PROJETO-BIOFÁRMACOS-FINAL

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*e-mail: nathanribeironvr@gmail.com 
 
Quim. Nova, vol. 41, No. 5, 302-311, 2018 
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE eGFP A PARTIR DE Escherichia coli BL21 
Gabriela Aparecida Galves de FREITAS¹, Rodrigo Augusto PETTAN¹, Nathan Vinícius 
RIBEIRO¹,* 
¹ Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Unesp, 14800-
903 Araraquara - SP, Brasil. 
 
Green fluorescent protein (GFP) is a protein that emits a green bioluminescence under UV light. This 
characteristic phenomenon, among other qualities, made it an excellent biological marker. Having in 
mind its great importance and applicability, this project aims the production and purification of 
enhanced green fluorescent protein (eGFP) from E. coli BL21 transformed with plasmid pET28a. Cells 
were grown in LB medium at 37 °C, 200 rpm. The protein production was induced with IPTG when 
cells reached the mid-log phase and after this point cells were grown at 25 °C, 200 rpm. To isolate and 
purificate eGFP, cells were lysed performing freeze-thaw cycles. Cell debris were removed and the 
eGFP in the supernatant was extracted using a aqueous two-phase system (ATPS) of 1-propanol and 
tripotassium citrate followed by a secondary system to back extract the eGFP to a new ethanol-rich top 
phase. eGFP were successfully purified using this system, yielding an 30% yield of eGFP 
approximately extracted from the feedstock solution. Although the extraction method resulted in low 
yields, high eGFP production was achieved by the production method proposed. These low yields may 
be consequence by some modifications in the extraction method. 
Keywords: GFP, protein purification, ATPS. 
 
 
INTRODUÇÃO 
A proteína verde fluorescente (GFP) é um 
tipo de proteína bioluminescente, que quando 
estimulada pela luz ultravioleta emite luz verde, 
encontrada naturalmente na espécie Aequorea 
victoria de água-viva bioluminescente, isolada por 
Osamu Shimomura em 19602. A GFP possui uma 
estrutura constituída por 238 aminoácidos, de 27 
kDa, predominantemente monomérico, que se 
organizam de forma enovelada em uma conformação 
denominada barril‐β, nos quais os aminoácidos 65, 
66 e 67 localizados no centro desta cadeia, 
constituem o fluoróforo responsável pela emissão da 
cor verde5. 
Além de sua forma natural, a GFP produzida 
de forma recombinante tem sido muito utilizada por 
sua característica de cromóforo intrínseco. Esta 
característica reside no fato desta proteína ser capaz 
de auto sintetizar o composto fluorescente, 
necessitando apenas da presença de oxigênio 
molecular para esta síntese, ou seja, sem necessidade 
de adicionar qualquer componente externo ao 
organismo para que a sua fluorescência seja 
detectada. Sendo assim, esta propriedade torna esta 
proteína um excelente marcador in vivo de expressão 
gênica, traçador de linhagem celular, sonda 
A
rt
ig
o
 
 
303 
 
 
transcricional para monitoração não relacionada ao 
produto, interação e localização de proteínas em 
vários sistemas biológicos como mamíferos, peixes, 
insetos, plantas, leveduras e numa grande variedade 
de bactérias entre outras diversas aplicações na 
tecnologia de bioprocessos3. 
Após o isolamento de GFP de Aequorea 
victoria, diversas versões e variações da proteína 
foram criadas para melhorar o seu enovelamento, sua 
fluorescência e até mesmo variações na cor da luz 
emitida. Uma dessas variações é a Enhanced Green 
Fluorescent Protein (eGFP) que foi desenvolvida por 
Cormack et al. (1996) que possui mutações nos 
resíduos de aminoácidos que flanqueiam o cromóforo 
da proteína, com isso, os pesquisadores conseguiram 
uma GFP que, quando foi produzida em E. coli, 
apresentou um melhor enovelamento e um aumento 
de 100x na intensidade da fluorescência quando 
comparada com a GFP não-modificada4. 
Uma variedade de cepas de E. coli foram 
desenvolvidas para serem utilizadas em laboratório e 
produção de proteínas recombinantes, dentre elas, 
Escherichia coli BL21(DE3) que possui, integrado 
em seu cromossomo, os genes necessários para que 
ocorra a expressão do gene de interesse sob o 
controle do promotor T7 quando houver a indução 
pela adição de IPTG (Isopropil β-D-1-
tiogalactopiranosida) ao meio. A adição de IPTG ao 
meio ativa a produção da enzima T7 RNA polimerase 
que irá reconhecer a sequência do promotor T7 no 
plasmídeo e, então, o gene de interesse será 
expresso10. No caso do plasmídeo pET-28(a), este 
possui o promotor T7 controlando a expressão do 
gene de interesse fusionado uma cauda de histidina 
na porção N-terminal, um sítio de múltipla clonagem 
(MCS) e resistência ao antibiótico canamicina16. 
Levando-se em consideração a relevância e a 
vasta aplicabilidade da GFP em diversas áreas, uma 
vez que esta fornece uma ligação direta entre os 
genes e o DNA, os fatores que influenciam a 
produção de GFP, o presente estudo, visa, portanto, a 
produção e purificação de eGFP a partir de E. coli, 
bem como análise dos resultados obtidos para o 
método de cultivo, rompimento das células, extração 
e purificação desta proteína para o processo, para que 
possam ser úteis para conclusão deste e outros 
trabalhos de pesquisa. 
 
