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S97 Diagnóstico e teste de sensibilidade para Staphylococcus aureus resistente à meticilina na América Latina RESUMO As estratégias para monitoração e controle da propagação das infecções por Staphylococcus aureus resis- tente à meticilina (MRSA) dependem de um diagnóstico acurado e oportuno de MRSA, tanto no hospital como na comunidade. Na América Latina existe diversidade significativa nos procedimentos diagnós- ticos e nos testes de sensibilidade, nos níveis regional, nacional e local. São vários os testes para MRSA disponibilizados na clínica, mas a aplicação desses testes difere entre países e dentro do mesmo país, e as medidas de controle de qualidade não são uniformemente aplicadas para a verificação dos diagnósticos. Para que os diagnósticos de infecções por MRSA na América Latina sejam otimizados, faz-se necessária uma abordagem mais consistente. Essa abordagem pode consistir de: adoção e adaptação apropriada das recomendações específicas para testes de MRSA, dependendo dos recursos locais; estabelecimento de um sistema coordenado para controle de qualidade; acesso regional às instituições centrais de referência; educação dos profissionais médicos e paramédicos para as melhores práticas; e desenvolvimento de siste- mas objetivando avaliar a implementação de orientações e das melhores práticas. Palavras-chave: MRSA, diagnóstico, teste de sensibilidade, América Latina. INTRODUÇÃO Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é causa importante de infecções em ní- vel global, e é um problema cada vez mais pre- mente em toda América Latina.1-3 Estudos epide- miológicos na região computaram uma elevação significativa nas infecções por MRSA, tanto nos hospitais como na comunidade.1 Um passo im- portantíssimo no tratamento bem-sucedido des- sas infecções é o diagnóstico precoce e acurado. Na clínica, o diagnóstico se baseia em uma com- binação de informações epidemiológicas, sintomas clínicos e na caracterização da linhagem infecciosa de MRSA. A Rede de Monitoração/Vigilância para Re- sistência aos Antibióticos, estabelecida com o apoio da Organização Pan-Ameri cana de Saúde (OPAS), fornece informações epidemiológicas sobre resistên- cia bacteriana para toda a América Latina. Alguns países, como Argentina, Chile, Equador, Uruguai e Venezuela, contam com um controle de qualidade organizado para auxiliar a vigilância local; mas, em outros, a capacidade de formulação de diagnósti- cos microbiológicos fica limitada a um punhado de hospitais universitários de grande porte nas cidades principais. Ressalte-se ainda que essas regiões contri- buem com poucos dados, especialmente os relativos a MRSA adquirido na comunidade. Foram publicadas várias recomendações in- ternacionais com sugestões para melhores práti- cas no diagnóstico e tratamento de MRSA. Mas a adoção dessas recomendações pode ser espo- rádica, especialmente em nível regional, onde os recursos podem ser fator limitante significativo. Quase todas as recomendações oferecem uma gama de opções para diagnóstico de MRSA que podem ser adaptadas para as variadas necessida- des regionais. Mas nem sempre estarão definidos quais os testes mais apropriados e suficientes em circunstâncias específicas. Portanto, há necessida- de de novas orientações, para que haja consistên- cia da abordagem nessa região. RECOMENDAÇÕES PARA O DIAgNÓSTICO DE MRSA Já foram publicados documentos normativos em diversos países com delineamento dos proto- Autores Jeannete Zurita1 Carlos Mejía2 Manuel Guzmán- Blanco3 Representando o Grupo de Trabalho Latino-Americano de Resistência de Gram- Positivos 1Hospital Vozandes, Quito, Equador. 2Hospital Roosevelt, Guatemala City, Guatemala. 3Centro Médico de Caracas, Caracas, Venezuela. Correspondência para: Jeannete Zurita, Directora del Servicio de Microbiología y Tuberculosis, Hospital Vozandes, Villalengua Oe2-37 - Quito, Equador Telefone: +593-2- 2262142 Fax: +593-2-2269234 E-mail: jzurita@hcjb. org.ec S98 Diagnóstico de MRSA na América Latina colos e procedimentos recomendáveis para a identificação de MRSA (Tabela 14-9). Nos Estados Unidos, o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais; ex-National Committee on Clinical Laboratory Standards, NCCLS - Comissão Nacional de Pa- drões para Laboratórios Clínicos) formulou uma série de documentos para a melhor prática, abrangendo todos os aspectos dos testes microbiológicos, inclusive publicações recentes intituladas “Padrões de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana”4 e “Vigilância para Staphylo- coccus aureus Resistente à Meticilina: Princípios, Práticas e Desafios”.5 O Sistema Europeu de Vigilância da Resistência Antimi- crobiana (EARSS), patrocinado pela Comissão Europeia, ofe- rece um sistema abrangente de vigilância e informação sobre a propagação da resistência antimicrobiana na Europa. EARSS publicou protocolos para a realização de testes diagnósticos de vários microrganismos com traços de resistência a antimi- crobianos, inclusive