Apostila MAP Revisada 2016

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Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro 
CPGA-CS 
 
 
 
 
 
Métodos de Análises em 
Plantas 
 
Sonia Regina de Souza 
Professora Titular-Bioquímica 
Lab. Bioquímica de Plantas-UFRRJ 
 
Departamento de Química/ ICE 
BR 465 km 7 – Seropédica -CEP 23897-000, RJ 
E-mail: soniabq@ufrrj.br 
mailto:soniabq@ufrrj.br
2 
 
SUMÁRIO 
 
PREPARO DO MATERIAL .......................................................................................................................................................................................... 3 
EXTRAÇÃO ALCÓOLICA EM MATERIAL VEGETAL FRESCO. ......................................................................................................................... 5 
DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE NITRATO EM TECIDO VE GETAL (Miranda et al., 2001) (modificado) ......................................... 6 
DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE NITRATO EM TECIDO VEGETAL (Cataldo et al., 1975) ................................................................. 8 
DETERMINAÇÃO DE AMÔNIO (Método colorimétrico-Mitchel, 1972; Felker, 1977 ........................................................................................... 10 
DETERMINAÇÃO DE N-AMINO LIVRE - Método da Ninidrina (Yemm e Cocking, 1955). ................................................................................. 13 
DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS (Yemm e Willis, 1954). .............................................................................................................. 16 
ANÁLISE DE PLANTAS EM MATERIAL SECO .................................................................................................................................................... 19 
Digestão Nitro-perclórica para Macronutrientes: (P, K, Ca, Mg, S) (Bataglia et al., 1983) ........................................................................................ 19 
Digestão Sulfúrica para Macronutrientes. (N, P, K, Ca, Mg) (Tedesco, 1995) ............................................................................................................ 21 
DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO (Destilação por arraste de vapor e titulação) ............................................................................................... 23 
DETERMINAÇÃO DE N-TOTAL. (Tedesco, 1995). ................................................................................................................................................. 26 
PADRÃO MISTO DE FÓSFORO, POTÁSSIO, CÁLCIO E MAGNÉSIO................................................................................................................ 32 
DETERMINAÇÃO DE POTÁSSIO (Fotometria de Chama) ...................................................................................................................................... 33 
DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO ............................................................................................................................................................................. 35 
DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO E MAGNÉSIO (Espectrofotometria de Absorção Atômica) ................................................................................ 37 
DETERMINAÇÃO DE ENXOFRE ............................................................................................................................................................................. 40 
DETERMINAÇÃO DE COBRE (Espectrofotometria de Absorção Atômica) ........................................................................................................... 41 
DETERMINAÇÃO DE MANGANÊS (Espectrofotometria de Absorção Atômica) .................................................................................................. 42 
DETERMINAÇÃO DE ZINCO (Espectrofotometria de Absorção Atômica) ............................................................................................................. 43 
SOLUÇÕES PADRÃO MÚLTIPLAS DE COBRE, MANGANÊS E ZINCO ........................................................................................................... 44 
DETERMINAÇÃO DE NITRATO POR arraste de vapor com Liga de Devarda ....................................................................................................... 46 
DETERMINAÇÃO DE AMÔNIO. (Método de arraste de vapor sob MgO). ................................................................................................. 46 
ATIVIDADE DA GLUTAMINA SINTETASE (GS). ................................................................................................................................................ 47 
ATIVIDADE DA NITRATO REDUTASE (NRA) (Javrosky, 1973). ........................................................................................................................ 52 
MEDIDA DA QUANTIDADE DE PROTEÍNA (Bradford, 1976) ............................................................................................................................. 53 
Bibliografia ................................................................................................................................................................................................................... 55 
3 
 
PREPARO DO MATERIAL 
1) MATERIAL 
 
1.1). Verificar se o material está em boas condições sem rachaduras ou trincado; 
1.2). Se as pontas das pipetas e buretas estão intactas; 
1.3). Se as torneiras se adaptam bem aos orifícios vedando-os adequadamente; 
 
2) LIMPEZA DO MATERIAL 
 
2.1). Toda aparelhagem de vidro deve estar absolutamente limpa ao ser usada; 
2.2). Todo material de vidro ou porcelana deve ser lavado imediatamente após seu uso; 
2.3). Os aparelhos volumétricos devem ser totalmente desengordurados. A presença de traços de gordura provoca a retenção de líquido sob a 
forma de gotículas nas paredes dos recipientes, impedindo seu escoamento total; 
2.4). Jamais guardar vidraria suja; 
2.5) Sequência para limpeza do material: 
 a). Lavar frascos, balões béchers, pipetas, buretas, etc., primeiro com água e deter gente e, se necessário, com auxílio de escova; 
 b) Em seguida, lavar repetidas vezes com água corrente; 
 c). Escovar com mistura sulfocrômica, para remover os últimos traços de gordura (ver procedimento para lavagem com mistura 
sulfocrômica) 
 d). Finalmente, lavar em água destilada. 
 
3) PREPARO E USO DA MISTURA SULFOCRÔMICA 
 
3.1) Preparo da mistura sulfocrômica 
 
 a). Misturar 20 g de dicromato de potássio finamente triturado com água suficiente de modo a formar uma pasta 
 b). Adicionar, vagarosamente e com agitação constante, 300 mL de ácido sulfúrico comercial (93%) 
 c). Guardar a solução, juntamente com o excesso de dicromato de potássio, em frasco dotado de rolha de vidro esmerilhado 
 
 
 
3.2) Procedimento 
4 
 
 
 a). Molhar toda a parede interna do recipiente com a solução; 
 b) Objetos pequenos podem ser mergulhados na mistura sulfocrômica; 
 c). Retornar a solução ao bécher primitivo (a solução poderá ser usada - repetidas vezes - até tomar coloração verde, resultante da redução do 
dicromato de potássio); 
 d). Lavar o recipiente repetidas vezes com água corrente e, finalmente, duas vezes com pequenas porções de água destilada; 
 e). Se o recipiente foi adequadamente desengordurado, a água escoará uniformemente, sem haver retenção de gotículas nas paredes. 
 
3.3 - Cuidados: a solução sulfocrômica, em contato com a pele ou tecido, destrói os mesmos. Respingos na roupa ou na pele, devem ser 
imediatamente lavados com água em abundância e, em seguida, tratados com uma pasta de hidrogeno-carbonato de sódio ou de 
bórax. Porções caídas sobre a bancada ou chão devem ser imediatamente neutralizadas com hidrogeno-carbonato de sódio e depois 
lavadas com água. 
5 
 
EXTRAÇÃO ALCÓOLICA EM MATERIAL VEGETAL FRESCO. 
 
1) COLETA DO MATERIAL: 
- 1 g de amostra + 20 mL de etanol 80%. 
 
