Gly-Thr-Val-Arg-Asp-His 
Nessa estrutura a ordem dos 
aminoácidos pode ser escrita em uma 
linha. 
A estrutura secundária é o arranjo 
de átomos do esqueleto de uma cadeia 
polipeptídica no espaço. Os arranjos em α-
hélice e folhas β pregueadas, mantidos 
por pontes de hidrogênio, são os dois tipos 
de estrutura secundária. 
A estrutura terciária inclui o arranjo 
tridimensional de todos os átomos da 
proteína, incluindo os das cadeias laterais 
e dos grupos prostéticos (grupos de 
átomos não pertencentes a aminoácidos). 
A estrutura quaternária consiste na 
união de várias estruturas terciárias 
(subunidades) por meio de interações não 
covalentes, como pontes de hidrogênio. 
A Estrutura Primária 
A estrutura primária de uma proteína 
é de extrema importância, pois determina 
todas as outras estruturas. 
Na anemia falciforme as hemácias não são 
capazes de ligar o oxigênio de forma eficiente. Essa 
consequência tem origem na troca de um resíduo de 
aminoácido na sequência da estrutura primária. 
A sequência de aminoácidos de 
uma estrutura primária pode ser obtida em 
várias etapas. 
A Etapa 1 é estabelecer quais são os 
aminoácidos que constituem e em qual 
proporção eles estão. A proteína é 
 
 
degradada por hidrólise e os aminoácidos 
são separados e identificados 
individualmente. 
Na Etapa 2, são determinadas as 
identidades dos aminoácidos N-terminal e 
C-terminal. 
Nas Etapas 3 e 4 são determinadas 
a sequência dos aminoácidos a partir da 
extremidade N-terminal, em que cada 
aminoácido é modificado, removido por 
clivagem e identificado. 
→ Clivagem: as proteínas podem ser 
clivadas em sítios específicos por enzimas 
ou reagentes químicos. A enzima tripsina 
cliva as ligações peptídicas com 
aminoácidos que possuem grupos R 
carregados positivamente. A clivagem 
ocorre de maneira que o aminoácido com 
o radical carregado passa a constituir a 
extremidade C-terminal. 
 
