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Manual de Necropsia De Pequenos Roedores Grupo: Davi Pitangueira Leite da Silva Cruz Luana Pineli Bueno SUMÁRIO Qual é a importância de realizar uma necropsia………………...Pg.3 Roedores …………………………………………………………………………..Pg.4 Procedimentos preliminares……………………………………………...Pg.5 Material para necropsia …………………………………………………….Pg.6 Exame externo …………………………………………………………………..Pg.7 Primeira etapa da necropsia……………………………………………...Pg.8 Rins e baço………………………………………………………………………...Pg11. Coletas pós-morte para histopatologia……………………………...Pg.13 Acessos …………...…………………………………………………………….…..Pg.20 Referências bibliográficas………………………………………………….Pg. 43 Qual é a importância de realizar uma necropsia? Em termos simples, porque a necropsia pode confirmar, refutar, esclarecer, modificar ou estabelecer o diagnóstico. Numerosos erros de diagnóstico podem ser evitados ou corrigidos se a necropsia for realizada. Roedores Roedores é como é chamado os animais da ordem Rodentia. Essa ordem é dividida entre 30 famílias e mais de 2000 espécies, sendo provavelmente a ordem mais numerosa de mamíferos Esses animais também se caracterizam pela sua dentição específica uma dentição altamente especializada para roer. Todos os roedores possuem um par de incisivos na arcada dentária superior e inferior seguidos por um espaço, o diastema, e por um ou mais molares e pré-molares. Nenhum roedor possui mais de quatro incisivos e nenhum roedor possui caninos. Seus incisivos não têm raiz e crescem continuamente. Fig. 1 : Próprio autor Crânio de rato Rattus norvegicus Procedimentos Preliminares ● Termo de autorização de necropsia; Antes de qualquer procedimento é necessário que o proprietário ou responsável legal pelo animal assine um termo de autorização para realização da necropsia. ● Identificação do animal; Coletar dados como, raça, espécie, idade e sexo, nome ou número, proprietário ou tutor responsável, e quaisquer outros tipos de informações que possam demonstrar importancia. ● Histórico; Realizar uma anamnese, histórico clínica e as possíveis circunstâncias que levou o animal a óbito. Material para Necropsia Para realizar uma necropsia é necessário: -bisturi - pinça anatômica - pinça dente de rato - tesouras romba romba -tesoura iris reta -material para coleta laboratorial e conservação de peças. Fig. 2 : Próprio autor Exame externo O primeiro passo para realizar uma necropsia é fazer um exame externo para se avaliar : Ectoparasitas , cortes , lacerações , deformidades ósseas , sangue , secreções,alterações no pelo , manchas. foto do rato Fig. 3 : Próprio autor Fig. 4 : Próprio autor Primeira etapa da necropsia Antes de se iniciar , o animal deverá se manter em decúbito dorsal , em seguida deverá realizar um corte medial , que se inicia em baixo da junção dos ossos da mandíbula e seguir até os órgãos sexuais , onde irá ser realizado um corte em formato de círculo em volta do órgão sexual em seguida deverá realizar o separamento dos musculos para os órgãos , abatendo a pele lateralmente, disponibilizando uma visão melhor dos órgãos em seguida se iniciará o processo de retirada do primeiro conjunto, com a exposição da traquéia. Fig. 5 : Próprio autor Incisão inicial Visualização da musculatura abdominal e torácica. Fig. 6 : Próprio autor Fig. 7 : Próprio autor Fig. 8 . Órgãos abdominais e torácicos no rato/camundongo. Esses órgãos são normalmente visíveis quando um animal é aberto pela primeira vez (nenhum dos órgãos foi movido para expor outros órgãos também presentes na cavidade abdominal. a) timo, b) coração, c) pulmões, d) diafragma, e) fígado, f) intestino delgado, g) ceco, h) bexiga urinária. Usando uma tesoura, faça uma incisão na pele em todo o comprimento do ventrum, do ânus ao queixo, refletindo a pele e fazendo uma incisão na parede abdominal, expondo as vísceras abdominais, as