2) EXTRAÇÃO: 
- Colocar a amostra com etanol no triturador ou almofariz; 
- Homogeneizar e triturar por 3 min;- Passar o material em 4 camadas de gaze e papel de filtro; 
- Recolher o filtrado e transferir para funil de separação. Secar o resíduo ao ar livre; 
- Adicionar ao funil volume de clorofórmio igual ao da solução alcoólica; 
- Agitar suavemente, destampar o funil e deixar em repouso, por 40 min., até completa separação da fase polar e apolar; 
- Descartar a fase apolar e completar a fase polar p/ 25 mL com etanol 80% e guardar em geladeira até a hora das determinações. 
 
DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS NO EXTRATO ALCOÓLICO: 
 N-amino livre, N-NO3
- 
, N-NH4
+
; 
 Açúcares solúveis; 
 Amidas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE NITRATO EM TECIDO VE GETAL (Miranda et al., 2001) (modificado) 
 
1) REAGENTES 
 
a) N-Naftil-etilenodiamino 
 
- Pesar 0,01 g de N-Naftil, dissolver e completar até 50 mL de H2O ultrapura. 
 
b) Sulfanilamida 0,4% em HCl (1 M) 
 
- Pesar 0,4 g de sulfanilamida e dissolver com HCl (1 M) até completar 100 mL. 
 
c) Cloreto de Vanádio III (VCl3) 
 
- Pesar 0,250 g de VCl3 e dissolver em HCl (1 M) até completar 50 mL. 
 
PREPARO CLORETO DE VANÁDIO - Adicionar 20 mL de HCl (1 M) em um Becker sobre uma balança e tará-la. Dentro da capela de 
exaustão, adicionar aos poucos o VCl3 até que se obtenha o peso desejado (0,250 g). Em seguida (em proveta) elevar o volume até 50 mL com HCl 
(1 M). Caso exceda o peso de 0,250 g ou der um valor inferior fazer uma regra de três para ajustar o volume de HCl (1 M). Obs.: O reagente VCl3 
(sólido) não pode ficar aberto por muito tempo, pois retém umidade e oxida. 
 
Ex.: 0,250 g ------------ 50 mL 
 0,270 g ------------- x 
 X=0,270 x 50 X= 54 mL (neste caso avolumar até 54 mL com HCl 1 M) 
Obs.: Guardar este reagente em um frasco âmbar coberto com papel alumínio na geladeira. Validade de 2 semanas. 
 
d) Reação de GRIESS 
 
Misturar os reagentes a, b e c na seguinte proporção 1:1:2, respectivamente. 
Ex.: 5 mL de sulfanilamida + 5 mL de N-Naftil +10 mL de VCl3. Obs. A mistura dos reagentes tem que ser feita na hora. 
 
7 
 
2) PREPARO DO PADRÃO 
 
- Preparo do estoque de KNO3 (5 mmol L
-1
): pesar 0,0505 g de KNO3, dissolver e elevar o volume até 100 mL com água ultrapura. 
 
Volume de solução estoque a ser 
pipetado (mL) 
 Concentração final (µmoles L
-
1
) 
0,02 mL 
Completar com água 
ultrapura até o volume final 
de 10 mL 
10 
0,05 mL 25 
0,10 mL 50 
0,20 mL 100 
0,30 mL 150 
0,40 mL 200 
0,50 mL 250 
 (Obs.: para o ponto zero da curva padrão adicione 0,03 mL (30 µL) de água ultrapura). 
 
3-PROCEDIMENTO REDUZIDO 
 
- Pipetar 0,03 mL (30 µL) de amostra ou padrão; 
- Pipetar 0,06 mL (60 µL) do reagente de Griess (Reagente d); 
- Deixar aquecer 50 minutos em repouso na estufa à 40º C; 
- Adicionar 0,11 mL (110 µL) de água ultrapura; 
- Leitura: 540 nm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE NITRATO EM TECIDO VEGETAL (Cataldo et al., 1975) 
 
1) REAGENTES. 
 
a) 200 mL de Ácido Salicílico 5% em H2SO4 concentrado. 
-Pesar 10 g de Ácido Salicílico e dissolver até 200 mL com H2SO4 concentrado. 
 
b) 1000 mL de NaOH 2N 
-Pesar 80 g de NaOH e dissolver até 1000 mL com água destilada. 
 
2) PREPARO DO PADRÃO 
a) Padrão de N 
- Preparo do Estoque contendo 5 g N/1000 mL: pesar 3,611 g de KNO3 
- Dissolver e completar o volume até 100 mL com água destilada 
 
b) Preparar a partir do estoque de 5 g N/1000 mL as seguintes soluções: 
 
Volume de estoque a ser 
pipetado (mL) 
 Concentração do Padrão 
(g N/0,1 mL) 
Completar em balão volumétrico 
até 50 mL com água destilada 
0,05 0,5 
0,1 1,0 
0,25 2,5 
0,5 5,0 
1 10,0 
1,5 15,0 
2 20,0 
2,5 25,0 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
3) PROCEDIMENTO: 
- Pipetar 0,05 mL de amostra ou padrão (Obs.: para o ponto zero da curva padrão adicionar 0,05 mL de água.); 
- Adicionar vagarosamente 0,2 mL de solução de ácido salicílico 5%; 
- Deixar 20 minutos em repouso, em temperatura ambiente; 
- Acrescentar lentamente 4,75 mL de NaOH 2 N e deixar esfriar; 
- Leitura: 410 nm. 
 
4) CÁLCULOS: 
 
Padrão:  g N-NO3
-
/ 0,1 mL 
Volume de extrato alcoólico: 25 mL 
 
..... g x 25/0,1 x 1/ peso amostra (resultado em  g NO3
+
/ g peso fresco) 
 
ou dividir por mil para o resultado em m g: 
 
..... g x 25/0,1 x 1/ peso amostra x 1/1000 (resultado em m g NO3
+
/ g peso fresco) 
 
10 
 
DETERMINAÇÃO DE AMÔNIO (Método colorimétrico-Mitchel, 1972; Felker, 1977). 
 
1) REAGENTES 
 
Solução A: 5 g de Fenol 
 25 m g de Nitroprussiato de Sódio. 
 
Dissolver e completar até 500 mL com água deionizada. 
 
Solução B: 15 g de NaOH 
 0,31 g de Dicloroisocianurato de Sódio. 
 
Dissolver e completar até 500 mL com água deionizada. 
 
2) PROCEDIMENTO 
 
. Pipetar 0,5 mL da solução problema (ou padrão) em tubo de ensaio; 
. Adicionar 2,5 mL da solução A e 2,5 mL da solução B; 
. Agitar e após 30 minutos ler a absorbância em 630 nm, contra padrão de NH4Cl. 
 
2.1) PROCEDIMENTO REDUZIDO 
 
. Pipetar 24 µL da solução problema (ou padrão) diretamente na placa de leitura; 
. Adicionar 113 µL da solução A e 113 µL da solução B; 
. Agitar levemente a placa e após 30 minutos ler a absorbância em 630 nm, contra padrão de NH4Cl. 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
3) PREPARO DO PADRÃO 
 
Solução estoque de NH4Cl 5 mM  Pesar 0,02674 g de NH4Cl e dissolver até 100 mL com água deionizada. 
 
