Relatório 1 | Microbiologia Básica

Prévia do material em texto

1.0 Introdução 
Microbiologia é a ciência que estuda os organismos demasiadamente pequenos para 
serem visualizados a olho nu, ou seja, estuda os microrganismos. O foco dessa ciência 
são bactérias, vírus, fungos, algas e protozoários, ressaltando que alguns fungos e algas 
podem ser vistos a olho nu sim. 
Os microrganismos são seres ubíquos, encontrados em diversos lugares ao mesmo 
tempo, variando de acordo com sua especificidade. Assim para estuda-los é necessário 
cultivá-los em laboratório e isolá-los em uma cultura pura, visto que naturalmente 
crescem em populações complexas, misturadas, contendo diversas espécies, 
impossibilitando o estudo de uma em especifico. 
Para cada microrganismo têm-se um cultivo especifico, variando de acordo com o meio 
de cultura, exigências nutricionais adicionais, fatores físicos dentre outros. Comparando 
bactérias, fungos leveduriformes e fungos micelianos temos que, 
Bactérias Fungos leveduriformes Fungos micelianos 
 Tem preferência 
pelo meio nutriente 
ou meio LB; 
 pH próximo ao 
neutro; 
 Não necessita de 
alta concentração de 
glicose; 
 Cultivadas em 
temperatura 
próxima à 37ºC; 
 Fácil observação 
após o isolamento; 
 Dentro de 24h já 
nota-se formação de 
colônias. 
 Tem preferência 
pelo meio 
Sabouraud; 
 pH baixo; 
 Necessita de alta 
concentração de 
glicose; 
 Cultivados em 
temperatura 
próxima à 28ºC; 
 Fácil observação 
após o isolamento; 
 Dentro de 24h nota-
se formação de 
colônias. 
 Tem preferência 
pelo meio 
Sabouraud; 
 pH baixo; 
 Necessita de alta 
concentração de 
glicose; 
 Cultivados em 
temperatura 
próxima à 28ºC; 
 Para observar suas 
estruturas realiza-se 
o microcultivo; 
 Demora de 5 a 7 
dias, para observar o 
desenvolvimento. 
 
Como os micelianos são mais complexos estruturalmente que os leveduriformes e as 
bactérias, realizamos o microcultivo- procedimento utilizado para identificar as 
estruturas fúngicas, permitindo a observação de seu micélio e demais estruturas, 
possibilitando classifica-lo. 
Quando tratamos da observação de bactérias e leveduras no microscópio objetivando 
diferenciá-los em grupos de interesse, tratamos de dois preparos distintos que permitem 
sua observação, sendo o preparo à fresco e o preparo fixado. 
O preparo microscópico à fresco compreende na deposição do espécime sobre a lâmina 
adicionando um corante vital, é um pouco mais difícil de trabalhar uma vez que os 
espécimes estão vivos, possuem tamanho reduzido e apresentam índice de refração 
muito próximo ao da água, contudo é uma técnica extremamente útil na observação da 
viabilidade, atividades celulares, tamanho e forma natural das células microbianas. 
Já o preparo microscópico fixado, consiste na fixação do espécime por calor, matando-
o, sendo dividido ainda na técnica de coloração simples e de endósporos bacterianos. 
 