MRSA, VISA e VRSA.6,10 Nessa mesma linha, a Sociedade Espanhola de Infectologia e Microbiologia Clínica (SEIMC), localizada na Espanha, publicou recomen- dações para a identificação de diversas linhagens bacterianas com resistência antimicrobiana, inclusive MRSA.7 Na Inglaterra, a British Society for Antimicrobial Chemo- therapy (BSAC) publicou suas primeiras recomendações sobre testes de sensibilidade microbiana em 1991, inclusive pontos de corte para concentração inibitória mínima (MIC) para bactérias clinicamente relevantes. Mais recentemente, essa entidade publicou métodos padronizados para testes de sensibilidade em disco para diversos microrganismos, inclusi- ve MRSA.8 Recentemente, um Grupo de Trabalho Misto for- mado pela BSAC, Sociedade de Infecções Hospitalares (HIS) e Associação de Enfermeiras Especializadas em Controle das Infecções (ICNA) publicou recomendações com base em evi- dência sobre o diagnóstico laboratorial de MRSA,9 consistin- do de recomendações para a identificação de MRSA e para métodos de triagem e de testes de sensibilidade. Considerando que as diversas recomendações diferem em seus objetivos e detalhamento, e que geralmente essas recomendações não se aplicam especificamente a infecções na América Latina, as equipes de controle de infecções são orientadas a escolher as recomendações a serem seguidas, devendo adaptá-las à situação local, levando em conta fato- res como epidemiologia, antibióticos e recursos disponíveis, origens prováveis das infecções e fatores de risco associados à população de pacientes e a ambientes específicos. A maio- ria dos países da América Latina optou pelas recomendações do CLSI. São importantes também a avaliação da imple- mentação das recomendações e a educação dos profissionais da saúde, para que haja garantia de manutenção consistente das melhores práticas. IDENTIFICAÇÃO DE S. AUREUS S. aureus é causa de grande variedade de infecções clínicas, resultando na invasão direta de bactérias em diferentes ór- gãos e na subsequente lesão aos tecidos. As manifestações clínicas da infecção são decorrentes da liberação de diver- sas toxinas, em nível local ou sistêmico, envolvendo várias doenças, dependendo da localização da infecção (Tabela 2). No caso de infecções localizadas, frequentemente será suficiente um diagnóstico clínico, sem a necessidade de aná- lise de culturas. Mas para as infecções sistêmicas, terá fun- damental importância a detecção adequada e imediata das linhagens de S. aureus e de sua sensibilidade a diferentes an- Tabela 1. Normas para diagnóstico de MRSA4-9 Origem recomendações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais] Padrões de Desempenhopara Testes de Sensibilidade Antimicrobiana4 Vigilância de Staphylococcus aureus resistente à meticilina: Princípios, Práticas e Desafios5 European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) [Sistema Europeu de Vigilância da Resistência Antimicrobiana] Protocolos novos e atualizados para testes de sensibilidade antimicrobiana de patógenos sob vigilância do EARSS 20056 Sociedad Española de Infectologia y Microbiologia Clinica (SEIMC) [Sociedade Espanhola de Infectologia e Microbiologia Clínica] Protocolos de diagnóstico em Microbiologia7 British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) [Sociedade Britânica de Quimioterapia Antimicrobiana] Método padronizado de teste de sensibilidade em disco da BSAC (versão 7)8 Grupo de Trabalho Misto da British Society for Antimicrobial Chemotherapy [Sociedade Britânica de Quimioterapia Antimicrobiana], Hospital Infection Society [Sociedade de Infecções Hospitalares] e Infection Control Nurses Association [Associação de Enfermeiras Especializadas em Controle das Infecções] (BSAC/HIS/ICNA) Recomendações para diagnóstico laboratorial e testes de sensibilidade de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)9 S99 Zurita, Mejía, Guzmán-Blanco Braz J Infect Dis 2010; Vol 14 (Suppl 2):S97-S107 Tabela 2. Manifestações clínicas da infecção por S. aureus Origem da infecção Doença Pele e tecido mole Impetigo, furúnculos, carbúnculos, abscessos, celulite, fasciite, piomiosite, infecções em feridas cirúrgicas e traumáticas Associada a corpo estranho Cateter intravascular, cateter urinário Intravascular Bacteremia, sepse, tromboflebite séptica, cardite infecciosa Ossos e articulações Osteomielite séptica, artrite séptica Trato respiratório Pneumonia, empiema, sinusite, otite média Outras infecções invasivas Meningite, infecção de espaço cirúrgico Doença mediada por toxina Choque tóxico estafilocócico, intoxicação alimentar, síndrome da pele escaldada estafilocócica, impetigo bolhoso, pneumonia necrosante, osteomielite necrosante Tabela 3. Métodos para identificação de isolados de S. aureus Princípio Método Considerações Teste: Coagulase A coagulase produzida por certos cocos Gram-positivos, inclusive S. aureus em forma ligada (aderida à parede celular bacteriana) ou como enzima livre, converte fibrinogênio em fibrina insolúvel na presença de plasma, resultando em