A clivagem produz uma mistura de 
peptídeos, que podem ser separados por 
métodos tradicionais. O uso de vários 
reagentes (além da tripsina) produz 
misturas diferentes que podem ser 
arranjadas na ordem correta. 
→ Método de Edman: a sequência de 
um peptídeo pode ser facilmente 
determinada por esse método. O reagente 
de Edman, o fenil-isotiocinato, reage com 
o resíduo N-terminal do peptídeo. O 
aminoácido modificado pode então ser 
removido por clivagem, deixando o 
restante do peptídeo intacto. O segundo 
aminoácido pode, então, ser tratado da 
mesma maneira e, em seguida, o terceiro 
até que todo o peptídeo seja sequenciado. 
A Estrutura Secundária 
A estrutura secundária das 
proteínas é o arranjo do esqueleto da 
cadeia polipeptídica, mantido por pontes 
de hidrogênio. A combinação do grupo 
peptídeo planar (ligação C-N), do carbono 
α rotativo e das pontes de hidrogênio 
entre os aminoácidos cria as diversas 
formas da estrutura secundária. Dois tipos 
de estrutura secundária são encontrados 
frequentemente nas proteínas: a α-hélice e 
a folha β pregueada. Ambas são mantidas 
pelas pontes de hidrogênio. 
Alfa Hélice (α-hélice) 
A α-hélice é estabilizada por pontes 
de hidrogênio paralelas a seu eixo que 
ocorrem no interior do esqueleto de uma 
única cadeia polipeptídica. Contando-se a 
partir da extremidade N-terminal, o grupo 
C=O de cada resíduo de aminoácido está 
ligado por pontes de hidrogênio ao grupo 
N-H do aminoácido posicionado quatro 
resíduos adiante, na sequência linear 
mantida por ligações covalentes. 
A conformação helicoidal permite 
um arranjo linear dos átomos envolvidos 
nas pontes de hidrogênio, o que confere 
força máxima às pontes e torna essa 
conformação muito estável. 
Nas α-hélices, todas as cadeias 
laterais estão situadas do lado externo da 
estrutura. Se os peptídeos possuírem 
radicais carregados (com possibilidade de 
repulsão/atração de outros radicais), ou 
muito volumosos as α-hélices não são 
formadas. 
Folha Beta (Folha β) 
O arranjo dos átomos na 
configuração de folha β difere-se muito do 
arranjo observado na α-hélice. O esqueleto 
peptídico nas folhas β está estendido em 
forma de zigue-zague. Essa estrutura dá 
origem a uma aparência pregueada da 
folha em geral. 
As cadeias laterais dos 
aminoácidos adjacentes se projetam da 
estrutura em zigue-zague em direções 
opostas, criando um padrão alternado. 
Pontes de hidrogênio podem ser 
formadas entre diferentes partes de uma 
mesma cadeia dobrada sobre si mesma 
(pontes intracadeia) ou entre diferentes 
cadeias (pontes intercadeia). Se as 
cadeias peptídicas se estenderem em uma 
mesma direção (se todas estiverem 
alinhadas em termos de suas extremidades 
N-terminais e C-terminais), será formada 
uma folha pregueada paralela. Quando 
cadeias alternadas se estenderem em 
direções opostas, será formada uma folha 
pregueada antiparalela. 
As pontes de hidrogênio intercadeias 
são alinhadas nas folhas β antiparalelas, 
enquanto elas são distorcidas na variante 
paralela. 
α-Hélices e Folhas β em 
Proteínas 
As α-hélices e as folhas β são 
combinadas de muitas maneiras à medida 
que a cadeia polipeptídica de uma mesma 
proteína dobra sobre si. Por razões 
espaciais (por ser pequena e flexível), a 
glicina é encontrada em voltas reversas. 
As voltas β (ou alças) conectam as 
extremidades de dois segmentos 
adjacentes de uma folha β antiparalela. 
Tal estrutura é uma volta de 180° que 
envolve quatro resíduos, com o oxigênio 
carboxílico do primeiro resíduo ligado ao 
hidrogênio do grupo amino do quarto 
resíduo por uma ponte de hidrogênio. Os 
dois resíduos centrais não formam pontes. 
Além da glicina, a prolina também 
ocorre em voltas reversas, pois suas 
ligações peptídicas envolvendo o nitrogênio 
amino facilmente assume a configuração 
cis, forma acessível em uma volta fechada. 
Voltas β dos tipos I e II são as mais comuns e se 
distinguem pelos ângulos das ligações que ligam 
os quatro resíduos que formam a volta. 
Voltas do tipo I ocorrem mais vezes e as voltas do 
tipo II normalmente possuem a glicina como 
terceiro resíduo. 
 
A combinação de fitas α e β produz 
várias estruturas supersecundárias nas 
proteínas. A estrutura mais comum é a 
unidade βαβ, na qual duas fitas paralelas 
de folha β estão conectadas por um 
segmento de α-hélice. 
Diagrama esquemático da unidade βαβ. As setas 
indicam as direções das cadeias polipeptídicas. 
Uma unidade αα consiste de duas 
hélices antiparalelas. Nesse tipo de arranjo, 
existem contatos energicamente favoráveis 
entre os radicais das duas hélices. 
Diagrama esquemático da unidade αα. 
Em um meandro β, uma folha 
antiparalela é constituída por uma séria de 
voltas (alças) reversas, formando ângulos 
fechados que conectam segmentos da 
cadeia polipeptídica. 
Diagrama esquemático de um meandro β 
Um outro tipo de folha antiparalela é 
formado quando a cadeia polipeptídica 
dobra sobre si mesma em um padrão 
conhecido como chave grega, nome de um 
desenho decorativo encontrado em 
cerâmicas do período clássico. 
Diagrama esquemático de uma chave grega, que 
lembra os padrões geométricos de vasos gregos 
antigos. 
Quando as folhas β forem extensas, 
poderão dobrar sobre si mesmas, formando 
um barril β, uma estrutura característica 
que ocorre em várias proteínas. Além do 
barril outra interação pode ocorrer 
formando as selas. 
 