Volume da solução estoque a 
ser pipetado (mL) 
 Concentração Final do Padrão 
(nmoles de NH4
+
/0,5 mL) 
0 
Completar com 
água deionizada até 
o volume final de 
25 mL 
0 
0,1 10 
0,25 25 
0,5 50 
1 100 
2 200 
3 300 
4 400 
 
4) CÁLCULOS 
 
a) DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE N-NH4
+
 
 
Padrão: nmoles NH4
+
 / 0,5 mL 
Volume do extrato alcoólico: 25 mL 
 
..... nmoles x 25/0,5 x 1 / peso amostra (resultado em nmoles de NH4
+
/ g peso fresco); 
 
ou dividir por mil para o resultado em moles NH4
+
/ g peso fresco: 
 
..... nmoles x 25/0,5 x 1/peso amostra x 1/1000 (resultado em moles NH4
+
/ g peso fresco). 
 
 
BIBLIOGRAFIA 
FERNANDES, M. S. N carriers, light and temperature influences on the free amino acid pool composition of rice plants. Turrialba. 33(3):297-301, 
1983. 
MOORE, S. e STEIN, W. H. A modified ninhydrin rea gent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J. Biol. Chem. 
211:907-913, 1954. 
TEDESCO, M. J. Análise de Solo, Planta e Outros Minerais.UFRGS. 1995. 174p. 
12 
 
YEMM, E.W. e COCKING, E.C. The determination of Aminoacid with ninhydrin. Analyst, 80:209-213. 1955. 
YEMM, E. W. e WILLIS, A. J. The estimation of carbohydrate in plants extracts by anthrone. Biochem. 57:508-514, 1954. 
13 
 
DETERMINAÇÃO DE N-AMINO LIVRE - Método da Ninidrina (Yemm e Cocking, 1955). 
 
1) PREPARO DOS REAGENTES. 
 
1.1) TAMPÃO CITRATO 0.2 M pH 5.0 
- Pesar 21.008 g de Ácido Cítrico 
- Adicionar a 200 mL de NaOH 1 N 
- Diluir para 500 mL com H
2
O destilada. 
 Preparo de 200 mL NaOH 1 N 
 n = m/meq massa NaOH = n x meq n = N x V 
 n = 1 x 200 = 200 massa NaOH = 200 x 0.040 = 8 g NaOH 
1.2) KCN 0.01 M 
- Pesar 0.1628 g de KCN 
- Diluir a 250 mL com água. 
 
1.3) ETANOL 60% 
 
1.4) METIL CELOSSOLVE + NINIDRINA (5% P/V). 
- Pesar 2.5 g de Ninidrina 
- Completar com 50 mL de Metil celossolve (etileno glicolmonometileter) (Válido por 6 meses). 
 
1.5) KCN + METIL CELOSSOLVE. 
- Pipetar 5 mL de KCN 0.01 M 
- Completar com 250 mL de Metil celossolve. (Válido por 1 mês). 
 
1.6) METIL CELOSSOLVE + KCN + NINIDRINA. 
- Adicionar 50 mL do reagente (1.4) a 250 mL do reagente (1.5). - Estocar por uma noite. (Válido por 1 semana). 
 
 
 
 
14 
 
 
2) PREPARO DO PADRÃO DE LEUCINA.2 mM Leucina PM = 131 
2 mM Leucina = 0.2620 g/litro 
 0.1310 g/500 mL 
 0.0524 g/200 mL 
 0.0262 g/100 mL ESTOQUE: 0.0262 g Leucina/100 mL HCl 0.1 N. 
 500 mL HCl 0.1 N. HCl: PM = 36.46 
 Densidade = 1.2; 
 12 M = 12 N 
 
Preparo dos pontos da curva PADRÃO LEUCINA: 
 
Volume do ESTOQUE a ser 
pipetado de LEUCINA 
 
 
Concentração final do padrão 
(mM de leucina) 
0 (somente tampão citrato) 
Completar o volume com Tampão 
Citrato até 25 mL 
0 
0,5 0,04 
1,0 0,08 
2,0 0,16 
2,5 0,20 
3,0 0,24 
4,0 0,32 
5,0 0,40 
 
3) PROCEDIMENTO 
 
- Colocar em tubo pirex 0.5 mL do tampão citrato; 
- Colocar 1 mL da amostra problema ou padrão; 
 (Observar se a amostra precisar de diluição, Ex: usar 0,5 mL da amostra completar com mais 0,5 mL de tampão citrato) 
- Adicionar 1.2 mL do reagente (1.6); 
- Fechar os tubos com papel alumínio e agitar; 
- Aquecer em banho-maria a 100° C /15 minutos; 
- Esfriar em água corrente por 5 minutos; 
- Acrescentar 3 mL de etanol 60%; 
- Agitar; 
- Leitura: 570 nm 
N x V = N x V 
12 x V = 0.1 x 500 
 V = 0.1 x 500 / 12 
 V = 4.16 mL HCl concentrado 
15 
 
3.1) PROCEDIMENTO REDUZIDO 
 
- Colocar em tubo pirex 125 µL do tampão citrato; 
- Colocar 250 µL da amostra; 
 (Observar se a amostra precisar de diluição, ex. se usar 100 µL da amostra e completar com mais 150 µL de tampão citrato); 
- Adicionar 300 µL do reagente (1.6); 
- Fechar os tubos com papel alumínio e agitar; 
- Aquecer em banho-maria a 100° C /15 minutos; 
- Esfriar em água corrente por 5 minutos; 
- Acrescentar 750 µL de etanol 60%; 
- Agitar; 
- Leitura: 570 nm. 
 
4) CÁLCULOS 
 
a) DETERMINAÇÃO DO N-AMINO LIVRE 
4.1 - ex: 0.40 mM extrato alcoólico de 25 mL. peso fresco = 1 g. 
0.40 mmoles ________________ 1000 mL 
 x ________________ 25 mL extrato(1 g). x = 0.40 x 25/1000 
 x = 0.01 mmoles/ g peso fresco ou 10 µmoles N-amino/ g p.f. 
Atenção: se o peso da amostra não for 1 g, fazer a conversão, por exemplo: peso da amostra = 0,5 g 
0.40 mmoles ________________1000 mL 
 x ________________ 25 mL extrato(0,5 g). x = 0.40 x 25/1000 
 x = 0.01 mmoles/0,5 g peso fresco ou 10 µmoles N-amino/0,5 g p.f. 
 se há 10 µmoles ____________0,5 g peso fresco 
 y ___________ 1 g 
 então y= 10 µmoles x 1 g/ 0,5 g 
 y= 20 µmoles/ g de peso fresco 
4.2 - ex: 0.40 mM extrato alcoólico de 25 mL. diluído 1:10 ( 250 mL). peso fresco = 1 g. 
 