coagulação Teste em tubo Detecta coagulase livre Suspensão bacteriana adicionada a plasma de coelho diluído; incubação a 37º C A coagulase livre faz com que o plasma coagule, formando um gel, habitualmente dentro de 4 h Teste em tubo Algumas espécies de estafilococos não comumente detectadas em isolados humanos (p. ex., S. schleiferi e S. intermedius) podem resultar em teste positivo Ocasionalmente, S. aureus raros podem resultar em teste negativo Algumas linhagens precisam de até 24 h de incubação Os testes não devem ser incubados por mais de 24 h A presença de coagulase diferencia S. aureus de estafilococos coagulase-negativos (CoNS) Teste da lâmina Detecta coagulase ligada à célula Suspensão de bactérias misturadas com plasma sobre uma lâmina A presença de coagulase ligada provoca rápida aglutinação dos cocos (5-10 s) Teste em lâmina Resultado rápido 10%-15% das linhagens de S. aureus resultam em teste negativo Algumas outras espécies de estafilococos resultam em teste positivo (p. ex., S. schleiferi, S. lugdunensis) Teste: Aglutinação em látex Proteínas na superfície de S. aureus (p. ex., proteína A, antígenos específicos de grupo do fator de aglutinação, polissacarídeos capsulares) são identificadas por esferas de látex específicas, resultando em agregação Suspensão bacteriana de S. aureus misturada com esferas de látex específicas A agregação resulta em “limpeza” do meio de fundo Foram comercializados kits de aglutinação em látex específicos para S. aureus (p. ex., Staphaurex, Staphaurex Plus; Wellcome Diagnostics, Inglaterra) Detectam tanto MSSA como MRSA Sensibilidade > 98% para todas as linhagens de S. aureus Teste rápido e barato Algumas espécies de estafilococos podem resultar em teste positivo (p. ex., S. schleiferi, S. lugdunensis) Teste: Catalase S. aureus produz catalase em abundância, que pode interagir com peróxido de hidrogênio, resultando na produção de oxigênio Peróxido de hidrogênio a 3% adicionado a colônias em placa de ágar Colônias catalase-positivas produzem oxigênio; ocorre formação quase imediata de bolhas Resultado rápido e barato Diferencia cocos produtores de catalase (p. ex., estafilococos) de não produtores (p. ex., estreptococos) Não pode ser realizado em ágar-sangue, porque sangue contém catalase S100 Teste: Ágar-sal-manitol (MSA) As linhagens de S. aureus crescem bem em ambiente com alto teor de Staphylococcus aureus, sendo capazes de fermentar manitol para produzir ácido, que pode ser detectado com o uso de um indicador de pH Bactérias plaqueadas sobre MSA consistindo de manitol, ~ 7,5%-10% de sal e vermelho fenol, um indicador de pH Estafilococos patogênicos, como S. aureus, crescem bem em ambiente rico em sal, virando o MSA para o amarelo mediante liberação de ácido Habitualmente detecta MRSA and MSSA MSA pode ser suplementado com outros antibióticos, inclusive cefoxitina, para triagem de MRSA Teste: Sensibilidade à polimixina B e novobiocina Polimixina B é um antibiótico detergente catiônico específico para bacilos Gram-negativos Discos de polimixina B (10 U) adicionados à placa de ágar S. aureus é resistente à polimixina B Discos de polimixina B e novobiocina são relativamente baratos e de fácil uso Devem ser utilizados como parte de uma série de testes diagnósticos para S. aureus Novobiocina é um antibiótico aminocumarínico que pode ser utilizado para diferenciar S. aureus de alguns CoNS Discos de novobiocina (5 μg) adicionados à placa de ágar S. aureus e alguns CoNS (p. ex., S. epidermis) são sensíveis à novobiocina, enquanto a maioria dos demais CoNS (p. ex., S. saprophyticus) é resistente Teste: DNase e nucleases termoestáveis Identificação de S. aureus com base na detecção de DNase específica e de nucleases termoestáveis comuns às linhagens de S. aureus Os métodos são: teste antinuclease para medir anticorpo antinucleases comuns a todas as linhagens de S. aureus, e difusão em ágar metacromático para nucleases termoestáveis Alguns CoNS raros podem ser positivos em testes de nuclease termoestável S. aureus pode ser detectado em placas com desoxirribonuclease (DNase) utilizadas na triagem de isolados Considerando que CoNS produz quantidades variáveis de DNase, os positivos devem ser confirmados com um teste adicional Teste: Métodos automatizados Os sistemas automatizados utilizam uma bateria de testes para obter identificação de S. aureus Os sistemas comerciais são: VITEK/VITEK2 (bioMerieux®) Phoenix (BD Biosciences) Microscan (Dade Behring) Conveniente e confiável para S. aureus Problemas de recursos limitam seu uso em laboratórios de menor porte Teste: Métodos moleculares S. aureus contém vários genes, permitindo sua diferenciação de outras espécies estafilocócicas Os métodos são PCR (simples, multiplex e em tempo real), sequenciamento do DNA, e técnicas baseadas em hibridização Os genes específicos para espécie comumente utilizados são nuclease (nuc), coagulase (coa), proteína A (spa), femA e femB, Sa442, e 16S rRNA específico de S. aureus Robusto e de simples realização Muitos laboratórios