Produção de GFP - Biofármacos

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PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE EGFP 
OBTIDA DE Escherichia coli BL21 
 
Bruna Fernandes Silva1, Letícia Caroline Manzi Fernandes1, Letícia Rodrigues Bento1, Thainá Oliveira dos Santos1 
 
Descoberta em 1962 pelo químico japonês Osamu Shimomura, a proteína verde fluorescente, mais 
conhecida por GFP (do inglês Green Fluorescent Protein) é um tipo de proteína bioluminescente produzida 
pelo cnidário Aequorea victoria, uma espécie de medusa. Sua principal característica é a produção de luz 
verde fluorescente quando estimulada com luz ultravioleta, ademais ao ligar-se a outras proteínas as 
propriedades destes ligantes não são modificadas. Tais qualidades possibilitam a utilização da GFP no 
reconhecimento genético, atuando como marcador biológico, além de permitir o monitoramento da 
expressão de genes e das interações proteína-proteína. Atualmente, a GFP é produzida em laboratório 
majoritariamente por bactérias, como a Escherichia coli. A fim de diminuir os custos de produção e 
aumentar a produtividade, foram desenvolvidas diferentes mutantes da GFP, destacando-se a EGFP 
(Enhanced Green Fluorescente Protein). Deste modo, tendo em vista a vasta gama de aplicações da GFP 
este projeto tem como objetivo a produção e purificação da proteína EGFP produzida por Escherichia coli 
BL21 com os plasmídeos pET-28ª e plysS. O cultivo será realizado em meio Luria-Bertani (LB) sob 
temperatura de 30°C e rotação de 200 rpm, partindo de uma densidade óptica inicial igual a 0,1 A. A 
produção será induzida pela adição de Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) durante a fase 
exponencial do crescimento celular, quando a densidade óptica for aproximadamente igual a 1,0 UA. As 
proteínas totais e a EGFP serão quantificadas pelo método de leitura direta em 280 nm. Posteriormente, 
será realizado o rompimento celular por meio da técnica de congelamento/ descongelamento seguida por 
sonicação e será quantificada a produção de EGFP. 
 