Um barril β envolvendo unidades 
βαβ alternados ocorre na triose fosfato 
isomerase muscular da galinha: 
As duas figuras são diferentes representações do 
barril β encontrado na triose fosfato isomerase, 
enzima queatua no metabolismo. 
Uma conformação de sela 
encontrada na carboxipeptidase A bovina: 
Carboxipeptidase A bovina, enzima capaz de cortar 
peptídeos na porção C-terminal. 
Proteínas Fibrosas 
Considerando os níveis terciários e 
quaternários de estrutura, foram 
designados dois grandes grupos de 
proteínas: as proteínas fibrosas, com 
cadeias polipeptídicas arranjadas em 
longos filamentos ou folhas e as proteínas 
globulares, com cadeias polipeptídicas 
dobradas sobre si mesma em forma 
globular (as interações do barril e das selas 
com as estruturas supersecundárias 
formam as proteínas globulares, como a 
carboxipeptidase A bovina). 
As proteínas fibrosas são 
constituídas de um elemento simples de 
estrutura secundária que se repete, sendo 
insolúveis em água. 
O colágeno, um componente dos 
ossos e do tecido conjuntivo, é a proteína 
mais abundante em vertebrados, sendo 
organizado em fibras insolúveis resistentes. 
Uma fibra de colágeno consiste de 
uma “tripla hélice”, com três cadeias 
polipeptídicas torcidas sobre si mesmas. 
Cada cadeia possui uma sequência 
repetida de três resíduos de aminoácidos: 
X-Pro-Gly ou X-Hyp-Gly 
Qualquer aminoácido designado por 
X pode ocupar a primeira posição e Hyp 
representa hidroxiprolina (prolina que foi 
modificada por uma enzima hidroxilante). 
Como observado, cada terceira 
posição deve ser ocupada por uma 
glicina, pois a tripla hélice está arranjada 
de modo que cada terceira resíduo esteja 
no interior da hélice e somente a glicina é 
pequena o suficiente para ficar em tal local. 
As três cadeias do colágeno são 
hélices diferentes da α-hélice e cada uma 
está torcida em volta das demais em um 
arranjo super helicoidal mantido por pontes 
de hidrogênio, envolvendo os resíduos de 
hidroxiprolina e hidroxilisina. A molécula 
helicoidal tripla é chamada de 
tropocolágeno. 
No colágeno também ocorrem 
ligações covalentes, formadas entre os 
resíduos lisina e histidina. A quantidade de 
ligações aumenta com a idade, tornando a 
carne de animais mais velhos duras. 
A tripla hélice do colágeno 
 