locais não possuem instalações/equipamento para abordagens moleculares tibióticos, para a implementação do tratamento apropriado e iníciodas medidas de controle relevantes. Tipicamente, consegue-se uma rápida avaliação ini- cial de amostras clínicas com o uso da microscopia con- vencional; nesse exame, os estafilococos têm o aspecto de cocos Gram-positivos arredondados que crescem em grupos. É importante distinguir isolados de S. aureus de outras espécies estafilocócicas, como estafilococos coagu- lase-negativos (CoNS); contamos com vários testes para essa diferenciação (Tabela 3). Embora alguns desses testes possam ser utilizados de maneira intercambiável nas cir- cunstâncias apropriadas, microbiologistas e profissionais da saúde devem tomar ciência dos benefícios e limitações relativas de cada um, para que possam extrair as conclu- sões apropriadas. São vários os fatores que influenciam a escolha dos testes de identificação de S. aureus utilizados em determinada situ- ação: custo, rapidez do resultado, instalações disponíveis, sensibilidade e especificidade. As orientações conjuntas da BSAC/HIS/ICNA9 recomendam o uso de um teste de aglu- tinação de coagulase ou látex em tubo para a identificação rotineira de S. aureus, ou para a confirmação depois dos tes- tes de DNase, ou ainda em seguida a resultados negativos em um teste de coagulase em lâmina. Diagnóstico de MRSA na América Latina S101 Embora a leitura do teste em lâmina seja muito mais rápi da, em comparação com o teste em tubo (15 s vs. 4-24 h), o teste em lâmina exibe percentual maior de falso-negativos (~15%). Consequentemente, o teste em tubo é considerado como sendo mais definitivo; por isso é o teste de coagulase preferido para identificação de S. aureus. Em circunstâncias nas quais os clínicos dependem de uma avaliação rápida de MRSA, um teste de coagulase em lâmina pode ser confirmado pela aglutinação em látex, por abordagens automatizadas ou por testes moleculares. Um estudo multicêntrico internacional para avaliação de diver- sos kits comerciais de aglutinação para identificação de S. aureus com o uso de 892 isolados estafilocócicos conseguiu detectar S. aureus de maneira confiável (> 98% de sensibi- lidade e > 98% de seletividade para Slidex Staph Plus).11 Os testes automatizados possibilitam níveis de acurácia pare- cidos para identificação de S. aureus, sendo utilizados por toda a América Latina; mas esses testes talvez não estejam disponíveis em centros locais de menor porte. Há abordagens mais sofisticadas à especiação de estafi- lococos permitindo a identificação da maioria das espécies, mas essas abordagens tendem a envolver baterias com maior número de testes. Em um estudo realizado no Brasil, Iorio et al.12 demonstraram um esquema para identificação rápida de Tabela 4. Testes de sensibilidade de MRSA4,5,8,9,13-20 Princípio Método recomendado Considerações Teste: Difusão em disco (Kirby-Bauer) Discos contendo agente antimicrobiano colocados na superfície da placa de ágar inoculada com suspensão bacteriana; avaliação da zona de inibição em torno das colônias Difusão em disco4,8,9 NaCl 2% em ágar MH ou Columbia Incubação a 30-35°C durante ≥ 24 h Os discos de cefoxitina são mais confiáveis que os discos de oxacilina.13,14,26,27 A zona para oxacilina ou cefoxitina deve ser lida segurando a placa sobre uma fonte luminosa Algumas linhagens demonstram heterorresistência, que fica evidenciada como uma zona interna no interior de uma zona maior de inibição Nos discos com oxacilina, alguns hiperprodutores de penicilinase não resultam em zona de inibição, e serão incorretamente informados como MRSA Teste: Determinações da MIC depois da diluição do antibiótico em caldo ou ágar Crescimento em diferentes diluições do agente antimicrobiano em caldo ou ágar, para obtenção da MIC Caldo4 NaCl 2% em caldo MH + oxacilina ou cefoxitina Inóculo de 5×105 ufc/mL Incubação a 33-35°C durante 24 h Ágar4,8,9 Testes em ágar MH ou Columbia com NaCl 2% + oxacilina Inóculo de 104 ufc/mL Incubação a 30-35ºC durante 24 h Relativamente barato Mais incômodo do que a difusão em disco e os métodos Etest e de aglutinação em látex Teste: Etest Etest® (bioMerieux), consistindo de tiras plásticas contendo um gradiente pré-definido de 15 concentrações de antibióticos Etest15-18 NaCl 2% em ágar MH Densidade do inóculo equivalente a 0,5- 1,0 padrão de McFarland Incubação a 35°C durante 24 h Tiras depositadas na placa de ágar; crescimento avaliado ao longo do gradiente, para determinar MIC De fácil implementação Não é muito utilizado na América Latina, por causa do custo Teste: Triagem em placa Placas de ágar para triagem Triagem em placa4 NaCl 4% em ágar MH + oxacilina 6 mg/L Densidade do inóculo equivalente a 0,5 padrão de McFarland Incubação a ≤ 35°C durante 24 h > 1 colônia indica resistência Barato, confiável Recomendado para triagem e confirmação de resistência identificada pela difusão em disco Teste: Detecção de PBP2a por aglutinação em látex Zurita, Mejía, Guzmán-Blanco Braz J Infect Dis 2010; Vol 14 (Suppl 2):S97-S107 S102 Linhagens de MRSA produzem proteína 2a ligadora de penicilina (PBP2a) PBP2a extraída de uma suspensão de colônias Partículas de látex revestidas com anticorpos monoclonais anti-PBP2a, adicionadas para extração A presença de PBP2a provoca aglutinação das partículas A adição de penicilina pode induzir a produção de PBP2a, resultando em uma reação mais forte Disponível também em formato de lâmina Método rápido, barato e confiável para detecção de MRSA Adequado para confirmação de resistência Isolados produtores de pequenas quantidades de PBP2a podem resultar em fracas reações de aglutinação, ou podem aglutinar lentamente Alguns isolados raros de MRSA podem resultar em teste negativo Pode não ser confiável para colônias crescidas em meios contendo NaCl Teste: Ágar cromogênico Ágares cromogênicos específicos para MRSA, permitindo detecção rápida de colônias por meio de reações coloridas Vários ágares comercializados,19,20 como: S. aureus ID (bioMérieux) CHROMagar MRSA (CHROM agar) Chromogenic MRSA Agar (Oxoid) Ágares cromogênicos podem ter alta sensibilidade para MRSA (> 98%) Apropriados para triagem rápida de MRSA Teste: Métodos automatizados Os sistemas automatizados utilizam uma bateria de testes para efetuar uma abordagem conveniente e frequentemente rápida à identificação de S. aureus e MRSA Sistemas comercializados VITEK GPI (bioMerieux®) Phoenix (BD Biosciences) Microscan (Dade Behring) Convenientes e confiáveis para S. aureus Podem ser identificados alguns falso- positivos Esses métodos podem ser utilizados para detecção de MRSA, mas não detectam VRSA Teste: Métodos moleculares Linhagens de MRSA possuem o gene mecA, que codifica a proteína 2a ligadora de penicilina (PBP2a) Os métodos são: PCR (simples, multiplex e em tempo real), sequenciamento de DNA e técnicas baseadas em hibridização A detecção de mecA para resistência à meticilina é combinada com genes específicos para espécie, como: genes de nuclease (nuc), coagulase (coa), proteína A (spa), femA e femB, Sa442, 16S rRNA de proteína ligadora de fibrinogênio Robustos e de simples execução Caracterização rápida e inequívoca de MRSA Método de referência de escolha para confirmação de MRSA Pode detectar ocasionais linhagens sensíveis contendo um mecA não funcional ou não expressado Problemas com recursos reduzem seu uso mais amplo 198 isolados estafilocócicos (inclusive 17 de S. aureus) utilizan- do uma bateria simplificada de testes fenotípicos. Inicialmente, os estafilocócicos foram identificados pela coloração de Gram, teste da catalase, produção de ácido a partir da glicose no meiobásico OF de Hugh e Leifson e sensibilidade à bacitracina. Em seguida, foram utilizados nove testes fenotípicos para diferen- ciar as espécies estafilocócicas; os autores obtiveram 98,5% de acurácia para as espécies (100% para S. aureus) em 72 h. Es- ses esquemas podem ter utilidade em laboratórios de rotina e, particularmente, nos países em desenvolvimento, onde custos e recursos sejam aspectos significativos. Testes de sensibilidade à meticilina Há muitas opções para testar a sensibilidade de S. aureus à meticilina – difusão em disco, determinações de MIC (em caldo ou por Etest), ágar cromogênico, aglutinação em látex, métodos automatizados, métodos rápidos de triagem e abor- dagens moleculares (veja a Tabela 44,5,8,9,13-20 para detalhes). Para métodos que utilizam meios de cultura, as condições de teste (p. ex., tipo de meio e tempos e temperatura de in- cubação) desempenham papel importante na determinação do resultado dos testes de sensibilidade à meticilina, o que se reflete em muitas das recomendações publicadas. Esses fato- res devem ser cuidadosamente considerados no planejamento dos testes apropriados. BSAC recomenda ágar Colúmbia ou Mueller Hinton suplementado com NaCl (2%) para métodos de diluição e de difusão em disco,4,8 e foi demonstrado que a adição de até 5% de NaCl ao meio melhora a detecção da resistência para a maioria das linhagens.21,22 Tipicamente, a resistência à meticilina é detectada de maneira mais confiável em temperaturas mais baixas (30-35º C),23-25 embora algumas linhagens raras possam crescer lentamente a 30º C na pre- sença de 5% de NaCl. Tanto CLSI como BSAC recomendam Diagnóstico de MRSA na América Latina S103 tempos de incubação de 24 h,4,8 mas, para algumas linhagens heterógenas, subpopulações resistentes podem crescer mais lentamente; nesse caso, talvez haja necessidade de incubações de 48 h para melhorar a detecção. Atualmente, cefoxitina passou a ser o antibiótico de es- colha para os testes de sensibilidade à meticilina, e a própria meticilina não é mais fabricada. Oxacilina permanece como segunda opção, mas diversas publicações demonstraram que cefoxitina é mais confiável que oxacilina.13,14,26,27 Na América Latina, a metodologia utilizada para identi- ficação de MRSA difere, dependendo do país. O método de difusão em disco, utilizando discos de oxacilina ou cefoxiti- na, goza de popularidade em alguns países, enquanto as ti- ras Etest