A proteína verde fluorescente (GFP) é uma proteína isolada, 
inicialmente pelos pesquisadores Osamu Shimomura e Frank Johnson 
na década de 60, da medusa Aequorea victoria que apresenta grânulos 
bioluminescentes ao redor de seu corpo (CHALFIE; KAIN, 2005). A 
GFP selvagem possui 238 aminoácidos e um peso molecular de 27 
kDa, organizada em forma enovelada em conformação barril-β, foi 
popularizada pelo seu amplo espectro de aplicação na área biológica e 
de biotecnologia, compreendendo seu uso como biomarcador, 
componente em biossensor e aplicações em bioprocessos. (LOA, 2018) 
Por intermédio do amplo uso na biotecnologia e ciências 
biológicas, tornou-se necessária a produção da GFP de modo mais 
efetivo e maiores quantidades. Após o isolamento da GFP da Aequorea 
victoria, diversos estudos foram desenvolvidos para o melhoramento da 
sua fluorescência, produção e enovelamento utilizando de técnicas de 
biologia molecular. À vista disso descobriu-se que era possível 
produzir a proteínas através de cepas geneticamente modificadas. A 
Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) é uma das formas 
modificadas da proteína na qual possui mutações em uma região em 
torno do cromóforo. Assim a proteína mais eficiente foi produzida por 
cepas de E.coli modificadas. (CORMACK et al., 1996). 
A Escherichia coli é uma bactéria do tipo bacilar Gram-
negativa, encontrada principalmente no trato gastrointestinal de 
mamíferos e outras espécies de sangue quente. Em sua maioria são 
inofensivas, mas algumas cepas podem causar infecções a seres 
humanos. Amplamente estudada, a Escherichia coli, possui seu mapa 
genético muito bem estudado e definido, assim algumas cepas foram 
desenvolvidas para serem usadas em laboratório, entre elas a 
Escherichia coli BL21, tornando-se competentes para incorporação de 
plasmídeos (ISHII, 2006). 
Os plasmídeos são ferramentas utilizadas pela biologia 
molecular para fazer a transformação desejada. Para clonagem e 
expressão de proteínas recombinantes em E. coli utiliza-se o sistema 
pET, no caso o pET-28a, onde os genes alvos são clonados sob um 
forte controle de transcrição de bacteriófago T7, e a expressão é 
induzida fornecendo uma fonte de polimerase de RNA T7 na célula 
hospedeira. Os genes alvo são inicialmente clonados usando 
hospedeiros que não contém o RNA T7, eliminando a instabilidade do 
plasmídeo devido à produção de outras proteínas. Assim quando 
estabelecidos num hospedeiro de não expressão, os plasmídeos são 
transferidos para um hospedeiro de expressão contendo a cópia do gene 
do RNA polimerase T7 sob controle de LacUv5 e a expressão é 
induzida pela adição de IPTG (NOVAGEN, 1999). 
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, ou IPTG, é um 
reagente biológico que mimetiza a alolactose, um metabólito da lactose 
que desencadeia a transcrição do operon lac e por isso é utilizado para 
induzir a expressão em bactérias E. coli recombinantes (BIOLOGIC 
SCORP, 2018). Ao plasmídeo também são adicionados genes de 
resistência aos antibióticos canamicina, antibiótico aminoglicosídeo de 
espectro curto que não tem efeito sob vírus, e cloranfenicol, que é um 
antibiótico de amplo espectro produzido por Streptomyces sp 
(STRATTON, 2002). Portanto, esses antibióticos são adicionados ao 
meio de crescimento para que não ocorra contaminação da produção 
por outras espécies de microrganismos ou cepas de E. coli não 
transformadas. Nas células transformadas também é inserido o 
plasmídeo pLysS, que reconhece a falta de expressão celular e produz 
uma lisozima que causara a morte celular quando esta não expressar. 
1Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia, UNESP, Campus Araraquara, São 
Paulo, Brasil 
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A EGFP produz uma luz verde brilhante quando excitada no UV, a 
emissão máxima de fluorescência acontece entre 360-400 nm, tendo o 
seu pico de excitação aproximado em 394 nm, e pico máximo de 
emissão em aproximadamente 509 nm. Por apresentar modificações em 
seu cromóforo a EGFP apresenta menor toxicidade, maior velocidade 
de expressão e fluorescência mais intensa quando comparada com sua 
forma in natura (CHIARINI, PENNA, 2003). Em virtude das melhores 
características e do grande potencial de aplicação em bioprocessos, o 
presente estudo tem por objetivo produzir a EGFP a partir da cepa E. 
coli BL21 modificada, e avaliar os métodos de cultivo, extração e 
purificação, que possam a vir ser utilizados em trabalhos futuros. 
Resultados 
Curva de Crescimento 
A fim de determinar o tempo de indução para a produção de EGFP foi 
avaliado o padrão de crescimento da Escherichia coli, conforme 
metodologia apresentada. Partindo de uma densidade celular inicial de 
0,152 U.A. e após decorridas onze horas de cultivo foi obtida a relação 
entre a densidade óptica quantificada em 600 nm e o tempo em horas, 
conforme mostra a figura 1. 
De acordo com a curva de crescimento da E. coli pode-se perceber que 
a partir das dez horas de cultivo a densidade óptica permaneceu 
praticamente constante, indicando o fim da fase exponencial do 
crescimento bacteriano. Deste modo, foi estabelecido que a indução 
seria realizada após cinco horas de cultivo, a fim de induzir a produção 
de EGFP durante o meio da fase exponencial, de modo a obter maior 
rendimento na produção do produto de interesse, conforme AUCOIN et 
al. 2006. Ademais a fase lag teve duração de aproximadamente uma 
hora, de forma similar ao cultivo realizado por ROBICHON et al. 
2011, no qual a E. coli BL21(DE3) teve uma fase de adaptação com 
duração inferior a 1 hora. 
Produção de EGFP 
A figura 2 mostra a concentração de EGFP produzida e a densidade 
óptica após a indução com IPTG quantificadas conforme metodologia 
elucidada na de produção de EGFP. É possível perceber que a 
formação de produto teve um aumento significativo após duas horas de 
indução, tal resultado mostra-se coerente com o obtido por POHLE et 
al. 2013 que realizou
o cultivo de Escherichia coli BL21 (F– ompT 
hsdSB(rB – mB – ) gal dcm; Novagen, Merck, 69449-4 contendo o 
plasmídeo pGLO (Bio-Rad, 166-0405EDU) para a produção de GFP 
recombinante, utilizando como indutor a L-arabinose. 
Decorridas cinco horas da indução foi atingida uma concentração de 
aproximadamente 38 ng/µL de EGFP. 
 