PARTE EXPERIMENTAL 
Microrganismo e meio de cultura 
Foi utilizada Escherichia coli BL21(DE3) 
transformada com o plasmídeo pET-28(a) contendo o 
gene codificante de eGFP. O meio de cultura 
utilizado foi Luria-Bertani (LB), composto por 5 g L-
1 de extrato de levedura, 10 g L-1 de triptona e 10 g L-
1 cloreto de sódio (NaCl), suplementado com 50 μg 
mL-1 dos antibióticos cloranfenicol e canamicina. A 
esterilização do meio foi feita através de autoclave a 
121 °C por 20 min11. 
 
Preparo do pré-inóculo 
Os pré-inóculos foram preparados coletando 
colônias e inoculando-as em 50 mL de meio LB em 
frasco erlenmeyer de 250 mL a 37 °C e 200 rpm. 
 
Curva de crescimento 
A curva de crescimento do microrganismo 
foi realizada a 37 °C e 200 rpm em frasco erlenmeyer 
de 500 mL contendo 100 mL de meio LB e OD600nm 
inicial de 0,1. O crescimento foi conforme descrito 
no item Quantificação do crescimento celular 
durante 12 h. O cultivo foi realizado em triplicata. 
 
 
 
304 
 
 
Produção de eGFP 
O cultivo para produção foi realizado em 
erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio LB 
e inoculado com uma OD600nm inicial de 0,1. O 
cultivo foi realizado inicialmente a 37 °C e 200 rpm, 
até atingir o ponto mediano da fase exponencial de 
crescimento da bactéria. Neste ponto, a temperatura 
foi reduzida para 25 °C e foi adicionado IPTG na 
concentração de 0,05 mM para induzir a produção de 
eGFP. A produção de eGFP foi acompanhada através 
de leituras de fluorescência conforme o item 
Quantificação de fluorescência. Como controle 
negativo, foi realizado um cultivo sob as mesmas 
condições porém sem a adição de IPTG, utilizado 
como branco para as leituras de fluorescência. O 
cultivo foi realizado em triplicata. 
 
Rompimento celular 
Os cultivos foram centrifugados a 10000 g a 
4 ºC durante 10 minutos para a recuperação das 
células. O sobrenadante foi descartado e as células 
serão ressuspendidas em tampão fosfato na 
composição de 20 mM de NaH2PO4, 20 mM de 
Na2HPO4 e 0,5 mM de NaCl, no pH 7.4, na 
proporção de 1 mL de tampão para cada 0,1 g de 
células. O rompimento foi feito através de 5 ciclos de 
congelamento/descongelamento rápido. O primeiro 
ciclo foi realizado congelando as amostras em 
ultrafreezer (-80°C) overnight, descongeladas em 
banho-maria a 37 °C até o descongelamento total da 
amostra e agitadas em vortex. Os quatro ciclos 
restantes, o congelamento foi realizado durante 20 
min. Para remover o debri celular, as amostras foram 
centrifugadas a 10.000 g, a 4 ºC por 10 minutos8. O 
sobrenadante foi recuperado para a etapa de extração. 
 