As α-queratinas constituem os 
pelos, cabelos, unhas, garras, penas, 
chifres, cascos e a parte externa da pele. 
Elas são formadas por uma α-hélice 
voltada para a direita. Duas fibras de α-
queratina (α-hélices), em paralelo, são 
enroladas uma sobre a outra formando uma 
espiral torcida. A torção amplifica a força 
da estrutura. As superfícies onde as duas 
hélices se tocam são formadas por 
aminoácidos hidrofóbicos (como Ala, Val, 
Leu, Ile, Met e Phe), e seus radicais se 
entrelaçam em um padrão regular. 
As α-queratinas possuem uma 
estrutura terciária simples, dominada por 
uma estrutura secundária α-helicoidal. O 
entrelaçamento de dois peptídeos α-
helicoidais forma a estrutura quaternária. 
As ligações que estabilizam a 
estrutura quaternária são as pontes de 
dissulfeto. Em α-queratinas mais duras, 
como nos chifres, até 18% dos resíduos são 
cisteínas envolvidas nessas pontes. 
A α-queratina do cabelo é uma longa α-hélice. Os 
pares destas hélices são enrolados em um sentido 
anti-horário para formar duas cadeias em espiral 
enrolada. Estas se combinam para formar os 
protofilamentos e as protofibrilas. 
Cerca de quatro protofibrilas se juntam para formar 
um filamento intermediário. 
Proteínas Globulares 
Nas proteínas globulares, 
segmentos diferentes das cadeias 
polipeptídicas se dobram uns sobre os 
outros, gerando uma forma esférica. Esse 
enovelamento garante que as proteínas 
exerçam suas diversas funções biológicas, 
como as enzimas, proteínas 
transportadoras, imunoglobulinas, etc. 
As proteínas globulares são 
formadas pelas várias estruturas 
supersecundárias já citadas 
anteriormente, que se adaptaram de acordo 
com a função biológica necessária. 
Cada proteína globular está dobrada 
de forma compacta, com seus radicais 
hidrofóbicos orientados ao centro e seus 
radicais hidrofílicos orientados para a 
superfície. As estruturas também são 
estabilizadas por pontes de hidrogênio. 
A Estrutura Terciária 
A estrutura terciária de uma proteína 
é o arranjo tridimensional de todos os 
átomos da molécula. As conformações dos 
radicais e a posição dos grupos 
prostéticos são partes dessa estrutura. 
Nas proteínas fibrosas, a estrutura 
secundária fornece muita informação a 
respeito da terciária, pois o esqueleto 
helicoidal não dobra sobre si e o único 
aspecto não especificado na estrutura 
secundária é o arranjo dos radicais. 
Nas proteínas globulares são 
necessárias mais informações, pois é 
preciso saber como as hélices e folhas 
dobram sobre si e a posição dos radicais 
e grupos prostéticos. 
Forças Envolvidas no 
Enovelamento de Proteínas: 
A ordem das estruturas secundárias 
e terciárias dependem de interações não 
covalentes; se a proteína possuir várias 
subunidades (estrutura quaternária), a 
interação entre essas subunidades também 
dependerá de interações não covalentes. 
As pontes de hidrogênio são os 
principais determinantes das estruturas 
secundárias. Essas pontes também ligam 
os radicais entre si. Resíduos apolares 
 
 
tendem a ficar no interior das proteínas por 
interações hidrofóbicas. A atração 
eletroestática entre radicais de cargas 
opostas resulta na proximidade destes. 
As pontes de dissulfeto formam 
ligações covalentes entre os radicais de 
cisteínas, restringindo o número de 
dobramentos viáveis entre as cadeias 
polipeptídicas. 
A conformação tridimensional de 
uma proteína é o resultado da interação de 
todas essas forças estabilizadoras, criando 
os diversos tipos de enovelamentos. 
Mioglobina: Exemplo de Estrutura 
Terciária e Globular 
A mioglobina é uma proteína 
globular que possui um grupo prostético, o 
grupo heme e possui uma estrutura 
compacta composta de oito α-hélices. 
As pontes de hidrogênio 
estabilizam as regiões de α-hélice e 
algumas cadeias laterais. Resíduos polares 
estão no exterior da molécula, enquanto o 
interior é composto de resíduos apolares. 
Dois resíduos polares de histidina estão no 
interior da molécula, pois interagem com o 
grupo heme. Esse grupo heme é mantido 
em posição por atrações hidrofóbicas entre 
seu anel e os radicais apolares da proteína. 
O grupo heme consiste de um íon 
metálico, o Fe (II), e uma porção orgânica, 
a protoporfirina IX. 
Uma molécula de mioglobina. Os segmentos 
helicoidais (de A a H); NH3 (N-terminal); e COOH 
(C-terminal) 
Desnaturação e 
Renaturação 
A perda de estrutura tridimensional 
suficiente para causar a perda de função é 
chamada de desnaturação. As interações 
não covalentes das proteínas são fracas, 
podendo ser facilmente desfeitas. Além 
disso, a redução das pontes de dissulfeto 
leva a uma desorganização ainda maior da 
estrutura terciária. Sob condições 
experimentais apropriadas, a estrutura 
desfeita pode ser completamente 
recuperada por meio da renaturação. 
O processo de desnaturação e 
renaturação é uma demonstração da 
relação entre a estrutura primária e as 
forças da estrutura terciária. 
A maioria das proteínas pode ser 
desnaturada pelo calor, que tem efeitos 
nas interações fracas. Uma pequena 
mudança da temperatura pode promover 
uma perda abrupta da estrutura. 
Em extremos pHs (altos/baixos), 
algumas cargas das proteínas são perdidas 
e, por isso, as interações eletroestáticas 
são reduzidas de modo drástico, 
desestabilizando a proteína nativa. 
Alguns detergentes, como o 
dodecil-sulfato de sódio (SDS), desnaturam 
as proteínas, pois tendem a desfazer as 
interações hidrofóbicas e se eles 
possuírem cargas elétricas ainda podem 
desfazer as interações eletroestáticas. 
Outros reagentes e solutos, como a 
ureia e o hidrocloreto de guanidina, 
formam pontes de hidrogênio com a 
proteína, que são mais fortes que os que 
ocorrem nela, desfazendo assim os já 
existentes e as interações hidrofóbicas. 
O mercaptoetanol é utilizado para 
reduzir as pontes de dissulfeto, formando 
dois grupos sulfidrila. Em geral adiciona-se 
ureia à mistura da reação para facilitaro 
dobramento da proteína, e para aumentar a 
acessibilidade dos dissulfetos ao redutor. A 
conformação nativa da proteína poderá 
ser recuperada (renaturação) quando o 
mercaptoetanol e a ureia forem removidos. 
 