glândulas salivares e prepuciais / clitorianas e os linfonodos cervicais e axilares. Corte a caixa torácica para expor e examinar as vísceras torácicas fazendo 2 cortes lateralmente em cada lado da caixa torácica, depois um transversalmente, na parte superior do esterno, para abrir um espaço largo o suficiente para examinar completamente todos os lobos do pulmão Examine a aparência da estrutura musculoesquelética. Avalie todos os órgãos quanto a anormalidades. Encontre e identifique especificamente o coração e os pulmões na cavidade torácica. Rins e Baço Encontre e identifique especificamente o fígado, rins e baço na cavidade abdominal. Observe todas as mudanças de cor, diferenças de tamanho e órgãos ausentes ou localizados incorretamente. Observe a consistência das superfícies, qualquer tecido adicional (por exemplo, massas), bolsas de fluido ou a presença de fluido nas cavidades abdominais / torácicas Observe se há conteúdo ou falta de conteúdo no trato gastrointestinal, com atenção especial para paredes espessas, massas e / ou hemorragia. Faça uma incisão nos rins (seção longitudinal esquerda, seção transversal direita, na linha média, mas fora do centro) com um bisturi ou lâmina de barbear para verificar o parênquima quanto a qualquer anormalidade. Verifique o mesentério para nódulos linfáticos aumentados e / ou massas. Examine o sistema urogenital, procurando bloqueios, bolsas de fluido, hemorragia ou outras anormalidades. Coleta pós-morte de coração, fígado, rins e baço para histopatologia ● Reúna o (s) recipiente (s) rotulado (s) de tamanho apropriado, cheios com uma quantidade adequada de formalina tamponada neutra a 10% (NBF). Ajuste a quantidade de NBF a 10% para obter uma proporção de 20: 1 de fixador para tecido. ● Coloque o mouse ou a carcaça do rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho semelhante e exponha o tecido de interesse. ● Remova o tecido da carcaça usando uma pinça e uma tesoura. ● O tecido deve ser bem aparado para remover a gordura e o tecido conjuntivo desnecessário. O tecido deve estar limpo de sangue; use solução salina normal (ou fisiológica) para enxaguar conforme necessário. Nunca use água destilada ou da torneira para enxaguar os lenços. ● Coloque o lenço no recipiente de NBF a 10%. Coleta pós-morte e perfusão do tecido pulmonar ● Reúna o (s) recipiente (s) rotulado (s) de tamanho apropriado, preenchidos com uma quantidade adequada de NBF a 10%. Ajuste a quantidade de NBF a 10% para obter uma proporção de 20: 1 de fixador para tecido. ● Coloque a carcaça do rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho semelhante. ● Exponha a traqueia, o coração e os pulmões. ● Usando uma tesoura e uma pinça, remova a pele e os músculos que recobrem as regiões ventral torácica e cervical. ● Usando uma tesoura e uma pinça, remova a caixa torácica expondo o coração e os pulmões, fazendo 2 cortes laterais de cada lado da caixa torácica e, em seguida, um transversal perto da clavícula para abrir um espaço largo o suficiente para examinar completamente todos os lobos do pulmão. ● Corte os músculos do pescoço que se estende do esterno e costelas até a mandíbula, incluindo aqueles que cobrem a traquéia. ● Insira uma tesoura abaixo da borda anterior da caixa torácica e faça 2 cortes, um de cada lado, para remover a seção do osso que recobre a traquéia. ● Segure a traqueia perto da mandíbula com uma pinça e corte completamente a traqueia com uma tesoura colocada acima da pinça ● Puxe suavemente a traquéia para cima usando a pinça, cortando as conexões do tecido ventral com uma tesoura até que todo o conjunto de tecidos torácicos (traqueia, pulmões e coração; isso às vezes é chamado de "arrancada") tenha sido removido do corpo. ● Coloque os pulmões na superfície de trabalho. ● Amarre frouxamente um pedaço de material de suturaou barbante