 
Extração utilizando sistema aquoso bifásico 
Foi realizadauma extração utilizando 
sistema aquoso bifásico, realizada em duas etapas: a 
primeira contendo uma solução aquosa de K3C6H5O7 
(citrato de potássio) e 1-propanol, e a segunda com a 
solução salina da primeira (fase do fundo) e etanol. A 
extração foi realizada em duplicata para cada um dos 
três clarificados obtidos em um sistema com massa 
total de 10 g, para isso adicionou-se 1 g de solução 
estoque do clarificado, 5,7 g de solução salina de 
citrato de potássio e 3,3 g de 1-propanol, seguindo a 
proporção de 33 % (m/m) de 1-propanol, 18 % (m/m) 
de K3C6H5O7 para 10 % (m/m) de solução estoque 
(clarificado). No entanto, não houve a formação das 
fases e adicionou-se mais 1 g de sal ao sistema. O 
sistema foi homogeneizado e deixado em repouso 
overnight à temperatura ambiente, período após o 
qual houve a formação das fases. A fase de fundo foi 
separada e a esta adicionou-se 30% (m/m) de etanol 
para a segunda extração. 
 
Cálculos 
Foi calculado o coeficiente de partição nas 
duas extrações, tanto para as proteínas totais 
(considerando o método quantificativo de Bradford) 
quanto para a eGFP. A metodologia utilizada para 
esse cálculo foi conforme a relação (1). 
 
 𝐾𝑐 =
[𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒]𝑡𝑜𝑝𝑜
[𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒]𝑓𝑢𝑛𝑑𝑜
 (1) 
 
Kc representa o coeficiente de partição do 
componente c, sendo o componente GFP ou proteínas 
totais. 
Para o rendimento de extração foi utilizada a 
equação (2). 
 
 
305 
 
 
𝑅(%) =
[𝐺𝐹𝑃]𝑓𝑎𝑠𝑒∗𝑉𝑓𝑎𝑠𝑒
[𝐺𝐹𝑃]𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗𝑉𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑋 100% (2) 
 
A pureza foi calculada utilizando a equação 
(3). 
 
𝑃 =
[𝐺𝐹𝑃]
[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠]
 (3) 
 
O fator de purificação foi calculado seguindo 
a equação (4). 
 
𝐹𝑝 =
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 𝑑𝑒 𝐺𝐹𝑃 𝑛𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 𝑑𝑒 𝐺𝐹𝑃 𝑛𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 𝑒𝑠𝑡𝑜𝑞𝑢𝑒
 (4) 
 
Por fim, o balanço de massa para avaliar a 
massa de eGFP que inicia o sistema e a massa de 
eGFP que se distribui nas respectivas fases das 
extrações foi calculado utilizando a equação (4). 
 
[𝑔𝑓𝑝]𝑐𝑙𝑎𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 ∗ 𝑉𝑖 = [𝑔𝑓𝑝]𝑡𝑜𝑝𝑜 ∗ 𝑉𝑡𝑜𝑝𝑜 
+[𝑔𝑓𝑝]𝑓𝑢𝑛𝑑𝑜 ∗ 𝑉𝑓𝑢𝑛𝑑𝑜 (4) 
 
 
Quantificação do crescimento celular 
 O crescimento celular foi avaliado retirando-
se alíquotas de 1 mL dos cultivos e realizando-se 
leituras da densidade óptica no comprimento de onda 
de 600 nm (OD600nm) no espectrofotômetro UV-Vis 
Bel Photonics UV-M51. 
 
Quantificação de proteínas 
A quantificação de proteínas totais foi 
realizada pelo método de Bradford, para isso utilizou-
se 50 μL de amostra e 1,5 mL do reagente de 
Bradford. A reação foi incubada a temperatura 
ambiente por 5 min ao abrigo de luz e então realizou-
se a leitura de absorbância a 595 nm no 
espectrofotômetro UV-Vis Bel Photonics UV-M51. 
 
Quantificação de fluorescência 
A fluorescência foi quantificada utilizando a 
leitora de placas PerkinElmer EnSpire operando nos 
comprimentos de onda de excitação e emissão 
máxima de eGFP, 488 nm e 507 nm, 
respectivamente4. 
 
Eletroforese SDS-PAGE 
Para analisar a pureza das amostras obtidas, foi 
realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida 
com sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE). 
 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Curva de crescimento 
 A figura 1 mostra o perfil de crescimento da 
E. coli nas condições fornecidas, em 12 horas de 
cultivo. 
Figura 1. Curva de crescimento da E. coli cultivada a 
37 ºC e 200 rpm. 
 A partir da curva de crescimento 
apresentada, foi possível estabelecer o momento de 
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 5 10 15
O
D
 6
0
0
 n
m
tempo (h)
 
306 
 
 
inoculação do indutor IPTG. A curva estabelece uma 
linearidade entre 2 e aproximadamente 9 horas, com 
isso determinou-se que o tempo de indução para a 
metade da fase exponencial, calculado como 4,5 h 
após o inóculo. 
 
