Coleta e Análise de Amostras em Estudos Nefrológicos

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• Pacientes clínicos e medidas de parâmetros:
Todos os pacientes recrutados foram admitidos no Departamento de Nefrologia no segundo hospital afiliado da universidade médica de Harbin.
Os tecidos foram coletados durante biópsias renais de pacientes com síndrome nefrótica recentemente diagnosticada.
O Minimal change disease (Doença que afeta os rins e que causa síndrome no néfron, MCD) refere-se a ocorrência de síndrome nefrótica sem lesões glomerulares por microscopia de luz (ou apenas proeminência glial), sem coloração em imunofluorrescência (ou coloração de baixa intensidade para c3 e lgM). ????
O tempo de duração entre as primeiras visitas destes pacientes e a biopsia renal foi de cerca de dias.
As amostras urinárias foram coletadas no mesmo dia da biópsia renal e armazenadas a -20 C dentro de 2 horas de coleta até a creatinina onde foram analisados os níveis de wnt4 e kim-1
O conselho de Revisão Interna do Hospital Médico de Harbin aprovou o estudo protocolar e todos os pacientes forneceram o consentimento informado de acordo com a versão mais recente da Ética em pesquisa humana.
Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas .
• Coleta de amostra e medida de parâmetros séricos:
Ratos com IRI (Lesão por isquemia/reperfusão) foram alojados em um ar-condicionado. Aos 0,3,6,12,24,72,120,168 horas após a IRI bilateral, urina e soro foram coletados e armazenados em -20C até a próxima análise.
A urina foi recolhida antes da eutanásia de cada rato alojado em gaiolas metabólicas com acesso gratuíto à agua, mas sem alimentos.
Foram colhidas amostras de sangue do plexo retrobulbar de anestesia tizados.
As amostras de urina e sangue foram centrifugadas durante 10 min a 3500 rpm.
Os sobrenadantes (que estão por cima) foram recolhidos e e armazenados a -20C até serem analisados.
A criatina plasmática, a creatina urinária e o BUN (nitrogênio uréico sanguíneo) plasmático foram utilizados o método enzimático por técnicas laboratorias padrão com um analisador automático bioquímico.
Os tecidos renais foram preparados para imunofluorscência microscópia, estudos morforlógicos e experiência s de biologia celular. 
• Estudos histológicos:
Os ratinhos foram perfundidos com solução salina tamponada com fosfato (PSB) estéril gelada
O tecido utilizado para a microscopia de luz foi fixado em formalina tampão neutro a 10% por 12h.
O tecido foi também desidratado em etanol graduado, incorporados em parafina para seccionamento.
• Coloração por imunofluorescência: 
Imunofluorescência é uma técnica que permite a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares utilizando corantes fluorescentes, que absorvem luz e a emitem num determinado comprimento de onda. Quando o corante está ligado ou conjugado com um anticorpo, os locais de reação entre o antígeno e o anticorpo conjugado podem facilmente ser visualizados. 
Os ratos foram perfundidos com PSB arrefecido (deixou frio) com gelo estéril.
Tecidos renais foram corrigidos em solução de paraformoldeído, lisina e periodato durante 2h, seguido por 18% de sacarose durante a noite. 
Os tecidos foram então incorporados em Tissue-Tek O.C.T composto ( formulação de glicóis e resinas hirdossolúveis)
As secções congeladas foram obtidas a partir de criostato a 4 um
A realização por imunofluorescência foi realizada utilizando o protocolo descrito.
Foram utilizados anticorpos primários contra as seguintes proteínas para imunomarcação:
> Anti-rato de coelho Wnt-4
>Anti-rato de cabra KIM-1
>Anti-rato AQP1 de cabra 
>Anti-rato de cabra NCC
Os anticorpos secundários foram Alexa Flour (colocar aqui)
Os núcleos foram corados utilizando 4,6 diamidino-2-fenilindole 
As imagens foram capturadas usando uma Nilon DS Ri1
• Colocaração imunohistoquímica:
Imuno-histoquímica ou IHQ se refere ao processo de localizar antígenos em tecidos, explorando o princípio da ligação específica de anticorpos a antígenos no tecido biológico. O nome da técnica provém das raízes "imuno", em referência aos anticorpos utilizados no procedimento, e "histo", significando tecido (compare com imunocitoquímica). A coloração imuno histoquímica é amplamente utilizada no diagnóstico de células anormais, tais como aquelas encontradas em neoplasias. Marcadores moleculares específicos são característicos de eventos celulares particulares, tais como proliferação ou morte celular (apoptose). IHQ é também amplamente utilizada na pesquisa básica para compreender a distribuição e localização de biomarcadores e proteínas diferentemente expressas em diferentes partes de um tecido biológico.