 
 
A Estrutura Quaternária 
A estrutura quaternária é uma 
propriedade das proteínas constituídas por 
mais de uma cadeia polipeptídica 
(subunidade). 
Proteínas com várias subunidades 
são muito comuns por várias razões. Em 
grandes arranjos de proteínas, como nas 
fibrilas de colágeno é mais vantajoso ter 
várias subunidades do que uma grande 
cadeia polipeptídica, pois os defeitos 
podem ser reparados simplesmente 
substituindo-se a subunidade defeituosa 
em vez de toda a proteína. 
Nas enzimas, aumentar o tamanho 
de uma enzima pela associação de 
unidades idênticas é mais eficiente do que 
aumentar o comprimento de sua cadeia 
polipeptídica, uma vez que cada 
subunidade tem um sítio ativo. 
A Interação entre as Subunidades 
Uma proteína pode ser constituída 
por cadeias polipeptídicas idênticas ou 
não. Proteínas com subunidades idênticas 
são chamadas de oligômeros, e tais 
subunidades idênticas são chamadas de 
protômeros. 
A hemoglobina, por exemplo é um 
dímero (oligômero de dois protômeros). 
Desse modo, a hemoglobina consiste em 
duas cadeias α e duas cadeias β, 
formando a composição α2β2. Cada cadeia 
α tem 141 resíduos de aminoácidos e cada 
cadeia β tem 146 resíduos. 
Importante: neste caso α e β não se referem às 
estruturas secundárias. As letras gregas são 
usadas para distinguir dois tipos diferentes de 
subunidades de uma proteína com múltiplas 
subunidades. 
As subunidades interagem entre si 
de maneira não covalente. Como 
resultado, mudanças sutis na estrutura da 
proteína podem causar mudanças 
drásticas nas propriedades. Proteínas que 
exibem essa propriedade são chamadas 
alostéricas. 
Representação da estrutura quaternária de uma 
desóxi-hemoglobina (hemoglobina sem as 
moléculas de oxigênio ligadas ao grupo heme) na 
forma de fitas, relevando os elementos estruturais 
secundários da estrutura e a posição dos grupos 
heme. As subunidades α estão em tons de cinza e 
as subunidades β estão em tons de azul. 
Purificação e Análise de 
Proteínas 
As proteínas purificadas são 
essenciais para o exame detalhado de suas 
propriedades físicas. 
A fonte de uma proteína é 
geralmente um tecido ou uma célula 
microbiana. Desse modo, a primeira etapa 
de qualquer procedimento de purificação de 
proteínas é romper suas células, liberando 
suas proteínas em uma solução chamada 
de extrato bruto. Pode ser utilizada a 
centrifugação diferencial para preparar 
frações subcelulares ou para isolar 
organelas específicas. 
Centrifugação diferencial de um tecido 
Um outro método é a cromatografia 
que pode ser por adsorção ou por camada 
fina. Ambas utilizam um tecido inicial e este 
é levado a uma solução de metanol/água e 
clorofórmio que dissolve lipídeos e 
carboidratos, apenas restando as 
proteínas. 
Na cromatografia de adsorção as 
separações ocorrem através de interações 
eletrostáticas e pontes de hidrogênio entre 
a fase estacionária (sólido) e os 
componentes a separar da fase móvel 
(liquido). A adsorção se refere a um 
fenômeno onde uma substância se 
acumula na superfície de um outro material, 
portanto, no final do processo diferentes 
proteínas terão sido separadas. 
Na cromatografia de camada fina, 
a solução de solventes orgânicos 
(metanol/água e clorofórmio) e proteínas é 
aplicada em uma placa revestida por uma 
camada fina de adsorvente. As diferentes 
proteínas percorrem sobre essa placa de 
várias maneiras, sendo possível a 
separação. 
 