 0.40 mmoles ____________ 1000 mL 
 x ____________ 250 mL x = 0.1 mmoles/ g peso fresco ou 100 µmoles N-amino/ g p.f. 
16 
 
DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS (Yemm e Willis, 1954). 
 
1) PREPARO DOS REAGENTES. 
 
a) H2SO4 5:2 em H2O 
- Diluir 500 mL de H2SO4 conc. em 200 mL H2O (5:2). Preparar em banho de gelo. 
 .colocar em primeiro lugar 200 mL de H2O. 
 .acrescentar lentamente 500 mL H2SO4. 
 
b) REAGENTE DE ANTRONA + H2SO4 5:2 
- Dissolver 0,4 g de ANTRONA em 200 mL da solução de H2SO4. 
- Deixar em repouso por aproximadamente 45 min. 
 
2) PREPARO DO PADRÃO 
 
a) Preparo da solução Estoque de glicose: 50 mg glicose/50 mL com etanol 80%. 
 
b) Preparo da curva padrão de glicose a partir do estoque: 
 
Volume do ESTOQUE 
a ser pipetado 
 
 
Concentração final do padrão 
(mM de leucina) 
0 (somente Etanol 80%) 
Completar o volume com 
Etanol 80% até 25 mL 
0 
0,5 20 
1,0 40 
1,25 50 
2,0 80 
2,5 100 
 
 
 
 
17 
 
3) PROCEDIMENTO. 
 
- Pipetar 5 mL do reagente ANTRONA + H2SO4 em tubos pirex de bom diâmetro (em banho de gelo); 
- Deixar em gelo a 0 oC por mais 5 minutos; 
- Adicionar lentamente 1 mL da solução problema* ou padrão; 
 * se as amostras foram diluídas Ex.: 0.1* mL de amostra + 0.9 mL de etanol 80%; 
- Deixar por mais 5 minutos a 0 oC; 
- Misturar, agitando suavemente e colocar em banho-maria a 100 oC por 10 minutos para desenvolvimento da cor (cor verde); 
Esfriar em água corrente; 
- Leitura: 620 nm. 
 
3.1) PROCEDIMENTO REDUZIDO 
 
- Pipetar 1,5 mL do reagente ANTRONA + H2SO4 em tubos pirex de bom diâmetro (em banho de gelo); 
- Deixar em gelo a 0 oC por mais 5 minutos; 
- Adicionar lentamente 0,3 mL da solução problema* ou padrão; 
 * se as amostras foram diluídas. Ex diluição de 10X: 0.03* mL de amostra + 0.270 mL de etanol 80%; 
- Deixar por mais 5 minutos a 0 oC; 
- Misturar, agitando suavemente e colocar em banho-maria a 100 oC por 10 minutos para desenvolvimento da cor (cor verde); 
Esfriar em água corrente; 
- Leitura: 620 nm. 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
4) CÁLCULOS 
 
a) DETERMINAÇÃO DO N-AMINO LIVRE 
 
4.1) Ex: 50 g Glicose/ mL extrato alcoólico: 25 mL / peso fresco: 1 g. 
 50 g glicose _______ 1 mL 
 x _______ 25 mL (1 g) 
 x = 50 x 25/1 
 x = 1250 g glicose/ g peso fresco 
 x = 1,25 mg glicose/ g peso fresco 
 x = 0,00125 g glicose/ g peso fresco. 1 g ________ 100% 
 0,00125 g ________ x .: x = 0,125% de glicose 
 
4.2) Ex: 50 g glicose/ mL extrato alcoólico: 25 mL diluído: 1:10 peso fresco: 1 g 
 50 µg glicose ________ 1 mL 
 x ________ 250 mL ( g) .: x = 50 x 250/1 .: x = 12500 g glicose/ g 
 
 .: x = 12,5 m g glicose/ g peso fresco .: x = 0.0125 g glicose/ g peso fresco 
 
Atenção: se o peso da amostra não for 1 g, fazer a conversão . 
19 
 
ANÁLISE DE PLANTAS EM MATERIAL SECO 
 
Etapas necessárias para análise de tecido vegetal: - Amostragem (limpeza e coleta de tecido representativo) 
 - Preparação da amostra (secagem e moagem) 
 - Análise laboratorial 
 - Interpretação dos resultados 
 
 
DETERMINAÇÃO DE MACRO E MICRONUTRIENTES 
 
 
1- OXIDAÇÃO DA MATÉRIA ORGÂNICA: - Via Úmida: digestão ácida 
 - Via Seca: transformação em cinzas 
 
 
1.1 - VIA ÚMIDA: DIGESTÃO ÁCIDA 
 
 
Digestão Nitro-perclórica para Macronutrientes: (P, K, Ca, Mg, S) (Bataglia et al., 1983) 
 
1) MATERIAL 
 
- Capela com exaustão 
- Bloco digestor 
- Tubos longos para digestão 
- Papel de filtro 
- Balões volumétricos de 50 mL 
 
2) REAGENTE 
 
- Preparar solução de HNO3 e HClO4, na proporção 2:1 (V/V) 
 
20 
 
3) PROCEDIMENTO 
- Transferir 200 m g de amostra seca e moída para tubo de digestão; 
- Levar as amostras para a capela com exaustor; 
- Adicionar 3 mL da solução de HNO3 e HClO4, na proporção 2:1 (V/V); 
- Colocar as amostras no bloco digestor; 
- Aumentar gradativamente a temperatura até 160
o 
C; 
- Deixar nesta temperatura por cerca de 40 minutos (volumeé reduzido à metade); 
- Aumentar a temperatura para 210
o 
C e deixar nesta temperatura até se obterem fumos brancos de HClO4 e o 
extrato apresentar-se incolor (mais ou menos 20 minutos); 
- Após esfriar parcialmente (sensível ao toque), dissolver com água deionizada e filtrar 
- Transferir o extrato para balão volumétrico de 50 mL 
- Completar o volume até 50 mL com água deionizada 
* Preparar branco apenas com os ácidos e sem amostra. 
 
 
21 
 
Digestão Sulfúrica para Macronutrientes. (N, P, K, Ca, Mg) (Tedesco, 1995) 
 
1) MATERIAL 
 
- Capela com exaustão; 
- Bloco digestor; 
- Tubos longos para digestão; 
- Balões volumétricos de 50 mL. 
 
2) REAGENTES 
 
- H2O2 30%; 
- H2SO4 concentrado; 
- Na2SO4; 
- CuSO4.5 H2O; 
- Selênio metálico. 
 
3) PREPARO DA MISTURA CATALISADORA 
 
- Triturar em almofariz: 100 g de Na2SO4, 10 g de CuSO4.5 H2O e 1 g de Selênio; 
 
4) PROCEDIMENTO 
 
- Transferir 200 mg de amostra seca e moída para tubo de digestão; 
- Levar as amostras para a capela com exaustor; 
- Adicionar: 1,0 mL de H2O2 30%; 
 1,5 mL de H2SO4 concentrado (adicionar vagarosamente); 
 0.7 g de mistura catalisadora (100 g Na2SO4, 10 g CuSO4.5 H2O, 1 g Selênio). 
 