de cozinha ao redor da traquéia, tomando cuidado para não apertar. ● Encha uma seringa com fixador e coloque uma agulha pequena o suficiente para entrar na traqueia. Para ratos, uma seringa de 1ml ou 3ml com uma agulha de calibre 26 funciona bem. Para ratos, uma seringa de 5ml com uma seringa de calibre 18 funciona bem. ● Insira a agulha na abertura da traquéia e use uma pinça para segurar a traqueia ao redor da agulha. Comece enchendo lentamente os pulmões com fixador. ● Encha os pulmões até que estejam totalmente inflados. Não encha demais ou de menos. A quantidade de fixador necessária para inflar totalmente os pulmões varia de acordo com a idade, o esforço e a saúde do animal. ● O excesso de inflação é detectado pela infiltração e formação de espuma de fluido do tecido pulmonar. ● A sub insuflação é detectada por pulmões que parecem planos e não cheios em todas as áreas. ● Remova a agulha da traqueia. ● Aperte o material de sutura ou fio que envolve a traquéia para evitar o refluxo do fixador para fora dos pulmões. ● Coloque os pulmões inflados no fixador usando uma proporção aproximada de 20: 1 do fixador para o tecido. Língua e. Traquéia Fig. 9. abertura da musculatura e exposição das vísceras, pulmões e coração. Fig 10. Remoção do bloco respiratório. Fig. 9 : Próprio autor Fig. 10 : Próprio autor ● Língua Traquéia Pulmões Coração Fig. 11. Bloco respiratório. Fig. 11 : Próprio autor Coleta pós-morte de aspirado respiratório ● Reúna os suprimentos necessários - pipeta estéril, tesouras e fórceps estéreis, soluções estéreis para serem lavadas pelo trato respiratório e uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho semelhante. ● Coloque o mouse sacrificado ou carcaça de rato em decúbito dorsal na placa de dissecação. ● Para aspirado brônquico em ratos, acesse o trato respiratório por meio da traqueia. Para aspirado nasal em ratos, acessar pela traqueia ou pelo meato nasofaríngeo. Para aspirados brônquicos ou nasais em camundongos, acesse o trato respiratório através do meato nasofaríngeo. ● Se os aspirados nasal e brônquico forem necessários, realize primeiro o aspirado brônquico. Realize aspirado nasal usando uma nova pipeta estéril. Acesso traqueal (método recomendado para ratos): ● Refletir a pele da área cervical para expor o tecido subcutâneo. ● Remova as glândulas salivares e a musculatura cervical para expor a traqueia. ● Usando instrumentos esterilizados, faça uma incisão na traquéia para permitir o acesso ao lúmen. Manter assepsia durante a coleta ● Coloque aproximadamente 1ml de fluido de amostragem em uma pipeta estéril. Pode ser solução salina normal, solução salina tamponada com fosfato ou caldo de tripticase de soja. Acesso ao meato nasofaríngeo (aspirado nasal e aspirado brônquico, método recomendado para camundongos devido ao menor tamanho da traqueia): ● Este procedimento pode ser realizado tanto para o aspirado nasal quanto para o aspirado brônquico. ● Usando instrumentos esterilizados a chama ou autoclavados, corte a articulação temporomandibular (mandíbula) e rebata a mandíbula para longe da maxila, expondo o meato nasofaríngeo. Manter assepsia durante a coleta ● Coloque aproximadamente 1ml de fluido de amostragem em uma pipeta estéril. Pode ser solução salina normal, solução salina tamponada com fosfato ou caldo de tripticase de soja. Aspirado brônquico: ● Insira assepticamente a pipeta no lúmen traqueal, dirigida caudalmente, e injete lentamente o fluido de amostragem nos brônquios e no pulmão. Retire a amostra de fluido dos brônquios e pulmões para a pipeta e remova a pipeta da traqueia. Nem todo o fluido retorna para a pipeta. Repita se mais fluido for necessário para o teste. ● Transfira assepticamente a amostra para um meio ou recipiente apropriado para teste. Aspirado nasal: ● Insira assepticamente a pipeta no meato nasofaríngeo (camundongos) ou no lúmen traqueal (ratos), direcionada cranialmente, e injete lentamente o fluido de amostragem na cavidade nasal. ● Certifique-se de que a cavidade nasal é alcançada pelo contato do palato nasal com a ponta da pipeta, ou pela observação de fluido forçado para dentro da cavidade, visto como meniscos se formando no orifício nasal (narinas) ou como fluido visível através do palato oral translúcido. O fluido não deve ser visto saindo pela boca. Nesse caso, reoriente a pipeta. ● Retire o fluido de amostragem da cavidade nasal para a pipeta e remova a pipeta do meato ou traquéia. ● Transfira assepticamente a amostra para um meio ou recipiente apropriado para teste. Coleta pós-morte de aspirado respiratório ● Reúna os suprimentos necessários - pipeta estéril, tesouras e fórceps estéreis, soluções estéreis para serem lavadas pelo trato respiratório e uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho semelhante. ● Coloque o mouse sacrificado ou carcaça de rato em decúbito dorsal na placa de dissecação. ● Para aspirado brônquico em ratos, acesse o trato respiratório por meio da traqueia. Para aspirado nasal em ratos, acessar pela traqueia ou pelo meato nasofaríngeo. Para aspirados brônquicos ou nasais em camundongos, acesse o trato respiratório através do meato nasofaríngeo. ● Se os aspirados nasal e brônquico forem necessários, realize primeiro o aspirado brônquico. Realize aspirado nasal usando uma nova pipeta estéril. Acesso traqueal (método recomendado para ratos): ● Refletir a pele da área cervical para expor o tecido subcutâneo. ● Remova as glândulas salivares e a musculatura cervical para expor a traqueia. ● Usando instrumentos esterilizados, faça uma incisão na traquéia para permitir o acesso ao lúmen. Manter assepsia durante a coleta Acesso ao meato nasofaríngeo (aspirado nasal e aspirado brônquico, método recomendado para camundongos devido ao menor tamanho da traqueia): ● Este procedimento pode ser realizado tanto para o aspirado nasal quanto para o aspirado brônquico. ● Usando instrumentos esterilizados a chama ou autoclavados, corte a articulação temporomandibular (mandíbula) e rebata a mandíbula para longe da maxila, expondo o meato nasofaríngeo. Manter assepsia durante a coleta Aspirado brônquico: ● Coloque aproximadamente 1ml de fluido de amostragem em uma pipeta estéril. Pode ser solução salina normal, solução salina tamponada com fosfato ou caldo de tripticase de soja. ● Insira assepticamente a pipeta no lúmen traqueal, dirigida caudalmente, e injete lentamente o fluido de amostragem nos brônquios e no pulmão. Retire a amostra de fluido dos brônquios e pulmões para a pipeta e remova a pipeta da traqueia. Nem todo o fluido retorna para a pipeta. Repita se mais fluido for necessário para o teste. ● Transfira assepticamente a amostra para um meio ou recipiente apropriado para teste. Aspirado nasal: ● Coloque aproximadamente 1ml de fluido de amostragem em uma pipeta estéril. Pode ser solução salina normal, solução salina tamponada com fosfato ou caldo de tripticase de soja. ● Insira assepticamente a pipeta no meato nasofaríngeo (camundongos) ou no lúmen traqueal (ratos), direcionada cranialmente, e injete lentamente o fluido de amostragem na cavidade nasal. ● Certifique-se de que a cavidade nasal é alcançada pelo contato do palato nasal com a ponta da pipeta, ou pela observação de fluido forçado para dentro da cavidade, visto como meniscos se formando no orifício nasal (narinas) ou como fluido visível através do palato oral translúcido. O fluido não deve ser visto saindo pela boca. Nesse caso, reoriente a pipeta. ● Retire o fluido de amostragem da cavidade nasal para a pipeta e remova a pipeta do meato ou traquéia. ● Transfira assepticamente a amostra para um meio ou recipiente apropriado para teste. Coleta pós-morte de vísceras e sistema reprodutor 1. Uma vez que o diafragma esteja livre da caixa torácica, empurre as vísceras abdominais para um lado para acessaros vasos sanguíneos e o tecido que prendem o fígado à parede dorsal do corpo. Deslize a tesoura cuidadosamente por baixo do fígado / estômago e baço e por cima dos rins para cortar a parte superior das vísceras. 