Produção de eGFP 
 Após a adição de IPTG, foi avaliada a 
fluorescência para se comprovar a produção de GFP. 
Para tanto, foi realizada uma curva de calibração, que 
forneceu a equação y = 16936x + 2307 (ng µL-1) e 
R²=0,9924, necessária para que fosse determinada a 
concentração da proteína no meio. O monitoramento 
da produção ocorreu durante 5 horas de cultivo, 
retirando alíquotas a cada 1 hora, representado na 
figura 1. 
 Após 5 h de cultivo foi possível obter uma 
concentração média de 0,138 ± 0,02 g L-1 de GFP. 
Quando comparado com dados da literatura é 
possível notar que a produção de GFP foi satisfatória 
e teve um alto rendimento. Chew et al. (2012), 
realizou um estudo comparativo de várias condições 
e para as mesmas condições utilizadas neste estudo, 
obteve-se uma concentração de 0,048 g L-1 de GFP e 
na melhor condição testada (31 °C, 206 rpm), 0,241 g 
L-1. Subramaniam (2014) conseguiu concentrações de 
0,06, 0,04 e 0,061 g L-1 em cultivos a 30 °C. 
O grupo 2 (30 °C, 200 rpm) deste experimento 
obteve uma produção de GFP de 0,181 g L-1. 
Comparada com a produção deste grupo, resultam 
que ambos apresentam valores muito próximos de 
produção de eGFP, sugerindo que a estratégia de 
cultivo adotada neste experimento resulta em valores 
muito próximos aos valores obtidos quando o cultivo 
é realizado na temperatura reportada como ótima 
para produção de (eGFP). 
É possível dizer que a estratégia de cultivar as 
células em condições ótimas de crescimento (37 °C, 
200 rpm) e após a indução, diminuir a temperatura 
para 25 °C é uma estratégia interessante para a 
produção de GFP, isso porque no momento da 
indução existe uma grande quantidade de células já 
disponíveis para a produção de GFP enquanto que a 
diminuição da temperatura, embora retarde o 
crescimento das células, favorece a produção e o 
enovelamento correto da proteína, desta forma, 
mesmo que o crescimento seja mais lento, o grande 
número de células já disponíveis será capaz de 
produzir uma grande quantidade de proteína. No 
entanto, tempo de produção maiores poderiam levar a 
níveis de produção ainda maiores, isto porque é 
possível notar que nas três primeiras horas a 
produção é lenta e após esse período, inicia-se uma 
fase de produção (figura 2), provavelmente devido a 
uma fase de adaptação enfrentada pelo 
microrganismo devido à mudança de temperatura. 
 
Rompimento celular 
 A tabela 1 apresenta a concentração de GFP 
e proteínas totais obtidas após o rompimento celular e 
a clarificação do meio em um volume de 
aproximadamente 10 mL. 
 
Tabela 1. Concentração de GFP e proteínas totais no 
clarificado. 
Amostra [GFP] mg mL-1 [proteínas] mg mL-1 
1 2,935 2,372 
2 2,629 2,001 
3 3,080 2,187 
Média 2,881 ± 0,231 2,186 ± 0,185 
 
 
307 
 
 
 
Figura 2. Curva de produção de eGFP durante 5 h após a indução. A: Produção de eGFP em Unidades de 
Fluorescência (UF) para os três cultivos. B: Produção média de eGFP pelo tempo em unidades de concentração de 
proteína. 
 
A partir da análise destes dados é possível 
notar que provavelmente ocorreram erros de 
superestimação ou subestimação nos métodos de 
quantificação. A quantidade de GFP produzida 
(0,138 ± 0,02 g L-1) em 100 mL de cultivo resulta em 
13,8 mg enquanto que a quantidade quantificada em 
10 mL de clarificado resulta em 28,81 mg, indicando 
uma superestimação na leitura de fluorescência. Ao 
mesmo tempo, a concentração de proteínas totais é 
menor que a concentração de GFP, o que pode ser 
mais um indício da superestimação da quantificação 
de GFP por fluorescência, mas também um indício de 
subestimação do método de Bradford. 
Além disso, a partir de uma análise visual 
(figura 2), é possível notar que o rompimento não 
apresentou um alto rendimento, evidenciado pela 
forte coloração verde no pellet de células formado 
após a clarificação. Isto é justificável provavelmente 
pelo pouco tempo em que as amostras foram 
submetidas ao congelamento, baixo número de ciclos 
e ineficiência do método em si, visto que estudos 
apontamque o congelamento lento é uma alternativa 
melhor para este tipo de rompimento17. No entanto, 
conforme evidenciado através da fluorescência 
emitida pelas amostras (figura 3), uma grande 
quantidade de GFP foi extraída com sucesso. 
 