- Colocar as amostras no bloco digestor 
22 
 
- Aumentar gradativamente a temperatura de acordo com os tempos a seguir: 
 
 Temperaturas e tempos para a digestão do material: 
 
100oC ____ 30 min. 
125oC ____ 15 min. 
150oC ____ 15 min. 
175oC ____ 60 min. 
200oC ____ 20 min. 
225oC ____ 15 min. 
250oC ____ 35 min. 
300oC ____ 35 min. 
330oC ____ 10 a 15 min. 
 até ficar verde mar transparente. A partir daí deixar por uma hora. 
 
- Após esfriar parcialmente (sensível ao toque), dissolver com água deionizada; 
- Transferir o extrato para balão volumétrico de 50 mL; 
- Completar o volume até 50 mL com água deionizada; 
- Filtrar e guardar o extrato em vidro âmbar. 
* Preparar branco apenas com reagentes e sem amostra. 
23 
 
DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO (Destilação por arraste de vapor e titulação) 
 
DESTILAÇÃO POR ARRASTE DE VAPOR: 
 
1) MATERIAL 
 
- Destilador por arraste de vapor 
- Erlenmeyers de 50 mL 
 
2) REAGENTES 
 
INDICADOR COM ÁCIDO BÓRICO (1000 mL) 
 
- 900 mL de água destilada fervida p/ eliminar CO2. 
- 20 g ácido bórico. 
- 0.025 g de verde de bromo cresol em 25 mL de etanol. 
- 0.025 g de vermelho de metila em 25 mL de etanol. 
 dissolver o ácido bórico na água fervida; 
 transferir 25 mL de verde de bromo cresol e 5 mL de vermelho de metila para balão; 
 acrescentar o ácido bórico dissolvido e completar o volume para 1000 mL. 
 
NaOH 50% (1000 mL) 
 
- Pesar 500 g de NaOH 
- Diluir cuidadosamente em cerca de 600 mL de água destilada (cuidado reação fortemente exotérmica) 
- Deixar esfriar 
- Transferir para balão volumétrico e completar o volume para 1000 mL 
 
 
 
 
24 
 
3) PROCEDIMENTO 
 
- Pipetar para o balão do destilador 20 mL do extrato proveniente da digestão. 
- Acrescentar pelo copo apropriado do destilador 10 mL de NaOH 50%. 
- Adicionar 5 mL de mistura indicadora c/ ácido bórico em erlenmeyer de 50 mL 
- Recolher cerca de 35 mL do destilado 
 
4) TITULAÇÃO 
 
a) MATERIAL 
 
- Bureta semi automática (ou bureta graduada); 
- Agitador magnético; 
- Balas magnéticas; 
 
b) REAGENTES 
 
1) Preparo de 2 litros H2SO4 0.05 N padronizado 
 
Eq g H2SO4 = mol/2 = 98/2 Eq g = 49.05 
 n = N.V 
 n = 0.05 x 2000 = 100 m = n.meq 
 m = 100 x 0.04905 
 m = 4.905 g 
 D = m/v :. vol. = m/D 
 vol. = 4.905/1.83 :. vol. = 2.68 mL H2SO4. 
100 mL sol. H2SO4 _______ 96 mL H2SO4 
 x _______ 2.68 mL " x = 2.79 mL de H2SO4 concentrado. (para 2 litros) 
 
Colocar em balão volumétrico de 2000 mL cerca de 100 mL de água destilada 
Acrescentar 2,79 mL de H2SO4 concentrado 
Completar o volume até 2000 mL com água destilada 
25 
 
2) Preparo de 500 mL Tris 0.05 N. 
 
Tris = C4H11NO3 PM = 121.14 g Eq g = mol/1:. Eq g = 121.14 g n = N.V 
 n = 0.05 x 500 :. n = 25 
m = n x meq:. m = 25 x 0.12114 massa = 3.0285 g Tris. 
- Dissolver em Becker 3,0285 g de Tris com água destilada 
- Transferir para balão volumétrico de 500 mL 
- Completar o volume até 500 mL com água destilada 
 
b) PROCEDIMENTO 
 
-Titular as amostras recolhidas na mistura indicadora c/ ácido bórico com H2SO4 0.05 N padronizado 
(A solução de H2SO4 0.05 N deverá ser padronizada com Tris 0.05 N). 
 
1) CÁLCULO DO N-TOTAL 
 (Volume ácido - Volume branco) x N ácido. = meq N/peso m g. 
 V x N = n 
 n = m/meq :. m = n x meq. 
Eq g N = mol/1 = 14 g/eq = 14 m g/meq 
 meq N ________ peso m g amostra 
 x ________ 1000 m g " 
 x = meq N x 1000/peso amostra. 
massa de N = meq N/1 g x 14 m g N/meq 
massa de N = m g N/1 g peso seco. 
 
(Vác. - Vbran.) x Nác. = * meq N/peso amostra 
(Vác.- Vbran.) x Nác. x 1000/peso amostra = * meq N/1 g peso seco 
 
Para N-total (m g N/ g peso seco) 
(Vác.- Vbran.) x Nác. x 1/0,...x 14 = N-TOTAL em m gN/ g peso seco 
 
Para Proteína Bruta do Grão (%) 
(Vác.- Vbran.) x Nác. x 1/0,... x 14 x 0.595** = % de proteína bruta 
 
 **Obs.: Para grãos de arroz: 100 g Glutelina ___________ 16.8 g de N 
 100/16.8 = 5.95 (fator para converter N-total em proteína bruta). 
26 
 
DETERMINAÇÃO DE N-TOTAL. (Tedesco, 1995). 
 
1) DIGESTÃO: 
 
Obs.: a digestão deverá ser feita em capela com exaustor. 
 
Colocar em tubos longos de digestão (pirex): 
 - 200 mg de material moído, seco e passado por peneira. 
 - 1,0 mL de H2O2 30%. 
 - 1,5 mL de H2SO4 concentrado. 
 - 0,7 g catalisador (100 g Na2SO4, 10 g CuSO4.5 H2O, 1 g Selênio). 
 
Temperaturas e tempos para a digestão do material: 
100oC ____ 30 min. 
125oC ____ 15 min. 
150oC ____ 15 min. 
175oC ____ 60 min. 
200oC ____ 20 min. 
225oC ____ 15 min. 
250oC ____ 35 min. 
300oC ____ 35 min. 
330oC ____ 10 a 15 min. até ficar verde mar transparente. A partir daí deixar por uma hora. 
 
2) DESTILAÇÃO: (por arraste de vapor) 
 
- 10 mL de NaOH 50%. 
- 5 mL de indicador c/ ácido bórico. 
- Amostra proveniente da digestão. 
- Recolher 35 mL do destilado e titular com H2SO4 0.05 N padronizado com Tris. 
 