 
Ambas as técnicas passam pela fixação por calor, divergindo apenas na adição de um 
corante especial que permite a visualização de formas de latência de algumas bactérias. 
E assim como o preparo citado anteriormente, tem como objetivo visualizar e diferenciar 
as formas e arranjos exibido pelas células microbianas. 
Além dos preparos microscópicos já citados, temos técnicas que nos permite identificar 
as bactérias quanto às suas propriedades de coloração, como a coloração álcool-ácido 
e a coloração diferencial de Gram. Essa última coloração divide as bactérias em duas 
classes- Gram-negativa e Gram-positiva, baseando se nas propriedades das paredes 
celulares desses microrganismos. 
De nada adianta, cultivar o microrganismo, isolá-lo, identifica-lo mediante sua forma, 
coloração e não conservá-lo. Para conservar os microrganismos temos métodos 
diferentes, de acordo com o tempo que o pesquisador, aluno ficará fora do laboratório. 
À curto prazo, uma repicagem já é suficiente, sendo realizada a cada 7 dias, 15 dias, 
dependendo do MO; à médio prazo temos como possibilidade o congelamento com 
glicerol (20 a 40%) e a longo prazo o congelamento em nitrogênio líquido ou ainda a 
liofilização. 
O objetivo das práticas realizadas no laboratório de microbiologia geral vem a ser a 
familiarização com as principais técnicas usadas neste laboratório, os cuidados com 
biossegurança, assim como nos possibilitar averiguar a presença de microrganismos 
em diferentes ambientes, por meio do seu cultivo; isolar microrganismos em meio sólido 
e a partir deles produzir uma cultura pura de bactérias e leveduras, além de por meio de 
preparações microscópicas observar sua viabilidade, e suas formas; utilizar técnicas de 
coloração diferencial para distinguir as bactérias em Gram-positiva ou Gram-negativa; 
realizar o microcultivo de fungos micelianos, assim como observar suas estruturas 
mediante adição de corante. 
 
2.0 Materiais e Métodos 
2.1 Métodos 
2.1.1 Ubiquidade de Microorganismo 
Para a averiguação da presença de micro-organismos no ambiente ou em outros locais 
e objetos, é necessário expor a placa ou o tubo a uma condição de inoculação como a 
exposição ao ar, contato com a pele ou com o cabelo. Pode-se também coletar o 
material do meio e inocular ao meio de cultura sólido ou líquido, em placas ou tubos. 
Ar: Removemos a tampa da placa, contendo AN estéril ao ar por 15 minutos, colocando-
as sobre algum ambiente que se deseja avaliar. Logo após esse tempo com a placa 
aberta, levamos para estufa de 37°C. 
Pele, cabelo e saliva: Utilizando uma caneta marcadora, divide-se a tampa da placa 
com AN em 3 partes. Passa-se o dedo sobre o ágar em uma das divisões; deposita-se 
um fio de cabelo em outra divisão; E com um swab, passa-se na boca e estria-se na 
placa, na terceira divisão. 
Assepsia das mãos 
1. Divide-se a tampa da placa de AN em 3 partes, com uma caneta marcadora. 
 
 
2. Passa-se o dedo sem lavar em uma das divisões. 
3. Após lavar as mãos com detergente em todas as superfícies, passa-se o dedo 
sobre a segunda divisão da placa. 
4. Lava-se as mãos em água e detergente, e aplica-se álcool 70% em toda superfície 
das mãos, e por fim passar o dedo sobre a terceira divisão da placa. 
Solo: Diluí-se a terra coletada em um Becker e deixamos decantar. Adicionar 1mL da 
suspensão da terra coletada em um tubo à parte, diluição de 10-¹. Repetir a operação a 
partir desse para fazer a diluição 10-². Após adicionar cada diluição em placas 
separadas de AS. Incuba-se as placas e espera-se alguns dias para observar a 
presença e a diversidade microbiana. 
 
2.1.2.1 Isolamento de Micro-organismo (Cultura Puras de Levedura 
e Bactérias em meio sólido) 
 2.1.2.1.2 Isolamento de cultura pura de bactéria e de levedura por 
esgotamento em estrias 
 
Esterilizou-se alça de repicagem, ou seja, flambar e alça ao rubro e resfriar; com 
auxílio da alça de repicagem, coletou-se assepticamente uma colônia isolada de uma 
placa contendo colônias previamente crescidas. Transferiu-se a colônia contida na alça 
de repicagem para superfície no meio NA de uma nova placa. Espalhar por estria 
simples ou composta. 
 