 
Figura 3. A: Pellet de células formado após a 
clarificação de um dos cultivos. B: Sobrenadante 
obtido após o rompimento celular (clarificado) 
exposto à luz negra, evidenciando a presença de GFP. 
 
Extração utilizando sistema aquoso bifásico 
Para as etapas de extração do clarificado 
celular, também foram retiradas alíquotas de ambas 
as fases formadas, tanto na primeira extração com 1-
propanol, quanto na segunda extração com etanol, 
com o intuito da quantificação dos resultados obtidos 
0,0E+00
5,0E+05
1,0E+06
1,5E+06
2,0E+06
2,5E+06
0 1 2 3 4 5 6
F
lu
o
re
sc
ê
n
ci
a
 (
U
F
)
tempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2 4 6
[G
F
P
] 
n
g
/
u
L
tempo (h)
A B 
A B 
 
308 
 
 
da concentração da eGFP pela fluorescência e das 
proteínas totais, utilizando o método de bradford. Os 
resultados são apresentados na tabela 3, para a 
primeira extração e na tabela 4, para a segunda 
extração. A figura 4 ilustra a formação de fases do 
sistema após a 1ª extração. É possível notar que a 
GFP é particionada para a fase de fundo (solução 
salina) e que há a formação de uma interfase (seta) de 
proteína precipitada. 
 
Tabela 3. Concentração de eGFP e de proteínas 
totais nas respectivas fases da primeira extração. 
1ª. Extração Topo Fundo 
Amostra 
[GFP] 
(µg uL-1) 
[PT] 
(µg uL-1) 
[GFP] 
(µg uL-1) 
[PT] 
(µg uL-1) 
1 0,1053 43,5901 270,2700 227,2402 
2 0,0375 30,7275 220,6391 199,3712 
3 0,0283 35,7296 225,4277 220,8089 
 
Tabela 4. Concentração de eGFP e de proteínas 
totais nas respectivas fases da segunda extração. 
2ª. Extração Topo Fundo 
Amostra 
[GFP] 
(µg uL-1) 
[PT] 
(µg uL-1) 
[GFP] 
(µg uL-1) 
[PT] 
(µg uL-1) 
1 62,1424 129,3411 6,8105 82,8927 
2 61,8855 112,1909 5,4377 79,3197 
3 79,0944 121,4806 10,2854 102,187 
 
Figura 4. Sistema 
bifásico formado 
após a primeira 
extração. Fase de 
topo: 1-propanol. 
Fase de fundo: 
solução salina + 
GFP. Interfase 
formada está 
indicada pela seta. 
 
Cálculos da purificação de eGFP 
A partir dos dados de extração, pode ser 
realizada uma análise mais crítica, contendo o 
rendimento das extrações e o balanço de massa da 
purificação da eGFP. Não foi possível calcular a 
pureza e fator de purificação devido a erros nos 
métodos de quantificação que forneceram 
concentrações de proteínas totais maiores que os 
valores de concentração de GFP no clarificado. A 
tabela 5 apresenta o rendimento de extração obtido 
com base na concentração média. 
 
Tabela 5. Rendimento extrativo (η) para a eGFP 
obtidos nas duas etapas de extração. 
Amostra 
η (%) 
1ª. Extração 2ª. Extração 
1 54% 25% 
2 50% 30% 
3 43% 38% 
 
Foi evidenciada a presença da eGFP na fase 
de fundo da primeira extração realizada, a qual é 
comprovada pela concentração da proteína na fase de 
fundo (tabela 3), isso certifica o efeito de salting-out 
que os sais adicionados promoveram. Já na segunda 
extração, a maior concentração da eGFP na fase de 
topo demonstra a maior solubilidade da mesma pela 
fase com o etanol (tabela 4). O rendimento 
apresentado na tabela 5, refere-se à fase de 
recuperação da eGFP, no caso da primeira extração, 
na fase de fundo e, na segunda, na fase de topo. 
Comparado à literatura8 o rendimento obtido pela 
primeira extração (média entre as triplicatas de 49%) 
foi bem abaixo do esperado (91,24%). 
Além disso, para avaliar as perdas de GFP, o 
balanço de massa foi realizado, apresentado na tabela 
6. 
 