são geralmente consideradas muito caras para uso rotineiro. Testes de confirmação, como o teste em placa para triagem de meticilina, não são amplamente utilizados, e a análise molecular de linhagens de MRSA fica restrita a pou- cos centros no Brasil, Argentina, Chile, México e Colômbia. Em casos de surtos nosocomiais, habitualmente assume-se a identidade de linhagens de MRSA com base no padrão fe- notípico de resistência a antibióticos. Muitos laboratórios na América Latina utilizam métodos automatizados; esses méto- dos oferecem uma abordagem conveniente e, em alguns casos, rápida, para identificação de MRSA. O sistema VITEK GPI e o sistema VITEK2 (Biomerieux®), que é mais recente, e os sis- temas Microscan® Rapid POS COMBO (Dade/Microscan) e P hoenix (BD Biosciences) são, todos, amplamente utilizados na detecção de MRSA. Brevemente, o sistema Vitek incluirá um teste de triagem para sensibilidade à vancomicina. As orientações conjuntas da BSAC/HIS/ICNA9 recomen- dam que “deve ser utilizado um método padronizado e valida- do, como os publicados pela BSAC ou pelo CLSI, para os testes rotineiros para sensibilidade de S. aureus”, mas que “outros testes devem ser considerados como aceitáveis, caso resultem em desempenho equivalente ou melhor”. A difusão em disco, a determinação da MIC e a aglutinação em látex são métodos suficientes e acessíveis para a realização dos testes rotineiros de sensibilidade à meticilina. Pode-se utilizar também como método de confirmação a aglutinação em látex, para detec- tar proteína 2a ligadora de penicilina (PBP2a). A detecção rápida de MRSA é especialmente importante em cenários nos quais haja necessidade da rápida tomada de medidas preventivas ou terapêuticas; por exemplo, em unidades de terapia intensiva e em algumas intervenções cirúrgicas que dependam de substituições de próteses. Aglu- tinação em látex e ChromAgar são métodos confiáveis para detecção de MRSA, e os resultados são disponibilizados mais rapidamente, em comparação com outros métodos. Mais importante ainda: onde for possível, deverão ser in- troduzidos protocolos consistentes para todos os testes acima, e esses protocolos serão efetuados com o uso de linhagens de controle sensíveis e resistentes apropriadas, como as descritas Tabela 5. Pontos de corte de referência para MIC e diâmetro de zona recomendados pelo CLSI para S. aureus4 Agente antimicrobiano Conteúdo do disco (μg)* Pontos de corte do diâmetro de zona (mm mais próximo)* MIC padrão (μg/mL)* S I R S I R Meticilina 5 ≥ 14 10-13 ≤ 9 ≤ 8 — ≥ 16 Oxacilina 1 ≥ 13 11-12 ≤ 10 ≤ 2 — ≥ 4 Cefoxitina 30 ≥ 22 — ≤ 21 ≤ 4 — ≥ 8 Vancomicina — — — — ≤ 2 4-8 ≥ 16 Teicoplanina 30 ≥ 14 11-13 ≤ 10 ≤ 8 16 ≥ 32 Clindamicina 2 ≥ 21 15-20 ≤ 14 ≤ 0,5 1-2 ≥ 4 Daptomicina — — — — ≤ 1 — — Linezolida 30 ≥ 21 — — ≤ 4 — — Rifampina 5 ≥ 20 17-19 ≤ 16 ≤ 1 2 ≥ 4 Quinupristina-dalfopristina 15 ≥ 19 16-18 ≤ 15 ≤ 1 2 ≥ 4 Trimetoprim-sulfametoxazol 1,25/23,75 ≥ 16 11-15 ≤ 10 ≤ 2/38 — ≥ 4/76 S – Sensível; I – Resistência intermediária; R – Resistente *Reproduzido, com permissão, da publicação CLSI M100-S19, Padrões de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana, Tabela 2C. Cópias da edição atual podem ser obtidas em: Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA. www.clsi.org Zurita, Mejía, Guzmán-Blanco Braz J Infect Dis 2010; Vol 14 (Suppl 2):S97-S107 S104 Tabela 6. Detecção de VISA e de VRSA Teste Apropriado para: VISA VrSA Teste de triagem Sim Sim Diluição em caldo Sim Sim Diluição em ágar Sim Sim Etest Sim Sim Método de difusão Não Sim (mas os resultados podem ser equívocos) Métodos automatizados Não Não nas recomendações da BSAC e do CLSI.4,8 No caso de estu- dos de MIC e de difusão em disco, as recomendações do CLSI fornecem os valores de referência para MIC e para zona de inibição; com esses valores, é possível definir sensibilidade, resistência intermediária e resistência a agentes antimicrobia- nos específicos (Tabela 5).4 MRSA deve ser comunicado como resistente a todos os agentes β-lactâmicos atualmente dispo- níveis (penicilinas, combinações de β-lactamase/inibidor de β-lactamase, cefemos e carbapenemos), pois a atividade de agentes β-lactâmicos contra MRSA nos testes in vitro não se traduz necessariamente em eficácia clínica. DETECÇÃO DE REDUÇÃO DA SENSIBILIDADE À VANCOMICINA (VRSA E VISA) Comumente, as infecções por MRSA são tratadas com antibi- óticos glicopeptídeos, como vancomicina e teicoplanina. Mas nos últimos anos surgiram isolados de MRSA com sensibili- dade reduzida ou com resistência à vancomicina,28 inclusive na América Latina.29 Globalmente, esses isolados foram de- nominados S. aureus intermediário para vanco micina (VISA) e S. aureus resistente à vancomicina (VRSA), dependendo de seu nível de resistência. Embora linhagens VISA/VRSA não tenham sido identificadas com frequência na América Lati- na e aparentemente não esteja ocorrendo aumento da inci- dência,30 a importância potencial desses microrganismos se reflete na inclusão do teste de sensibilidade à vancomicina nas