Quantificação de proteínas totais e EGFP 
Seguidos os procedimentos descritos no item 2.5 para o rompimento 
celular, foram realizadas as metodologias analíticas de quantificação de 
proteínas totais das amostras, bem como da EGFP produzida e a 
porcentagem de pureza. 
A determinação das concentrações de proteínas totais e de EGFP 
presentes foram obtidas a partir curvas padrões fornecidas para os 
equipamentos utilizados nas análises, segundo as equações 1 e 2, 
respectivamente. 
 
y1 = 0,588x1 + 0,0188 (equação 1) 
y2= 17723x2 (equação 2) 
 
onde y1 corresponde aos valores de absorbância, x1 a concentração de 
proteínas totais em mg/mL, y2 é a fluorescência e x2 a concentração 
de EGFP em ng/uL. 
 Os valores das referidas concentrações obtidas encontram-se 
elencadas nas tabelas A e B. 
 
 
a 
Amostra A1 A2 A3 Média [P](mg/ml) 
1 0,767 0,767 0,759 0,764 12,967 
2 0,741 0,741 0,741 0,741 12,570 
3 0,722 0,713 0,722 0,719 12,196 
 
b 
Amostra F1 F2 F3 Média EGFP 
(ng/µL) 
1 34784 32870 34010 33888 191 
2 42245 44155 37664 41355 233 
3 47889 45337 41496 44907 253 
 
Tabela: a) Concentração de proteínas totais (mg/mL). B) Concentração de 
EGFP (ng/µL) 
 
A partir destes dados foi possível calcular o percentual de pureza 
alcançado neste processo, dividindo-se a concentração de EGFP 
produzida pelo teor de proteínas totais. Desta forma, como ilustrado na 
figura x, pode-se observar que as porcentagens de pureza variaram de 1 
a 2%, aproximadamente. 
 
Materiais e métodos 
Microrganismo e meio de cultura. A linhagem microbiológica 
utilizada neste projeto será a bactéria Escherichia coli BL21, 
modificada geneticamente para a superprodução da proteína verde 
fluorescente. Esta cepa contém os plasmídeos pET-28a e plysS 
construídos para a expressão da proteína EGFP, além da enzima 
lisozima e genes de resistência à canamicina e cloranfenicol como 
marca de seleção. 
Em todos os cultivos do microrganismo será utilizado meio de cultura 
Luria-Bertani (LB) composto por: triptona (10g/L), extrato de levedura 
(5g/L), cloreto de sódio (10g/L) e ágar (20g/L) para meios sólidos 
(Casal et al, 2010). O meio apresentará pH entre 7 e 8, acrescentado de 
antibióticos e compostos indutores quando necessário 
Para adaptar o microrganismo às condições de cultivo, serão 
preparados pré-inóculos a partir de amostras criopreservadas em LB 
adicionado de 40% (m/v) de glicerol. O cultivo será realizado em 
frascos tipo erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio LB com 
os antibióticos canamicina e cloranfenicol a uma concentração de 50 
ug/mL cada. Os pré-inóculos serão incubados overnight a 37°C, sob 
uma agitação de 200 rpm em um agitador orbital tipo shaker. 
 
Inóculo. Serão inoculados em 3 frascos tipo erlenmeyers de 500 mL 
volumes de células pré-inoculadas correspondentes a uma densidade 
óptica de 0,1 UA. Para isso serão retiradas amostras de 1 mL do pré-
inóculo, seguidas pela leitura de absorbância a 600 nm em um 
espectrofotômetro. 
 O volume de trabalho será 100 mL (20% do volume total), composto 
por meio LB acrescido de canamicina e cloranfenicol (50µg/mL) e os 
cultivos serão incubados a uma temperatura de 30°C e agitação de 200 
rpm por 12 horas, em um agitador orbital tipo shaker. 
 
Curva de crescimento e tempo de indução da e. Coli bl21. O padrão 
de crescimento da cepa utilizada neste estudo será obtido a partir do 
monitoramento da densidade populacional da mesma dentro de um 
período de 12 horas. Este processo será feito retirando duplicatas de 
amostras em intervalos de 1 hora do inóculo previamente feito nas 
condições descritas no item 2.3. Tais amostras serão analisadas em um 
espectrofotômetro para a medição da densidade óptica a 600 nm. 
 
 
 
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Figuras: 1) Curva de Crescimento da Escherichia coli BL21 com plasmídeos pET-28a e plysS. 2) Produção de EGFP e densidade óptica em 
função do tempo 3) Gráfico do percentual de pureza do processo. 
 
____________________________________________________________________________________________________________________ 
 
Assumindo a lei de Lambert-Beer (1852) para a correlação linear entre 
os dados, em casos necessários serão feitas diluições com meio LB. 
A partir dos dados de absorbância será construído um gráfico que 
relaciona a densidade celular em função do tempo, em que será 
possível analisar a curva de crescimento e determinar o ponto de 
indução do processo de produção da proteína de interesse, a saber, 
próximo à metade da fase exponencial do crescimento. 
 