2. Os intestinos e órgãos associados podem ser removidos da carcaça cortando o cólon terminal (que geralmente contém pelotas fecais) o mais próximo possível da pelve 3. Em ratos machos, os testículos podem ser removidos do saco escrotal para melhorar a fixação, puxando suavemente o coxim adiposo associado 4. Para garantir que o cérebro está fixo, a pele deve ser removida do topo da cabeça e uma tesoura forte deve ser usada para cortar o crânio entre as órbitas. Os olhos são retidos no crânio no momento da necropsia com essa técnica. A fixação com formalina é adequada para fins diagnósticos. 5. A carcaça (com os órgãos retidos) e os órgãos intestinais devem ser submersos em um excesso de formalina 10: 1 em um recipiente corretamente rotulado. Fig 12. Abertura dos principais órgãos na necropsia. (a – b) Ilustração da abordagem das cavidades abdominal e torácica. (c – e) Demonstração da remoção dos intestinos. Fig 13. (a) Demonstração do uso de tração suave para expor os testículos na necropsia. (b) Ilustração do corte que deve ser feito para permitir que o fixador entre na cavidade craniana. Fig 14. Órgãos abdominais e retroperitoneais no rato. Se os intestinos e o fígado forem elevados e movidos (ou removidos), esses órgãos podem ser vistos. a) fígado (para referência), b) intestinos (para referência), c) estômago, d) baço, e) rins, f) cólon descendente, g) útero. Fig 15. Órgãos reprodutores masculinos. Estes podem ser maiores em machos maiores e sexualmente maduros. a) vesículas seminais e glândulas coagulantes, b) testículos (empurrados para a cavidade abdominal do escroto através dos anéis inguinais, que permanecem abertos em camundongos e ratos), c) bexiga urinária, d) glândulas prepuciais, e) epidídimo. Fig 16. Órgãos reprodutores femininos. a) útero não grávido (camundongos e ratos têm útero bicorno) b) ovário, enterrado em uma almofada de gordura ovariana, c) bexiga urinária, d) glândulas clitorianas (análogas às glândulas prepuciais masculinas). Fig 17. Sistema urinário. Fig 18. Sistema digestivo. Fig. 17 : Próprio autor Fig. 18 : Próprio autor Fig 20. Sistema reprodutivo masculino. Fig 19. Anatomia após remoção do sistema urogenital do rato. Fig. 19 : Próprio autor Fig. 20 : Próprio autor Coleta de cérebro pós-morte ● Reúna o (s) recipiente (s) rotulado (s) de tamanho apropriado, preenchidos com uma quantidade adequada de NBF a 10%. Ajuste a quantidade de NBF a 10% para obter uma proporção de 20: 1 de fixador para tecido. ● Coloque o mouse sacrificado ou carcaça de rato em decúbito ventral em uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho semelhante. ● Usando uma tesoura e uma pinça, remova a pele e o músculo que recobre a calvária. ● Usando uma tesoura remova a cabeça completamente da carcaça. ● Usando uma tesoura pequena, insira a lâmina inferior no forame magno, a abertura onde o crânio se abre para o canal espinhal, e mantendo as pontas da tesoura apontadas para cima, comece a cortar diretamente para cima e através da linha média da calvária. ● Usando uma pinça, rebata ambas as metades da calvária expondo o cérebro. ● Quando possível, coloque o cérebro exposto no fixador enquanto ainda está no crânio. Isso permitirá que o tecido fique firme antes de ser removido do crânio, se necessário. Muitos patologistas preferem que seções sejam cortadas do cérebro enquanto ainda estão no crânio. ● Inverta suavemente o crânio para que a gravidade ajude o tecido a cair do crânio. ● Usando uma pinça curva, deslize cuidadosamente a pinça ao longo