Utilizou-se a técnica de estria composta: dividiu-se a placa em 4 quadrantes 
imaginários. Espalhou-se o inoculo no 1 quadrante, esgotando-se a alça de repicagem, 
em movimento zig-zag. Flambou-se novamente a alça e esfriou-a, encostando na 
superfície do ágar. Girou-se a placa 90º graus tocando no canto final da estria do 
primeiro quadrante e deslizou-se várias vezes, repetindo o movimento zig-zag até o 
outro extremo do segundo quadrante. Flambou-se novamente a alça e resfriou-a. Girou-
se a placa 90º graus repetindo o procedimento anterior. Finalmente, no quarto 
 
 
quadrantes da placa fez estrias espaçadamente a partir do terceiro quadrante e 
espalhou-se no sentido inverso. A alça não deve tocar nenhuma das estrias previamente 
formadas. Após fazer as estrias esterilizou-se as alças de repicagem, identificou-se a 
placas na borda no fundo, e então encubou-as em posição invertida, em temperatura 
apropriada (37º e 28º) por 24 horas. Observou-seo crescimento de colônias isoladas. 
No dia seguinte, coletou-se a colônia isolada e a inoculou em um tubo meio líquido e 
incubou-se por 24 horas. 
2.1.2.3 Técnica do micro cultivo para observação de fungos 
miscelianos 
 Utilizou-se micro-organismo previamente crescidos em tudo com ágar Sabouraud 
inclinados ou placas de ágar. 
Iniciou-se esterilizando a pinça, ou seja, mergulhando-as no álcool flambando 
em bico de Bunsen, então com auxílio da pinça cortou-se um pedaço do ágar, este 
pedaço deveria ter dimensão menor que uma lamínula, após isso removeu-se este cubo 
depositou-o sobre o restante do ágar. Posteriormente, flambou-se uma alça de platina 
ao rubro, então inoculou-se na porção mediana lateral do fragmento de ágar uma 
amostra da cultura pura do fungo desejado, fazendo pequenas nas bordas dos 
fragmentos do ágar. Utilizou-se a pinça para colocar sobre o ágar inoculado uma 
lamínula estéril. Esperou-se 5 e 7 dias, então removeu-se a lamínula e deposito-a sobre 
uma lâmina contendo corante azul de metileno, o que permitiu o estudo da 
micromorfologia, observando-as no microscópio óptico em objetiva de 10 a 40x. 
2.1.2.4 Técnicas microscópicas a fresco 
Iniciou-se flambando as alças de repicagem ao rubro, então colocou-se sobre uma 
lamina, previamente limpou-a com álcool e gaze, uma gota de agua destilada, 
espalhando com auxílio da alça de repicagem o material a examinar. Então adicionou-
se uma gota do corante azul vital, então encostou-se uma das bordas da lamina na gota, 
deixando-a que descesse suavemente para evitar a formação de bolha, então observar 
m microscópio ótico. 
2.1.2.5 Preparação microscópicas fixadas: coloração simples e de 
endósporos bacterianos 
2.1.2.5.1 Preparo do esfregaço 
Iniciou-se flambando as alças de repicagem ao rubro, então colocou-se sobre 
uma lamina, previamente limpou-a com álcool e gaze, uma gota de agua destilada, 
espalhando em movimentos circulares com auxílio da alça de repicagem uma colônia 
de bactérias, até obteve-se uma camada uniforme. Deixou-se secar um pouco ao ar. 
Então iniciou-se a fixação do esgregaço, ou seja, passou-se algumas vezes a lâmina no 
lado oposto sobre o bico de Bunsen, evitou-se o aquecimento excessivo, deixou-se a 
lâmina esfriar ao ar. Para iniciar a coloração, utilizou-se bandejas e estantes (suportes) 
colocadas na bancada. Inicialmente, cobriu-se o esfregaço com safranina deixando agir 
por 30 segundos, após isso lavar com água e deixar secar ao ar. Colocou-se sobre a 
lamina uma gota do olho de imersão, e então observar no microscópio ótico com 
luminosidade intensa. 
 