 
 
 
27 
 
3) REAGENTES: 
 
a) INDICADOR COM ÁCIDO BÓRICO. 
 
- 900 mL de água destilada fervida p/ eliminar CO2. 
- 20 g ácido bórico. 
- 0.025 g deverde de bromo cresol em 25 mL de etanol. 
- 0.025 g de vermelho de metila em 25 mL de etanol. 
 .dissolver o ácido bórico na água fervida. 
 .transferir 25 mL de verde de bromo cresol e 5 mL de vermelho de metila para balão, 
 .acrescentar o ácido bórico dissolvido e completar o volume para 1000 mL. 
 
b) PREPARO DE 2 litros H2SO4 0.05 N. 
 
Eq g H2SO4 = mol/2 = 98/2 
Eq g = 49.05 n = N.V 
 n = 0.05 x 2000 = 100 m = n.meq 
 m = 100 x 0.04905 
 m = 4.905 g 
 D = m/v :. vol. = m/D 
 vol. = 4.905/1.83 :. vol. = 2.68 mL H2SO4. 
100 mL sol. H2SO4 _______ 96 mL H2SO4 
 x _______ 2.68 mL " x = 2.79 mL de H2SO4 concentrado. (para 2 litros) 
 
c) PREPARO DO TRIS. 500 mL Tris 0.05 N. 
 
Tris = C4H11NO3 PM = 121.14 g 
Eq g = mol/1:. Eq g = 121.14 g n = N.V 
 n = 0.05 x 500 
 n = 25 
m = n x meq :. m = 25 x 0.12114 
massa = 3.0285 g Tris. 
 
 
 
28 
 
4) CÁLCULO 
 
a) Determinação do N-TOTAL. 
 
 (Volume ácido - Volume branco) x N ácido. = meq N/peso m g. 
 V x N = n 
 n = m/meq :. m = n x meq. 
Eq g N = mol/1 = 14 g/eq = 14 m g/meq 
 meq N ________ peso m g amostra 
 x ________ 1000 m g " 
 x = meq N x 1000/peso amostra. 
massa de N = meq N/1 g x 14 m g N/meq 
massa de N = m g N/1 g peso seco. 
 
(Vác. - Vbran.)x Nác. = * meq N/peso amostra 
(Vác.- Vbran.) x Nác. x 1000/peso amostra = * meq N/1 g peso seco 
 
 
Para N-total (m g N/ g peso seco) 
(Vác.- Vbran.) x Nác. x 1/0,...x 14 = N-TOTAL em m gN/ g peso seco 
 
 
 
Para Proteína Bruta do Grão (%) 
(Vác.- Vbran.) x Nác. x 1/0,... x 14 x 0.595** = % de proteína bruta 
 
 **Obs.: Para grãos de arroz: 100 g Glutelina ___________ 16.8 g de N 
 100/16.8 = 5.95 (fator para converter N-total em proteína bruta) 
 
 
/
29 
 
DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO 
 
1) EXTRAÇÃO: 
 
Digestão sulfúrica ou Nitro-perclórica 
 
2) PREPARO DOS REAGENTES 
 
a) SOLUÇÃO DO MOLIBDATO DE AMÔNIO 5% 
 
- Pesar 50 g de (NH4)6Mo7O24 
- Diluir para 1000 mL com água destilada. 
 
b) SOLUÇÃO DE VANADATO DE AMÔNIO 0,25% EM ÁCIDO NÍTRICO 
 
- Dissolver 2,5 g de NH4VO3 em 500 mL de água fervente. 
- Esfriar. 
- Adicionar 350 mL de HNO3 concentrado, 
- Completar com água destilada para 1000 mL. 
- Manter em frasco âmbar. 
 
c) SOLUÇÃO MOLIBDATO-VANADATO 
 
- Misturar em parte iguais a solução de molibdato de amônio (a) e a solução de vanadato de amônio (b). 
 
 
3) PREPARO DO PADRÃO 
 
a) Solução (80 ppm): dissolver 0,3509 g de KH2PO4 em 300 mL de água destilada. 
 Adicionar 10 mL de solução de H2SO4 10 N. 
 Esfriar e diluir a 1000 mL. 
 
b) Solução Estoque com 16 ppm de P: diluir 50 mL da solução com 80 ppm de P 
 Completar o volume até 250 mL com água destilada. 
 
 
30 
 
c) Preparar soluções padrão, a partir do estoque 16 ppm de P: 
 
Concentração do 
Padrão 
(ppm de Fósforo) 
Volume de Estoque 
pipetado 
(mL) 
 
0 0,0 
Completar até 
volume final de 50 
mL com água 
destilada 
1,6 5 
3,2 10 
4,8 15 
6,4 20 
8,0 25 
12,8 40 
16,0 50 
 
 
4) PROCEDIMENTO: 
 
-Transferir 5 mL do extrato para tubo de ensaio; 
-Adicionar 2 mL da solução de vanadato-molibdato; 
-Agitar; 
-Leitura: 420 nm após 15 minutos, cor estável até 24 horas. 
31 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
BATAGLIA, O.C.; FURLANI, A.M.C.; TEIXEIRA, J.P.F.; FURLANI, P.R.; GALLO, J.R. Métodos de Análise Química de 
Plantas. B. Técn. Inst. Agron. Campinas, SP - n. 78 - 1983. 
 
FERNANDES, M. S. N carriers, light and temperature influences on the free amino acid pool composition of rice 
plants. Turrialba. 33(3):297-301, 1983. 
 
JONES, JR., J.B. Kjeldahl Nitro gem Determination- “What’s in a name?” Journal of Plant Nutrition. 10:1675-1682. 1987 
 
JONES JR., J.B. Kjeldahl Method for Nitro gem Determination. Micro-Macro Publishing, Inc. 1991. 
 
JONES JR., J.B.; WOLF, B.; MILLS, H.A. Plant Analysis Handbook. Micro-Macro Publishing, Inc. 1991. 
 
MOORE, S. e STEIN, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related 
compounds. J. Biol. Chem. 211:907-913, 1954. 
 
NOVOZAMSKY, I.; HOUBA, V.J. G.; van der LEE, J.J.; van ECK, R. A convenient wet di gestion procedure for multi-element 
analysis of plant materials. Commun. in Soil Sci. Plant Anal. 24(19&20):2595-2605. 1993. 
 
TEDESCO, M. J. Análise de Solo, Planta e Outros Minerais.UFRGS. 1995. 174p 
 
YEMM, E.W. e COCKIN G, E.C. The determination of Aminoacid with ninhydrin. Analyst, 80:209-213. 1955. 
 
YEMM, E. W. e WILLIS, A. J. The estimation of carbohydrate in plants extracts by anthrone. Biochem. 57:508-514, 1954. 
WATSON, M.E. Interlaboratory comparison in the determination of nutrient concentrations of plant tissue. Commun. in Soil 
Sci. Plant Anal. 12(6):601-617. 1981. 
 
