Ensaios de RNA e proteínas das funções genômicas - Resumo Capítulo 15

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Ensaios de RNA e proteínas das funções genômicas
O conhecimento da sequência completa do genoma humano ajudará a identificar genes responsáveis por doenças em seres humanos. No entanto, não informará o que esses genes fazem ou como eles controlam processos biológicos. As sequências só adquirem verdadeiro significado quando complementadas por informações sobre suas funções. É preciso obter informações sobre as funções das sequências de DNA por meio de análises genéticas tradicionais e moleculares. 
Microarranjos de DNA
Quando a sequência de um genoma completo é conhecida, os geneticistas conseguem estudar a expressão de todos os genes no organismo. Assim, eles conseguem monitorar alterações da expressão do genoma total ao longo do tempo, durante o desenvolvimento ou em resposta a modificações do ambiente. Esse tipo de análise deve ajudar a elucidar a base de muitas doenças humanas. 
Os RNA a serem analisados são isolados das células ou tecidos de interesse e usados para sintetizar cDNA marcados com corante fluorescente por reação da cadeia de polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR). Esses cDNA marcados são hibridizados com as sondas em microarranjos para comparar os níveis de expressão de genes de interesse ou de todos os genes do genoma. Após a hibridização se completar, o arranjo é lavado e então examinado com lasers e detectores de fluorescência com resolução de micrômetro a fim de detectar onde os cDNA marcados ligaram-se às sondas. A ligação indica que havia cDNA na mistura de hibridização, o que significa que o RNA que serviu como molde para sua síntese durante a RT-PCR necessariamente existia no RNA extraído da amostra biológica original. 
Assim, a ligação de um cDNA com uma sonda no microarranjo indica que um gene determinado foi expresso. Os resultados da hibridização são analisados e armazenados por um software projetado para remover o ruído de fundo e amplificar sinais positivos.
Como um todo, projetos de sequenciamento genômico e tecnologias de microarranjo possibilitaram o estudo da expressão de todos os genes de um organismo simultaneamente. Essa base de dados proporciona aos pesquisadores e médicos informações detalhadas sobre quais genes são mutantes em tipos específicos de tumor – uma “impressão digital” genética que diagnostica o tipo de tumor.
Proteína fluorescente como repórter da presença de DNA
Hibridizações por arranjo podem ser usadas para determinar se os genes são transcritos, mas não informam se os transcritos são traduzidos em proteínas. Os anticorpos proporcionam uma maneira de detecção dos produtos proteicos dos genes de interesse. Para células e tecidos homogeneizados, Western blots podem ser usados para detectar proteínas que tenham sido extraídas de um homogenado e separadas por eletroforese em gel. No caso de células e tecidos intactos, anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes conseguem revelar a localização de uma proteína in vivo. 
A descoberta de uma proteína fluorescente natural, a proteína verde fluorescente (GFP) da água-viva Aequorea victoria, constitui uma ferramenta valiosa para o estudo da expressão gênica no nível de proteínas. Atualmente, a GFP é usada para monitorar a síntese e a localização de proteínas específicas em grande variedade de células vivas. Esses estudos implicam a construção de genes especiais de fusão que contenham a sequência nucleotídica codificadora de GFP, acoplados em correta matriz de leitura à sequência nucleotídica codificadora da proteína de interesse; a introdução do gene de fusão nas células por transformação; e estudo da fluorescência do componente GFP da proteína de fusão em células transformadas que tenham sido expostas à luz azul ou UV. Como a GFP é uma proteína pequena, muitas vezes pode ser unida a outras proteínas sem que haja interferência na sua atividade ou interação com materiais celulares.
A parte fluorescente (cromóforo) de GFP é produzida por ciclização e oxidação pós-tradução de um tripeptídio serina/tirosina/glicina codificado. Esse cromóforo é amplamente protegido dos efeitos de íons e solventes graças ao encerramento em uma prega, semelhante a um barril, dentro da proteína madura. Ao contrário de outras proteínas bioluminescentes, a fluorescência de GFP não requer a adição de substratos, cofatores ou outras substâncias, basta a exposição à luz azul ou UV. 
Assim, GFP pode ser usada para estudar a expressão gênica em células vivas e para estudar a localização e o movimento de proteínas nas células com o passar do tempo. Biólogos moleculares usaram a mutagênese para criar variantes de GFP que emitem luz azul ou amarela, variantes com intensidade de fluorescência até 35 vezes maior que a GFP de tipo selvagem e variantes cuja fluorescência depende do pH do microambiente. Essas variantes podem ser usadas para o estudo simultâneo da síntese e da localização intracelular de duas ou mais proteínas.
Alguns geneticistas estão usando fusões de GFP para estudar alterações na expressão de todos os genes codificadores de proteínas implicados em determinada via metabólica em resposta ao tratamento de células ou tecidos com um fármaco específico. Constroem todo um conjunto de genes de fusão contendo a sequência codificadora de GFP, introduzem-nos em células hospedeiras e monitoram sua expressão por meio de quantificação da fluorescência das proteínas de fusão. Estão sendo desenvolvidas tecnologias que possibilitarão que cientistas observem alterações nos níveis de grandes arranjos de proteínas de fusão GFP por eletroforese capilar, monitoradas por microfotodetectores sensíveis e software sofisticado. Em um futuro não muito distante, “chips proteicos” podem vir a ser usados em conjunto com chips gênicos para proporcionar uma percepção completa da expressão gênica.