Tomando como base a centrifugação 
diferencial, uma vez que o extrato bruto 
está finalizado, vários métodos (além dos 
dois anteriores) estão disponíveis para 
purificar as proteínas nele contidas. Em 
geral o extrato é submetido a um 
fracionamento para separar as proteínas. 
Um método de fracionamento pode 
ser pela adição de alguns sais nas 
proteínas, pois a solubilidade delas é 
reduzida na presença de sais pelo efeito de 
salting out e, desse modo, algumas 
proteínas podem precipitar, enquanto 
outras permanecem na solução. As 
proteínas precipitadas são removidas da 
solução por centrifugação. 
A diálise é um procedimento que 
separa proteínas de solutos pequenos se 
aproveitando do tamanho maior das 
proteínas e pode ser utilizada para remover 
os sais utilizados na preparação proteica. 
Os métodos mais eficientes utilizam 
a cromatografia em coluna, que se utiliza 
das diferenças nas cargas das proteínas, 
tamanho, afinidade de ligação e outras 
propriedades. Um material sólido poroso 
(face estacionária) é mantido em uma 
coluna, e uma solução tamponada (fase 
móvel) migra através dela. A proteína, 
dissolvida na solução tampão, é colocada 
no topo da coluna, atravessando a matriz 
sólida e se diferenciando de acordo com as 
propriedades diferentes entre proteínas. 
Cromatografia em coluna 
A cromatografia por gel filtração 
(de exclusão por tamanho), separa as 
proteínas de acordo com o tamanho. Neste 
método, as proteínas grandes emergem da 
coluna mais cedo do que as menores. A 
fase sólida consiste em grânulos de 
polímeros com poros projetados com um 
determinado tamanho. Proteínas grandes 
não entram nesses poros e, desse modo, 
tomam o caminho mais curto e mais rápido. 
Proteínas pequenas tomam penetram nos 
poros e são retardadas em seu caminho de 
labirintos pela coluna. 
 
A cromatografia de afinidade se 
baseia na afinidade de ligação. Os grânulos 
da coluna têm um grupo químico ligado 
covalentemente chamado de ligante. 
Quando uma mistura de proteínas é 
adicionada à coluna, qualquer proteína com 
afinidade para esse ligante se liga aos 
grânulos, e sua migração através da matriz 
é retardada. Após a lavagem das proteínas 
que não se ligam na coluna, a proteína 
ligada é eluida por uma solução contendo 
uma alta concentração de sal ou um ligante 
livre. O sal enfraquece a ligação iônica da 
proteína ao ligante. O ligante livre compete 
com o ligante ligado aos grânulos, liberando 
a proteína da matriz. 
Além dessas cromatografias, 
também pode ocorrer uma cromatografia 
de troca iônica, que explora as diferenças 
no sinal e magnitude da carga elétrica final 
de proteínas em determinado pH. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia de afinidade 
Eletroforese 
Outra técnica de separação de 
proteínas se baseia na migração de 
proteínas carregadas em um campo 
elétrico, a eletroforese. Sua vantagem é 
que as proteínas podem ser visualizadas, 
bem como separadas, permitindo ao 
pesquisador estimar o número de proteínas 
diferentes em uma mistura ou o grau de 
pureza de uma preparação proteica 
específica. Além disso, ela pode determinar 
o ponto isoelétrico (pI) das proteínas e 
estimar sua massa molecular. 
A eletroforese é realizada em géis de 
poliacrilamida. O gel de poliacrilamida 
age como uma peneira molecular, 
retardando a migração de proteínas em 
proporção à sua razão carga-massa e sua 
forma. 
 