 
32 
 
PADRÃO MISTO DE FÓSFORO, POTÁSSIO, CÁLCIO E MAGNÉSIO 
 
 
4.1 - Preparo de solução estoque com: 
 
220 ppm de FÓSFORO 
2.200 ppm de POTÁSSIO 
1.100 ppm de CÁLCIO 
165 ppm de MA GNÉSIO. 
 
- Pesar 2,746 g de CaCO3 (seco a 105C por 2 horas) transferir para balão volumétrico de 1 litro. 
- Adicionar 20 mL de HCl a 50%. 
- Adicionar 0,9666 g de KH2PO4 
- Adicionar 3,6645 g de KCl (secos a 100C por 2 horas). 
- Adicionar 200 mL da solução de Magnésio 825 ppm, que deve ser preparada da seguinte forma: 
 Pesar 0,8250 g de Mg metálico e dissolver em 10 mL de HCl a 50%. 
 Completar o volume até 1 litro com água destilada. 
 
33 
 
DETERMINAÇÃO DE POTÁSSIO (Fotometria de Chama) 
 
 
1) EXTRAÇÃO: Digestão com H2SO4 e H2O2 ou Nitro-Perclórica 
 
2) PREPARO DO PADRÃO DE POTÁSSIO 
 
Solução padrão de potássio, estoque (1000 ppm de K): 
 - Dissolver 1,907 g de KCl (seco em estufa a 105 
o
C por duas horas), em água, 
 - Completar o volume para um litro; 
 
 - Pipetar para balões de 100 mL : 0,0 - 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 e 5,0 mL da solução estoque, 
 segundo o quadro abaixo: 
 
Concentração do 
Padrão 
(ppm de Potássio) 
Volume de Estoque 
pipetado 
(mL) 
 
0 0,0 
Completar até 
volume final de 
100 mL com água 
destilada 
10 1,0 
20 2,0 
30 3,0 
40 4,0 
50 5,0 
 
3) PROCEDIMENTO 
- Seguindo as instruções de uso do espectrofotômetro de chama, preparar uma curva padrão. 
- Retirar uma alíquota de 5 mL e transferir para um frasco de boca larga. 
- Adicionar 50 mL de água destilada. 
- Determinar a emissão de luz no fotômetro de chama 
OBSERVAÇÕES: 
 
- Nos fotômetros que dispõem de controle de sensibilidade, ajusta-se o máximoda escala com padrão adequado 
conforme as amostras. Se houver amostras com baixo teor, estas podem ser determinadas utilizando como ajuste 
34 
 
máximo um padrão intermediário. As amostras com teor alto podem ser analisadas utilizando como ajuste máximo 
o padrão maior. Evita-se assim a necessidade de diluir as amostras. 
 
- A sensibilidade do método (leitura=1), para o caso de ajustar o ponto 100 da escala com o padrão de 10 ppm de 
potássio na solução final corresponde a 0,03% de K no tecido. O teor máximo que pode ser determinado com a 
diluição recomendada é de 5,5% de K no tecido. 
35 
 
DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO 
 
1) EXTRAÇÃO: 
 
Digestão com H2SO4 e H2O2 (idêntica àquela usada para N-total) 
 
2) PREPARO DOS REAGENTES 
 
a) SOLUÇÃO DO MOLIBDATO DE AMÔNIO 5% 
 
- Pesar 50 g de (NH4)6Mo7O24 e diluir para 1 litro de água destilada. 
 
b) SOLUÇÃO DE VANADATO DE AMÔNIO 0,25% EM ÁCIDO NÍTRICO 
 
- Dissolver 2,5 g de NH4VO3 em 500 mL de água fervente; 
- Esfriar; 
- Adicionar 350 mL de HNO3 concentrado, completar com água destilada para 1 litro; 
- Manter em frasco âmbar. 
 
c) SOLUÇÃO MOLIBDATO-VANADATO 
 
- Misturar em parte iguais a solução de molibdato de amônio (a) e a solução de vanadato de amônio (b). 
 
3) PADRÃO DE FÓSFORO 
 
a) ESTOQUE (80 ppm): 
 
- Dissolver 0,3509 g de KH2PO4 em 300 mL de água destilada; 
- Adicionar 10 mL de solução de H2SO4 10 N. Esfriar e diluir a 1000 mL; 
- Preparar soluções contendo 2, 4, 8, 12 e 16 ppm de P. 
 
 
36 
 
b) PADRÃO MISTO DE FÓSFORO, POTÁSSIO, CÁLCIO E MAGNÉSIO 
Esta solução contem 220 ppm de FÓSFORO 
 2.200 ppm de POTÁSSIO 
 1.100 ppm de CÁLCIO 
 165 ppm de MAGNÉSIO. 
- Pesar 2,746 g de CaCO3 (seco a 105 C por 2 horas) transferir para balão volumétrico de 1 litro. 
- Adicionar 20 mL de HCl a 50% . 
- Adicionar 0,9666 g de KH2PO4 e 3,6645 g de KCl (secos a 100 C por 2 horas). 
- Adicionar 200 mL da solução de 825 ppm de Mg que deve ser preparada da seguinte forma: 
 Pesar 0,8250 g de Mg metálico dissolver em 10 mL de HCl a 50%. 
 Completar o volume a 1 litro de água destilada. 
 
4) PROCEDIMENTO: 
 
a) Transferir 5 mL do extrato para tubo de ensaio 
b) Adicionar 2 mL da solução de vanadato-molibdato. 
c) Agitar e determinar a absorbância em 420 nm após 15 minutos, cor estável até 24 horas. 
d) Leitura: 420 nm 
37 
 
DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO E MAGNÉSIO (Espectrofotometria de Absorção Atômica) 
 
 
1) EXTRAÇÃO: Digestão com H2SO4 e H2O2 (idêntica à usada para N-total). 
 
 
2) PREPARO DOS REAGENTES 
 
a) Solução de lantânio a 2%: 
Pesar 2,34 g de La2O3 e dissolver em 100 mL de HCl 1 N. 
 
Obs.: Para a determinação de Ca e M g é necessária a adição de lantânio ou estrôncio para prevenir interferências 
ocasionadas pela presença de fosfatos e de alumínio. O lantânio ou o estrôncio evitam a formação de compostos 
termicamente estáveis (refratários) entre magnésio ou cálcio com fosfatos e alumínio 
 
3) PROCEDIMENTO 
 
1) Determinação de Ca 
a) Retirar uma alíquota de 5 mL do extrato (ou solução padrão) e transferir para um frasco de boca larga; 
b) Adicionar 10 mL de água destilada; 
c) Adicionar 1,5 mL de La a 2%; 
d) Agitar e fazer a leitura no espectrofotômetro de absorção atômica, determinando o teor de Ca. 
 
