Sequenciamento do DNA

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Resumo 
Método de degradação química ou 
clivagem: uso de compostos que quebravam 
o DNA em posições específicas, através da 
marcação em sua extremidade. 
O 
comprimento 
do 
fragmento 
identifica a 
posição da 
base, a 
sequência 
pode ser lida através do padrão de bandas 
formados na eletroforese. Permite o 
sequenciamento de no mínimo 100 bases. 
Etapas: Marcados através de uma enzima 
chamada polionucleotídeo quinase que 
transfere o fosfato do fósforo para a região 
5’ do DNA. A dissociação é feita com aumento 
de temperatura. O dimetilsulfato adiciona 
grupo metil nas guaninas e com ácido fórmico 
coloca nas adeninas. A hidrazina com alta 
concentração de sódio retira citocinas e a 
hidrozina retira citosinas e timinas. Outro 
reagente remove as bases nitrogenadas 
fragmentadas. Piperidina quebra a ligação 
fosfodiéster gerando dois fragmentos, um 
com extremidade 5’ marcada e um sem 
marcação. Cada reação em cada tubo gera 
fragmentos de tamanhos diferentes. O gel de 
eletroforese é exposto ao raio-X devido a 
presença do isótopo radioativo. É analisado do 
menor para o maior fragmento na direção 5’- 
3’. 
Vantagens e desvantagens: a sequência 
pode ser lida facilmente, porém a técnica é 
trabalhosa e usa reagentes tóxicos. 
Método enzimático: Utiliza primers 
radioativos com DNA polimerase por 
ionoforese em gel de poliacrilamida, utiliza 
didesoxinucleotídeos (sem OH na posição 3’), 
assim que ele é adicionado a DNA poliemerase 
não consegue mais adicionar outro na cadeia. 
O desoxinucleotídeo é colocado também para 
não gerar sempre fragmentos do mesmo 
tamanho. A leitura corresponde ao fragmento 
complementar que foi adicionado. 
Vantagens e desvantagens: Não utiliza 
reagentes tóxicos, porém usa isótopos 
radioativos. 
Sequenciamento automatizado: Os 
ddNTPs são marcados com fluoróforos que 
emitem ondas de tamanhos diferentes, a 
reação é realizada em um único tubo e um 
único poço na matriz. No equipamento existe 
uma luz que excita o fluoróforo e a fotocélula 
capta a onda emitida. O computador 
transforma isso em um eletroferograma. 
Cada pico é um nucleotídeo marcado. 
Eletroforese capilar: Um capilar é colocado 
na amostra e no cátodo, o fluxo de carga vai 
ser dentro dele. Conforme migram uma fonte 
de luz emite um comprimento de onda e atinge 
o fluoróforo que é detectado e gera o 
eletroferograma. 
Aplicações: Identificação de alterações 
genéticas associadas á doenças, diagnósticos, 
vacinas, fraude alimentícia, classificação de 
espécies novas e fornecimento de evidências 
moleculares da evolução. 
As metodologias do 
sequenciamento são 
capazes de identificar 
a ordem precisa dos 
nucleotídeos