Um método empregado para estimar 
a pureza e massa molecular utiliza o 
detergente dodecil sulfato de sódio (SDS). 
Aproximadamente uma molécula de SDS 
será ligada para cada resíduo de 
aminoácido. Um SDS contribui para tornar 
a carga da proteína insignificante e 
negativa e para tornar a forma das 
proteínas a mesma em todos (semelhante 
a um bastonete). Assim, o SDS separa as 
proteínas quase exclusivamente com base 
em sua massa molecular. 
 
Após a eletroforese, as proteínas 
são visualizadas pela adição de um 
corante, que se liga as proteínas, mas não 
ao gel em si. Um pesquisador pode 
monitorar o progresso da purificação à 
medida que o número de bandas de 
proteína visíveis ao gel diminui após cada 
fase de fracionamento. Quando comparada 
às posições para as quais as proteínas de 
massa molecular igual migram no gel, a 
posição de uma proteína não identificada 
pode fornecer uma boa estimativa de sua 
massa molecular. 
Estimando a massade uma proteína 
Proteínas-padrão de massa molecular conhecida 
podem ser usadas para estimar a massa molecular 
de uma proteína desconhecida (entre 31 e 45) 
 
A focalização isoelétrica é um 
procedimento utilizado para determinar o pI 
de uma proteína. Um gradiente de pH é 
estabelecido permitindo-se que uma 
mistura de ácidos e bases de baixo peso 
molecular se distribua em um campo 
elétrico gerado ao longo do gel. Ao serem 
aplicadas, as proteínas migram até 
alcançar o pH correspondente ao seu pI. 
Proteínas com ponto isoelétrico diferente 
são, assim, distribuídas de modo 
diferente ao longo do gel. 
Eletroforese 
Diferentes amostras são colocadas 
em poços no topo do gel. As 
proteínas se movem para o gel 
quando um campo elétrico é 
aplicado 
Focalização isoelétrica 
 
A combinação da focalização 
isoelétrica com a eletroforese SDS criou a 
eletroforese bidimensional. Esse 
processo separa proteínas de massa 
molecular idêntica que diferem em seu pI, 
ou ainda separa proteínas com valores de 
pI semelhantes, mas com massa diferente: 
Vale ressaltar que a eletroforese 
bidimensional tem um papel extremamente 
importante na medicina, pois é possível 
fazer uma comparação de amostras por 
eletroforese bidimensional e se houver 
diferenças de migração das proteínas pode 
indicar uma doença. 
Diferenças de migração podem indicar doenças 
 
ELISA 
Um Elisa (do inglês enzyme-linked 
immunosorbent assay, ou ensaio 
imunossorvente ligado a enzima) pode ser 
usado para fazer uma triagem rápida da 
quantidade de antígeno em uma amostra. 
O antígeno é adsorvido em uma superfície 
inerte. A superfície é lavada com uma 
solução de uma proteína não específica 
para bloquear a adsorção das proteínas 
introduzidas depois aos locais vazios da 
placa. A superfície é então tratada com 
solução contendo o anticorpo primário 
(contra o antígeno). Anticorpos não ligados 
são removidos por lavagem, e a superfície 
é tratada com uma solução contendo o 
anticorpo secundário (contra o anticorpo 
primário) ligado a uma enzima que catalisa 
uma reação que faz um produto colorido. 
Após a remoção do anticorpo secundário 
não ligado, é adicionado o substrato da 
enzima que cria a cor. A intensidade da cor 
é proporcional à concentração do 
antígeno. 
 
 
 
Cristalografia 
Para a resolução da estrutura de 
uma proteína por meio da cristalografia de 
raios x, primeiro ela é precipitada sob 
condições que formam grandes cristais 
bem ordenados. Os cristais montados em 
capilares de quartzo são primeiramente 
irradiados com raios x monocromáticos 
para confirmar que eles são proteicos. 
Então, os cristais podem ser congelados no 
nitrogênio líquido para coleta de dados de 
alta resolução.