 
2.1.2.5.2 Procedimento para observação dos endósporos 
bacterianos 
Iniciou-se flambando as alças de repicagem ao rubro, então colocou-se sobre 
uma lamina, previamente limpou-a com álcool e gaze, uma gota de agua destilada, 
espalhando em movimentos circulares com auxílio da alça de repicagem uma colônia 
de bactérias, até obteve-se uma camada uniforme. Deixou-se secar um pouco ao ar. 
Então iniciou-se a fixação do, ou seja, passou-se algumas vezes a lâmina no lado oposto 
sobre o bico de Bunsen, evitou-se o aquecimento excessivo, deixou-se a lâmina esfriar 
ao ar. Para iniciar a coloração, utilizou-se bandejas e estantes (suportes) colocadas na 
bancada. Inicialmente, cobriu-se a lâmina com corante verde malaquita, passando a 
lamina sobre a chama 3 vezes, deixou-se esfriar por cinco minutos. Lavou-se a 
preparação com agua desliada, então corou-se o esfregaço com safranina por 30 
segundos, lavou-se e secou-se ao ar. Colocou-se sobre a lamina uma gota do olho de 
imersão, e então observar no microscópio ótico com luminosidade intensa. Após o 
exercício prático descartou-se o material 
 
 
3.0 Resultados e Discussões 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.1 Ubiquidade dos Micro-organismo 
Na placa com ágar nutriente de número 1, após um tempo mínimo (15 minutos) 
de exposição na parte superior sobre coluna divisória das cabines dos banheiros, não 
se observou formação de colônias, como já se era esperado. 
Na placa com ágar nutriente de número 2, observou-se formação de colônias de 
bactérias. No quadrante em que a mão não passou por nenhum processo de 
limpeza/assepsia houve crescimento esperado de colônias bacterianas, e também de 
uma levedura. No quadrante em que mão foi lavada com água e sabão, surpreendeu-
se o crescimento semelhante de bactérias e levedura, esta mesmo que menor, que no 
primeiro quadrante observado. No terceiro e último quadrante, em que se fez um 
processo completo de assepsia das mãos, ou seja, lavando com água e sabão, secando 
em papel toalha estéril e finalizando com álcool etílico 70%, surpreendeu-se novamente 
por ainda haver um número considerável de colônias de bactérias. Levando em conta 
que o material foi recolhido no ambiente do laboratório de microbiologia pode-se concluir 
que a má ou a não higienização de um manipulador ou de um equipamento pode 
interferir de modo quantitativo e qualitativo na análise microbiológica. Após analisados 
os resultados, fica clara a importância da higienização de seu local de trabalho, das 
pessoas que vão realizá-lo e da prática correta dos procedimentos a serem realizados 
na análise, para que assim se tenha uma maior confiabilidade nos resultados. 
Na placa com ágar nutriente de número 3, o primeiro quadrante a ser analisado 
foi o do fio de cabelo, este foi retirado com raiz do couro cabeludo. De acordo com a 
literatura o couro cabeludo é uma região com grande número de glândulas sudoríparas 
e sebáceas que por manter o ambiente úmido e disponibilizar nutrientes, propiciam a 
proliferação de microrganismos, de tal forma que se estima que existam 1.500.000 de 
bactérias/ cm2 no couro cabeludo, além dos fungos. (WICHROWSK, 2007). O couro 
cabeludo apresenta relativa proteção frente à patógenos, sendo o sebo, quando 
produzido em concentrações adequadas, essencial a essa condição, porém, em 
algumas faixas etárias, ocorrem mudanças na composição sebácea, o que favorece a 
colonização bacteriana (COSTA, et al, 2008). A partir disso, conclui-se que a pouca 
quantidade de colônias encontradas está adequada, e de acordo com se esperava. 
No segundo quadrante analisado foi o da saliva, o qual com auxílio de um swab 
passou-se saliva sobre o ágar nutriente. De acordo com literatura a saliva é um fluido 
que banha constantemente a boca, a saliva pode ser considerada a maior responsável 
pela regulação da microbiota supra gengival. Além de oferecer excelentes condições 
ambientais para as bactérias (temperatura, pH, umidade etc.), a saliva é um excelente 
caldo nutritivo, principalmente por conter todos os nutrientes derivados da dieta do 
hospedeiro que nela se encontram solubilizados. Mas, por outro lado, na saliva, 
existem vários mecanismos que limitam o desenvolvimento microbiano, principalmente 
substâncias antimicrobianas, alterações prolongadas de pH e ação mecânica de 
lavagem (fluxo salivar) (LORENZO). A partir disso, conclui-se que a quantidade de 
colônias observadas na placa é consentânea com o esperado. 
No terceiro e último quadrante foi avaliado a pele, esta também foi analise da 
pele da mão não lavada do outro integrante da dupla. Como dito anteriormente, houve 
um crescimento expectável das colônias bacterianas, ainda que um pouco menor do 
que o anterior. 
 