309 
 
 
Tabela 6. Balanço de massa da eGFP calculado para 
cada etapa extrativa 
Amostra 
Balanço de Massa (%) 
1ª. Extração 2ª. Extração 
1 54,4 25,3 
2 49,6 30,7 
3 43,2 38,8 
 
É possível notar que houve uma perda 
significativa de massa de GFP durante a extração e, 
portanto, baixos rendimentos. Isso pode ser resultado 
de diversos fatores: quantidade de sal adicionada, 
tempo de incubação e pH do sistema. Durante a 
primeira extração não houve a formação de duas 
fases e adicionou-se, arbitrariamente, mais 1 g de sal 
ao sistema. Essa quantidade em excesso de sal 
juntamente com o tempo de incubação do sistema 
(overnight) pode ter contribuído para a precipitação 
de GFP, evidenciada pela presença de uma interfase 
contendo proteína precipitada. Além disso, após a 
realização das extrações, os sistemas foram 
armazenados a 4 °C durante 3 dias antes de realizar-
se a quantificação de fluorescência e proteínas totais, 
fator que também pode ter contribuído para as perdas 
e baixo rendimento. 
Outro ponto importante de acordo com Lo et 
al., é o pH do sistema de extração. O pH ótimo 
reportado para esse sistema é 10,48, no entanto, 
durante a realização dos experimentos não houve 
medição e controle do pH. Somente ao final o pH foi 
medido em 8,1, neste valor o rendimento esperado 
para a extração de acordo com Lo et al. é de 
aproximadamente 80%. Portanto, unindo os efeitos 
da falta de controle de pH, concentração de sal e 
tempo é possível justificar os baixos valores obtidos 
de rendimento. 
Os coeficientes de partição de GFP (Kgfp) e 
para as proteínas totais (Kpt) são apresentados nas 
tabelas 7 e 8, juntamente com a seletividade para 
ambas. 
 
Tabela 7. Valores do Kgfp, Kpt e da seletividade (S) 
na primeira extração do ATPS. 
1ª. Extração 
Kgfp Kpt S 
Amostras 
1 3,898*10-3 0,1918 0,0021 
2 1,699*10-3 0,1541 0,0011 
3 1,25310-3 0,1618 0,0007 
 
Tabela 8. Valores do Kgfp, Kpt e da seletividade (S) 
na segunda extração do ATPS. 
2ª. Extração 
Kgfp Kpt S 
Amostras 
1 9,1245 1,5603 5,8477 
2 11,3808 1,4144 8,0463 
3 7,6900 1,1888 6,4686 
 
SDS-PAGE 
Sabendo-se que a eGFP possui um peso 
molecular de 27 KDa foi realizada uma eletroforese 
para avaliar a pureza de GFP e a existência de 
contaminantes proteicos. O resultado é apresentado 
na figura 5. 
Observando a figura 5, nota-se uma fraca 
banda na amostra 2 que pode ser relativa à GFP 
(seta), no entanto, não foi possível detectar a proteína 
nas demais amostras. Tal fato pode ser justificado 
pela baixa concentração de GFP obtida durante as 
etapas de purificação e pela diluição da amostra que 
foi colocada no gel, evidenciando que uma 
quantidade muito pequena de proteína foi carregada 
no gel. 
 
 
310 
 
 
Figura 5. Gel de SDS-PAGE. 1: marcador de peso molecular; 2: amostra retirada após o rompimento 
celular; 3: amostra retirada após a clarificação; 4: amostra retirada da fase de fundo da 1ª extração; 5: 
amostra retirada da fase de topo da 2ª extração. Comparativo com os dados obtidos pelo grupo 2. 
CONCLUSÃO 
Foi possível produzir com sucesso e em 
quantidade satisfatória a proteína verde 
fluorescente (GFP). A metodologia empregada 
neste projeto apresentou alta produção, embora 
esta possa ser otimizada aumentando o tempo de 
produção, isso porque ao final das 5 h foi 
possível notar que a produção ainda apresentava 
um perfil exponencial de crescimento e não foi 
atingido um platô. Além disso, o rompimento e a 
extração podem ser otimizados modificando-se 
os parâmetros discutidos para um maior 
rendimento na obtenção de uma GFP pura. 
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