recomendações para o diagnóstico de MRSA.8-10 O atual padrão de excelência para o diagnóstico de VISA ou VRSA é o teste de triagem. No caso, placas contendo ágar- infusão de cérebro e coração com vancomicina6 mg/mL são inoculadas com 10 μL de inóculo de uma suspensão bacteria- na 0,5 de McFarland e incubadas durante 24 h; o crescimen- to de mais de uma colônia significa um resultado positivo.31 Pode-se utilizar S. aureus ATCC 25923 e Enterococcus faecalis ATCC 51299 como controles negativo e positivo, respectiva- mente. Pode-se usar também ágar de Mβeller-Hinton conten- do vancomicina ou teicoplanina no teste de triagem,8,9 mas sugerimos um tempo de incubação maior (48 h). Quase todas as recomendações propõem métodos de MIC para confirmação de resultados positivos do teste de tria- gem.9,10 Mas é preciso cautela na escolha dos testes apropria- dos para VISA e VRSA, pois nem todos os métodos são apro- priados para as duas linhagens (Tabela 6). VISA e VRSA, por exemplo, não são confiavelmente detectados com o uso de mé- todos automatizados;31,32 já a difusão em disco não é adequada para VISA, mas pode ser utilizada para VRSA. Em geral, pode- se utilizar um método não automatizado para MIC (p. ex., dilui ção em caldo, diluição em ágar, ou Etest), com incubação durante 24 h.8,10 Linhagens com MIC ≤ 2 μg/mL são conside- radas como sensíveis à vancomicina (Tabela 5),4 embora MICs mais elevadas (dentro dessa faixa “sensível”) para vancomici- na t enham sido relacionadas com maior risco de insucesso clínico.33 VISA com sensibilidade heterogênea à vancomicina (h-VISA) deve ser confirmada pelo método de perfil de análise de população (PAP), pois as MICs para essas linhagens podem ser similares àquelas para linhagens sensíveis.9 Foi demonstrado que h-VISA complica significativa- mente o tratamento de pacientes com bacteremia, e que frequentemente essa linhagem não é identificada pelos la- boratórios clínicos. O melhor método de detecção para h-VISA é o cálculo da área sob a curva (ASC) obtida com um teste PAP; mas este é um procedimento muito trabalho- so e caro – além de não ser apropriado no cenário clínico. Atualmente, contamos com três alternativas razoáveis ao método PAP altamente sensíveis e específicas, e que devem ser utilizadas em todos os isolados de MRSA com MIC de 1-2 μg/mL para vancomicina. 1) Método de detecção Etest “New strip” para resistência a glicopeptídeos (vancomicina, 32-0,5 μg/mL; teicoplanina, 32-0,5 μg/mL; bioMérieux AB)34 2) Ágar de Mβeller-Hinton suplementado com teicoplanina 5 μg/mL 3) Placas contendo ágar-infusão de cérebro e coração suplementado com vancomicina 6 μg/mL, conforme descrição na literatura28,35 Em seguida à obtenção de testes positivos para VISA ou VRSA, as amostras devem ser encaminhadas a um laboratório de referência para análise de população, utilizando linhagens de controle apropriadas (p. ex., ATCC 700698, ATCC700699 e linhagem Oxford, ou outro controle adequado10). Os micror- ganismos que podem ser utilizados como controles para testes de sensibilidade e para a avaliação de baixos níveis de resis- tência a glicopeptídeos (S. aureus intermediário para glicopep- tídeo [GISA]) e de resistência a glicopeptídeos heterogêneos (GISA heterogêneo [h-GISA]) são: S. aureus ATCC 29213, ATCC 700698 (Mu3; h-GISA) e ATCC 700699 (Mu50; GISA). O fenômeno de heterorresistência tem ocorrido em linha gens de MRSA que, apesar de ter MIC para vancomicina inferior à MIC para o ponto de corte de linhagens sensíveis, possuíam subpopulações que cresciam em presença de 4-8 Diagnóstico de MRSA na América Latina S105 μg/mL de vancomicina.28,36 Desde sua descrição, essas linha- gens foram denominadas “vancomicina-heterorresistentes”, tendo sido detectadas em vários países,37,38 inclusive alguns países da América Latina. Em um estudo realizado na Vene- zuela, Colômbia, Equador e Peru, Reyes et al. descreveram nove linhagens de h-VISA em 1.570 espécimes de S. a ureus (0,57%).39 Essa heterogeneidade na resistência à vanco micina é parecida com a descrita para meticilina no MRSA, onde ape- nas 1×10-6 bactérias expressam essa característica. A heterorresistência à vancomicina foi considerada como causa potencial de insucesso terapêutico.38 Contudo, para que conheçamos a real incidência e a importância desse tipo de linhagem, é necessário estabelecer um método de de- tecção confiável e reprodutível. Alguns autores sugerem que os atuais métodos de detecção de heterorresistência à van- comicina induzem, em vez de detectar, resistência à vanco- micina; portanto, será impossível estabelecer sua relevância clínica até que compreendamos melhor os mecanismos de controle da resistência à vancomicina.40,41 Devem ser realizados também testes de sensibilidade para eritromicina, clindamicina (inclusive detecção do me- canismo induzível nas linhagens resistentes à eritromici na), daptomicina, linezolida, rifampina, quinupristina/dalfo- pristina e trimetoprim-sulfametoxasol. Estes testes podem ser realizados na clínica/hospital, caso existam instalações/ equipamento apropriados; ou, mais frequentemente, em um laboratório de referência. É recomendável que isolados pro- váveis de VISA e VRSA sejam enviados com a maior rapi dez possível a um laboratório de referência, mesmo no caso de haver condições para testar outros agentes em nível de clíni- ca/hospital, para facilitar a confirmação do microrganismo e melhorar os esforços de controle da infecção. IMPLICAÇÕES PARA A REgIÃO A incidência e percepção cada vez maiores de MRSA em toda a América Latina têm sido respondidas por um grande esfor- ço que visa a obtenção de diagnósticos precoces, intervenções apropriadas e uma vigilância abrangente. Como seria de se esperar em uma região com tamanha diversidade em seus re- cursos, é grande a variedade de testes diagnósticos utilizados rotineiramente na prática clínica (esses testes estão ilustrados na presente revisão) e as medidas de controle de qualidade aplicadas são igualmente variadas. Tendo em vista que MRSA provavelmente continuará sendo uma ameaça contínua à saú- de pública na América Latina em um futuro próximo, será oportuno revisar os atuais processos e adotar medidas que garantam práticas consistentes em toda a região. As recomendações existentes para o diagnóstico de MRSA e tratamento dos pacientes são bastante minuciosos; essas recomendações devem servir de base para a padroniza- ção dos procedimentos clínicos. Pode haver necessidade de um conjunto de recomendações diferenciadas que possam ser adaptadas tanto aos centros de maior porte e com recur- sos mais significativos quanto às clínicas locais com carência de recursos. Da mesma forma, essas recomendações devem ser adaptadas a cada país, com base nos recursos e na epide- miologia locais e nas necessidades clínicas específicas. Um sistema coordenado para o controle de qualidade é condição fundamental para diagnósticos bem-sucedidos de MRSA, e devem ser criadas instituições de referência cen- tralizadas e acessíveis para dar subsídios aos centros locais. Nesse tocante, é importante que haja colaboração no âmbito de cada país e entre países na região. Educação é um fator-chave, para proporcionar consis- tência às abordagens. Os laboratórios de microbiologia de- vem participar na educação dos profissionais e estudantes de medicina e de outras áreas da saúde, para que essas pessoas possam realizar suas tarefas adequadamente; além disso, de- vem ser estruturadas redes regionais de apoio de maneira a propiciar ajuda contínua e facilitar a introdução de novas técnicas. Finalmente, devem ser introduzidos sistemas para avaliação da implementação das recomendações, para que fiquem asseguradas a adoção das melhores práticas e a ma- nutenção da consistência em toda a região. Embora seja improvável que essas recomendações ve- nham a interromper a propagação de linhagens de S. aureus resistentes a antibióticos em toda a América Latina, elas de- vem ajudar os profissionais da saúde na obtenção do equi- líbriomais apropriado entre o gerenciamento dos recursos locais e o estabelecimento de diagnósticos de alta qualidade, tanto nos hospitais como nas comunidades locais. IMPLICAÇÕES PARA A PRÁTICA CLÍNICA • O diagnóstico de MRSA deve ser estabelecido de acordo com recomendações específicas. • As recomendações devem ser selecionadas e adaptadas, levando em conta os recursos e as necessidades locais. • Deve ser estabelecido um sistema coordenado para controle de qualidade em apoio ao diagnóstico microbiológico, inclusive com acesso regional às instituições de referência centrais. • Profissionais médicos e de outras áreas da saúde devem ser educados para diagnósticos em um ambiente de melhor prática. • Devem ser estabelecidos sistemas que avaliem a implementação das recomendações e das melhores práticas por toda a América Latina. AgRADECIMENTOS Apoio financeiro Pfizer Inc., Nova Iorque, EUA, financiou os congressos do Grupo de Trabalho Latino-Americano para Resistência de Zurita, Mejía, Guzmán-Blanco Braz J Infect Dis 2010; Vol 14 (Suppl 2):S97-S107 S106 Gram-Positivos. Pfizer Inc. não teve envolvimento na cole- ta, na análise e na interpretação dos dados, na redação dos manuscritos ou na decisão em apresentar os artigos para publicação. Preparação do manuscrito O apoio oferecido por Choice Pharma (Hitchin, Inglaterra), com financiamento de Pfizer Inc., consistiu na formatação do manuscrito e em ajuda para redação do documento. CONFLITOS DE INTERESSE J. Zurita: membro do Conselho Consultivo e consultor para Pfizer; recebeu bolsa de pesquisa de Wyeth. C. Mejía: membro do Conselho Consultivo para Pfizer e Abbott; consultor para Pfizer; recebeu bolsa de Tibotec para pesquisa de HIV, de Avexa para estudos sobre tratamento de HIV e de Merck pela participação no estudo SMART. M. Guzmán-Blanco: membro do Conselho Consulti- vo para Pfizer, Merck e BD; consultor para Pfizer, Wyeth e J anssen; recebeu bolsas de pesquisa de Wyeth e Merck. REFERÊNCIAS BIBLIOgRÁFICAS 1. Guzmán-Blanco M, Mejía C, Isturiz R et al. 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