 
3.2 Isolamento de cultura pura de bactéria e de levedura por 
esgotamento em estrias 
 
Realizado no dia 19/09/2018 utilizando a cultura realizada no exercício prático 
anterior, de amostra de solo isolou-se a bactéria e o micro cultivo e também para 
próximo exercício prático seguinte. 
 
 
 
 De acordo com a literatura o solo é geralmente um bom ambiente para o 
crescimento de microrganismos, sendo observável o desenvolvimento de colónias na 
superfície das partículas de solo. Os microrganismos encontrados no solo incluem vírus, 
bactérias, fungos, algas e protozoários, e os seus números são geralmente superiores 
àqueles encontradosem ambientes aquáticos. Em geral as colónias de microrganismos 
distribuem-se de modo não-uniforme na superfície das partículas de solo. Os fungos 
(com a exceção das leveduras) são aeróbios e abundantes na maioria dos solos de 
superfície. Apesar de estarem presentes em número inferior ao das bactérias, os fungos 
contribuem geralmente com uma maior proporção para o total de biomassa microbiana 
do solo, o que se deve à sua maior dimensão celular relativamente a outras formas 
microbianas. Os fungos são importantes componentes do solo em particular no que se 
 
 
refere à sua participação nos ciclos de nutrientes, e na decomposição da matéria 
orgânica (NICOLAU, 2016) 
 Como pode ser observado na imagem, o isolamento bactéria foi facilmente 
realizada obtendo sucesso, uma vez que, na placa originária a bactéria estava 
claramente perceptível, ou seja, possuía forma circular, pequena e lustrosa, o que 
caracteriza uma colônia de bactéria. 
 
3.3 Técnica do micro cultivo para observação de fungos 
miscelianos 
 
Seguindo as instruções do roteiro, obteve-se o seguinte resultado: 
 
 
Imagem: Micro cultivo obtido; 
Imagem: Micro cultivo obtido, 
evidenciando a lamínula; 
 
 
A partir da análise microscópica, ou seja, observando tanto os miscélios, quanto 
estruturas reprodutivas, pode-se concluir que o fungo analisado, Fusarium sp. 
 
O Fusarium sp. é um fungo que apresenta em torno de 775 espécies e subespécies. É 
fungo cosmopolita, sendo encontrado no solo, ar, plantas e alimentos (Urben et al., 
2010). É um gênero grande de fungos amplamente distribuídos no solo e em associação 
com plantas. A maioria das espécies são sapróbios inofensivos, absorvendo 
substâncias orgânicas provenientes de matéria orgânica em decomposição. 
Abundantes no solo, algumas espécies produzem micotoxinas em cereais que se 
entrarem na cadeia alimentar podem afetar a saúde humana e animal. As principais 
toxinas produzidas por Fusarium são fumonisinas e tricotecenos. (Zipcodezoo, 2010). 
 
3.4 Técnicas microscópicas a fresco 
 Técnica realizada pelo professor para demonstração em aula. 
 
3.4 Preparação microscópicas fixadas: coloração simples e de 
endósporos bacterianos 
 A partir da observação microscópica notou-se a presença poucos de Bacillus 
subtilis. Bacillus subtilis são bastonete Gram-positivo, aeróbio facultativo, não 
patogênico, produtor de ácido acético, formador de esporos, podendo ser 
frequentemente isolado no solo. Além disso, obteve-se uma pequena de endósporos 
bacterianos, ou seja, forma de resistência bacteriana. 
 
 
 
 
 
3.5 Coloração diferencial de Gram 
Como pode-se observar na fotografia, após a todo processo de coloração, foi 
possível identificar apenas de bactéria Gram negativas, não sendo possível distinguir 
qual espécie. 
 
 
4.0 Conclusão