Cromatografia Líquida De Alta Eficiência

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Cromatografia Líquida De Alta Eficiência - HPLC
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) se desenvolveu muito nos últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida por que a sua fase móvel é um solvente.
 Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica, detector e o registrador. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis.
 	A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vários solventes, três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila.
Como fase estacionária utilizam-se sólidos ou semirígidos, cujas partículas porosas esféricas ou irregulares apresentam diferentes diâmetros e suportam pressão até 350 bar.
 	A coluna cromatográfica é feita de um material inerte que resiste a todas as pressões em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna é determinada pelo comprimento, diâmetro e pelo material de recheio. As colunas geralmente utilizadas são: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH2 (amina). Quanto aos detectores, não existe um que apresente todas as propriedades para que ele seja ideal para CLAE. Não são versáteis, ou universais, mas existem detectores que apresentam ampla faixa de aplicações. A sensibilidade de um detector é determinada a partir da relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal. A linearidade é a faixa linear do sistema, onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto.
 	Os detectores mais usadas na CLAE são os fotométricos, baseados na absorbância no ultra violeta e no visível. Os detectores de fluorescência, utilizados como método de detecção específica, são sensíveis para substâncias que fluorescem. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem picograma. Também são utilizados detectores por índice de refração, os quais acompanham continuamente a diferença no índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta deste detector é moderada, geralmente de ordem micrograma.
Esquema de um sistema de HPLC
 
Objetivo
O objetivo do artigo foi determinar, os teores de bixina e norbixina em várias marcas e lotes de colorífico, por CLAE
Métodos 
Foram analisadas amostras de sete marcas de colorífico. Todos as marcas apresentavam os ingredientes urucum e bixina no rótulo da embalagem
Todas as separações foram conduzidas em colunaC18 (Spherisorb ODS-2, 150mmx4,6mm, tamanho departícula 3µm), com fluxo de 1mL/min. 
Várias combinações de solventes foram investigadas,mas a que apresentou melhor resultado foi acetonitrila:ácido acético 2% (65:35) descrita por SCOTTER et al.[15], que separou os carotenóides incluindo isômeros em 22min, e cujos picos apresentaram-se simétricos, sem cauda e espectrofotometricamente puros.Os picos correspondentes à bixina e norbixina foram identificados através do comportamento cromatográfico e comparação dos espectros no UV-visível fornecidos pelo detector de arranjos de diodos com os fornecidos na literatura [3, 5].
Para a quantificação da solução-padrão de bixina utilizou-se coeficiente de absorção de 2826 (λmax 470nm) em clorofórmio [5, 16] e para a da norbixina 3473 emsolução de KOH 0,5% a 453nm [16]. A curva-padrão da bixina foi linear na faixa estudada (10 a 140µg) e apresentou coeficiente de correlação (R2 ) de 0, 996, assim como a curva-padrão da norbixina na faixa de 6 a 34µg que mostrou R2 de 0, 968. A quantificação dos carotenoides foi feita por comparação da área do pico da amostra com a área do padrão injetado diariamente.
Conclusao:
O método avaliado mostrou ser preciso, exato e prático e rápido lendo aproximadamente 30 minutos cada análise, decorrente da redução das partículas da fase estacionária, que possibilita a detecção de substâncias presentes em baixas concentrações e uma separação mais eficiente.
Os resultados mostram que as indústrias produtora de colorífico, possuem um bom controle de qualidade de matéria-prima e processo, entretanto apresentou uma variação de até 100% entres os teores de carotenóides das diferentes marcas.
Recomenda-se que seja estabelecida uma quantidade de urucum a ser adicionada ao colorífico, que posse ser controlada através da quantidade de Bixina pelo método de Cromatografia de Alta Eficiência (CLAE) com a finalidade de uniformizar a coloração deste tipo de produto.