A coloração imunohistoquímica e coloração Ki-67 de secções de parafina foi realizada por desparafinagem, recuperação de antígenos( incubação de tampão de ácido cítrico e aquecimento por microondas) e anti-corpo como descrito anteriormente.
 As secções de parafina foram obtidas utilizando um microtome a 2-3 um.
As secções foram desparafinadas e a atividade de peroxidade endógena foi ablada por incubação em peroxido de hidrogênio a 3% em metanol durante 5 minutos.
As secções foram então aquecidas no microondas em tampão de citrato 0.1 mol/L durante 20 min.
Anticorpo de coelho anti-Wnt-4 de de rato foi então adicionada a secção e uncubada durante a noite a 4C 
O secundário foi IgG de cabra anti-coelho conjugada com peroxidade de rábano
Coloração utilizada: Kit DAB
 • TUNEL:
As células apoptóticas foram detectadas utilizando um kit de ensaio de apoptose TUNEL.
• Captura e quantificação de imagens:
As imagens foram capturadas sequencialmente por imagens digitais (200x / 400x Magnificação) nas regiões cortical e medular externa (10-15 imagens). 
Todas as configurações de exposição foram as mesmas para cada grupo de rins. 
Os dados obtidos de cada tecido são representados como a média de todos os campos. 
 Cada imagem de ratos e humanos foi dividida em 252 quadrados usando uma grade. 
Para calcular a presença de lesão tubular no quadrado, cada quadrado com lesão tubular (Achatamento do túbulo, perda da borda da escova, necrose, apoptose ou formação de carcaça) foi atribuída uma pontuação positiva. 
 As imagens foram capturadas usando um microscópio Nikon (Tóquio, Japão).
 Os valores de imunofluorescência e a área imuno-histoquímica (Wnt4 e KIM-1) foi medida pela delineação manual do perímetro de dez imagens .
Em cada seção a área média das regiões delineadas (coloração positiva) foi quantificada e processada pelo Software de análise de imagem.
 O número de Ki-67 positivo e células TUNEL positivas foram contadas a partir de 10 campos diferentes para cada amostra e média.	
• Análise por transferência de Western:
Os tecidos dos rins foram lisados ​​em gelo com um ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) Tampão contendo 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 100 μg / ml de PMSF, 1% de cocktail de inibidor de protease e 1% de fosfatase I E II inibidor cocktail (Sigma). 
A mesma quantidade de lisados ​​de proteína total de rim (200 μg) ou urina centrifugada (100 μg) foram desnaturados a 80 ºC durante 10 minutos em tampão de amostra, separados em poliacrilamida a 12% de sódio Dodecilsulfato, e transferiu-se para uma membrana de PVDF. As membranas de PVDF foram bloqueadas a temperatura ambiente. 
Por 2 horas com 5% de leite em pó em tampão Tris-HCl contendo 0,1% de Tween 20 (TBST). O oeste Blot foi realizada como previamente descrito36. Para detectar Wnt4 e KIM-1, as transferências foram incubadas com anti-rato/ humano Wnt4 de coelho, anti-ratinho de cabra / Humano KIM-1 e depois com anticorpos de cabra anti-coelho conjugados com HRP IgG, anti-cabra ou de cabra anti-IgG de ratinho
OS resultados de western blot renal foram normalizados para β-actina. 
• Ensaio imunoenzimático (ELISA). 
Creatinina urinária Wnt4 e KIM-1 de ratos IRI e Pacientes MDC foram medidos por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) utilizando um estojo de teste comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante e foram normalizados para creatinina urinária (uCr)
• Análise estatística: 
 A análise estatística foi realizada utilizandoo GraphPad Prism Software, versão 6.0. 
Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão (DP). ANOVA unidirecional com teste Steel-Dwass Foi utilizado para determinar as diferenças entre os grupos. 
A análise de Kaplan-Meier foi utilizada para analisar a taxa. 
As comparações entre dois grupos foram feitas utilizando um teste t não pareado. 
As correlações foram determinadas Análise de correlação de duas cabeças de Pearson. O coeficiente de correlação foi aplicado como o índice de Lação.
 P valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos para todos os testes estatísticos.