da borda externa do cérebro e sob o cérebro, começando nos lobos olfativos, movendo-se sob o cérebro e em direção ao cerebelo. Aperte suavemente com a pinça qualquer tecido conjuntivo ou nervos que impeçam o cérebro de cair do crânio. ● Coloque o cérebro no fixador usando uma proporção aproximada de 20: 1 de tecido para fixador. Coleta pós-morte dos linfonodos mesentéricos (MLN) ● A coleta de tecido para análise de PCR deve ser feita por meio de técnica asséptica. Devem ser usados instrumentos esterilizados por chama, autoclavados ou esterilizados de forma equivalente. ● Monte tubos Eppendorf estéreis e tesouras e pinças estéreis. ● Coloque o mouse sacrificado ou carcaça de rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho semelhante. ● Usando uma tesoura esterilizada e uma pinça, faça uma incisão na parede abdominal ventral desde a área genital até a base da caixa torácica, removendo pele e músculo e expondo os intestinos. ● Os MLN estão localizados na cavidade abdominal no tecido mesentérico ao longo do cólon, imediatamente adjacente ao ceco. ● Para localizar o MLN, primeiro localize o ceco, que é a grande seção do intestino em forma de vírgula. O cólon estende-se desde o ceco e muitas vezes pode ser identificado pela presença de pelotas fecais. Os MLN estão localizados no mesentério ao longo do cólon adjacente ao ceco. Ele pode ser identificado como um pequeno nódulo de tecido amarelo, oval ou esférico no tecido mesentérico branco e geralmente é ligeiramente mais espesso e de textura mais firme do que o mesentério e a gordura circundantes. Use livros de anatomia conforme necessário para orientação. ● Usando técnica asséptica e instrumentos estéreis, remova o MLN e coloque em um tubo Eppendorf rotulado com informações de identificação. Coleta pós-morte dos linfonodos mesentéricos (MLN) ● A coleta de tecido para análise de PCR deve ser feita por meio de técnica asséptica. Devem ser usados instrumentos esterilizados por chama, autoclavados ou esterilizados de forma equivalente. ● Monte tubos Eppendorf estéreis e tesouras e pinças estéreis. ● Coloque o mouse sacrificado ou carcaça de rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho semelhante. ● Usando uma tesoura esterilizada e uma pinça, faça uma incisão na parede abdominal ventral desde a área genital até a base da caixa torácica, removendo pele e músculo e expondo os intestinos. ● Os MLN estão localizados na cavidade abdominal no tecido mesentérico ao longo do cólon, imediatamente adjacente ao ceco. ● Para localizar o MLN, primeiro localize o ceco, que é a grande seção do intestino em forma de vírgula. O cólon estende-se desde o ceco e muitas vezes pode ser identificado pela presença de pelotas fecais. Os MLN estão localizados no mesentério ao longo do cólon adjacente ao ceco. Ele pode ser identificado como um pequeno nódulo de tecido amarelo, oval ou esférico no tecido mesentérico branco e geralmente é ligeiramente mais espesso e de textura mais firme do que o mesentério e a gordura circundantes. Use livros de anatomia conforme necessário para orientação. ● Usando técnica asséptica e instrumentos estéreis, remova o MLN e coloque em um tubo Eppendorf rotulado com informações de identificação. PARKINSON, Christina M. et al. Necropsia diagnóstica e tecido selecionado e coleta de amostra em ratos e camundongos. JoVE (Journal of Visualized Experiments) , n. 54, pág. e2966, 2011. SCUDAMORE, Cheryl L. Um guia prático para a histologia do camundongo . John Wiley & Sons, 2014. SCUDAMORE, Cheryl L .; BUSK, Naomi; VOWELL, Kate. Uma técnica de necropsia simplificada para ratos: aproveitando ao máximo as mortes não programadas. Animais de laboratório , v. 48, n. 4, pág. 342-344, 2014. FELDMAN, Donald B.; SEELY, John Curtis. Necropsy Guide: rodents and the rabbit. 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