Produção da EGFP. A produção será realizada a partir das condições 
de cultivo descritas no item 2.4 até atingir uma densidade óptica 600 
nm de aproximadamente 0,1 UA. Neste ponto, será adicionado IPTG 
na concentração de 0,005 mM para induzir a produção de EGFP. A 
produção de EGFP será acompanhada indiretamente através de leituras 
de fluorescência conforme o 2.7.2. Após terminar a produção o cultivo 
será centrifugado e o meio sobrenadante será descartado, o pellet será 
ressuspendido em um tampão de lise Tris-HCl (0,1M e pH=7,0) que 
será utilizado na etapa de rompimento celular. 
 
Rompimento celular. O rompimento será feito através de 
congelamento/descongelamento rápido. Para isto, as amostras serão 
congeladas em ultrafreezer (-80°C) e descongeladas em banho-maria a 
20°C em 3 ciclos, utilizando o tampão de lise Tris-HCl mencionado 
anteriormente. Após o último descongelamento será aplicada a técnica 
de sonicação (30 pulsos/5 segundos/10 de amplitude). Em conseguinte, 
as amostras serão centrifugadas a 4000 rpm/15min para separar os 
debris da proteína, e a EGFP no sobrenadante será quantificada, 
utilizando o tampão do congelamento como o branco nas leituras de 
fluorescência. Uma amostra de 2mL do sobrenadante deve ser 
reservada para futura eletroforese em gel de poliacrilamida com 
dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). 
 
Separação E Purificação Da EGFP. O sistema aquoso bifásico será 
utilizado para a separação e purificação de EGFP. Deverão ser feitos 
dois sistemas respectivos para uma purificação de alta performance. As 
fases dos diagramas, segundo Lo (2018), serão EtOH + Na3C6H5O7+ 
agua, EtOH+K3C6H5O7+ agua, 1-PrOH + K3C6H5O7+ agua, e 2-
PrOH + K3C6H5O7+ água. Toda a preparação e execução do sistema 
aquoso bifásico seguirão a metodología descrita em Lo (2018). 
 
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS DE PROTEÍNAS 
 
Quantificação de proteínas. A quantificação de proteínas totais será 
realizada pelo método de absorção no ultra-violeta, para isso as 
amostras serão lidas a 280 nm no espectrofotômetro UV-Vis Bel 
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Photonics UV-M51. E a partir da curva de calibração de proteínas, será 
determinada a quantidade de proteínas totais no cultivo. 
Este método é baseado no fato de que as proteínas mostram absorção 
na região de 280 nm e na região abaixo de 220 nm, sendo a primeira 
devido a diversos aminoácidos (fenilalanina, cisteína, cistina, 
metionina, triptofano, histidina e tirosina), e a segunda devido à ligação 
peptídica. No entanto, em 280 nm, em pH neutro, somente os 
aminoácidos triptofano, tirosina e cistina possuem uma absortividade 
molar significativamente grande (Zaia, et al., 1998). 
 
Quantificação de EGFP por fluorescência. A fluorescência será 
quantificada utilizando a leitora de placas PerkinElmer EnSpire 
operando nos comprimentos de onda de excitação e emissão máxima 
de EGFP,
488 nm e 507 nm, respectivamente. As amostras serão 
colocadas em microplacas de 96 poços com o fundo negro, contendo 
200 uL de amostra em cada poço. E a quantidade de EGFP será 
determinada a partir da curva de calibração (Lo et al., 2018). 
 
Eletroforese SDS-PAGE. Para analisar a pureza das amostras obtidas, 
deverão ser realizadas duas eletroforese em gel de poliacrilamida com 
sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE). Uma para a amostra armazenada 
após o rompimento celular e a outra após o processo de purificação da 
proteína. A técnica seguirá os parâmetros determinado por Lo (2018). 
 
Cálculo Do Coeficiente De Partição, Pureza e Rendimento. O 
coeficiente de partição (K) da EGFP foi calculado como a razão da 
concentração de EGFP na fase superior para a concentração de EGFP 
na fase inferior do sistema aquoso bifásico: 
 
 
 
 
 
A pureza de EGFP na amostra de fase e matéria-prima foi calculada 
como: 
 
 
 
 
 
O rendimento de EGFP (Y,%) foi calculado como a razão entre a 
concentração de EGFP na amostra de fase (fase superior ou inferior) e 
a concentração de EGFP na matéria-prima: 
 
 
 
 
 
 
 
Referencias 
1. Aucoin, M. G., McMurray-Beaulieu, V., Poulin, F., Boivin, E. B., Chen, J., 
Ardelean, F. M., … Jolicoeur, M. (2006). Identifying conditions for 
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<https://repositorium.sdum.uminho.pt/bit stream/1822/2241 /1/U1.pdf>. 
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(GFPuv) expressa em Escherichia coli. Revista Brasileira de Ciências 
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