 
2) Determinação de Mg 
a) Retirar uma alíquota de 5 mL do extrato onde se determinou Ca (do frasco diluído para Ca, após a leitura); 
b) Adicionar 10 mL de água destilada; 
c) Agitar e fazer a leitura no espectrofotômetro de absorção atômica, determinando o teor de Mg; 
 (não é necessário adicionar mais La - a determinação de Mg é menos afetada que a do Ca). 
38 
 
4) PADRÃO MISTO PARA CÁLCIO E MAGNÉSIO 
 
1) Solução Estoque de Cálcio (500 ppm de Ca) 
- Em becker de 250 mL acrescentar aproximadamente 100 mL de água deionizada; 
- Adicionar 30 mL de HNO3 1,0 M; 
- 1,250 g de CaCO3 (seco em estufa por duas horas a 100 
o
C); 
- Agitar cuidadosamente até dissolver; 
- Transferir o conteúdo do becker para balão volumétrico de 1000 mL; 
- Completar o volume com água deionizada. 
 
2) Solução Estoque de Magnésio (100 ppm de Mg) 
a) Dissolver 1,014 g de MgSO4.7H2O em água deionizada 
b) Completar o volume até 1000 mL com água deionizada 
 
Obs.: Devido ao elevado número de moléculas de água de hidratação desse sal é conveniente substituir o mesmo por 
Magnésio Metálico: 
 - 100 mg de Magnésio Metálico 
 - 2 mL de HCl a 50% 
 - Completar o volume até 1000 mL com água deionizada 
 
3) Solução Padrão Mista Estoque de Ca e Mg 
 
a) 10 mL de Solução Estoque de Ca a 500 ppm 
b) 10 mL de Solução Estoque de Mg a 100 ppm 
c) Completar o volume até 100 mL com água deionizada (50 ppm Ca e 10 ppm de Mg) 
 
4) Preparo da Solução Padrão de Trabalho com Ca e Mg 
 Em nove balões volumétricos de 50 mL adicionar as quantidades de solução padrão mista, 
 conforme a tabela a seguir, e completar o volume com água destilada: 
 
39 
 
Volume de Solução 
Padrão Mista a ser 
pipetado 
(mL) 
Concentração Final do 
Padrão de Trabalho 
Cálcio 
(ppm) 
Concentração Final do 
Padrão de Trabalho 
Magnésio 
(ppm) 
0 0 0,0 
1 1 0,2 
2 2 0,4 
3 3 0,6 
4 4 0,8 
5 5 1,0 
6 6 1,2 
7 7 1,4 
8 8 1,6 
 
40 
 
DETERMINAÇÃO DE ENXOFRE 
 
1) PRINCIPIO DO MÉTODO 
 
 O enxofre orgânico é oxidado a sulfato por aquecimento do material vegetal em presença de ácidos nítrico e 
perclórico. O sulfato é precipitado com uma quantidade padrão de cloreto de bário. A concentração de S é 
determinada indiretamente através da medida do excesso de bário por espectrofotometria de absorção atômica. 
 
2) APARELHAGEM 
 
 Espectrofotômetro de absorção atômica, com lâmpada de cátodo oco de Ba, queimador de fenda tripla e chama 
de ar-acetileno. 
 
3) REAGENTES 
 
a) Preparo da solução padrão de bário a 2500 ppm 
 
Diluir 4,4483 g de BaCl2.2H2O em água destilada, acrescentar 100 mili equivalentes de HCl e completar o volume 
para um litro. 
 
b) Solução de estrôncio 1,5% 
 
Dissolver 45,6 g de SrCl2.6H2O em água destilada, completar o volume a um litro 
 
c) Soluções padrão de trabalho de S 
 
Preparar por diluições da solução padrão estoque, soluções contendo: 
50, 100, 150, 200 e 250 ppm de S 
 
41 
 
DETERMINAÇÃO DE COBRE (Espectrofotometria de Absorção Atômica) 
 
1) REAGENTES 
 
- Solução Padrão Estoque de Cobre (100 ppm de Cu) 
 
a) Solução de HNO3 0,2 M (5 litros) 
- em balão de 5 litros com um pouco de água deionizada, acrescentar 45 mL de HNO3 concentrado 
- completar o volume até 5 litros com água deionizada 
 
b) Solução Padrão Estoque de Cobre (100 ppm de Cu) 
- dissolver 0,393 g de CuSO4.5H2O em solução de HNO3 0,2 M 
- completar o volume até 1000 mL com solução de HNO3 0,2 M 
 
- Solução Padrão de Uso de Cobre (**ver padrão múltiplo de Cu, Mn e Zn) 
 
a) Em balões volumétricos de 100 mL pipetar alíquotas de: 
 0 - 0,4 - 0,6 - 0,8 - 1,0 - 1,5 - 2,0 mL da solução estoque de Cu 
 
b) Adicionar 10,0 mL de HCl04 2,5 M 
(Obs.: Para preparar 100 mL de HCl04 2,5 M: 
medir 14,95 mL de HCl04 concentrado e completar até 100 mL com água deionizada) 
 
c) Somente após acrescentar as soluções de Manganês e Zinco** completar o volume dos balões até 100 mL com 
água deionizada 
 (**ver padrão múltiplo de Cu, Mn e Zn) 
 
 
2) PROCEDIMENTO 
 
a) Proceder às leituras das soluções padrão de uso ou das amostras do extrato nitro-perclórico diretamente por 
absorção atômica com a lâmpada de catodo oco apropriada 
 
b) Proceder à construção da curva padrão 
 
42 
 
DETERMINAÇÃO DE MANGANÊS (Espectrofotometria de Absorção Atômica) 
 
1) REAGENTES 
 
- Solução Padrão Estoque de Manganês (100 ppm de Mn) 
 
a) Dissolver 0,308 g de MnSO4.H2O em solução de HNO3 0,2 M 
b) Completar o volume até 1 litro com a solução de HNO3 0,2M 
 
- Soluções Padrão de Uso de Manganês 
 
 a) Nos mesmos balões volumétricos de 100 mL que já contém as soluções padrão de Cobre, transferir alíquotas de 0 
- 0,5 - 1,0 - 2,0 - 5,0 - 10,0 e 15,0 mL da solução estoque (100 ppm de Mn). 
 
b) seguir o procedimento dado para o preparo do padrão de uso de cobre 
 
 
 
2) PROCEDIMENTO 
 
a) Proceder às leituras das soluções padrão de uso ou das amostras do extrato nitro-perclórico diretamente por 
absorção atômica com a lâmpada de catodo oco apropriada; 
 
b) Proceder à construção da curva padrão. 
 
43 
 
DETERMINAÇÃO DE ZINCO (Espectrofotometria de Absorção Atômica) 
 
 
1) REAGENTES 
 
- Solução Padrão Estoque de Zinco (100 ppm de Zn) 
 
a) Dissolver 0,440 g de ZnSO4.7H2O em solução de HNO3 0,2 M 
 
b) Completar o volume até 1 litro com a solução de HNO3 0,2 M 
 
 
- Soluções Padrão de Uso de Zinco 
 
a) Nos mesmos balões volumétricos de 100 mL que já contêm as soluções padrão de Cobre e Manganês, transferir 
alíquotas de 0 - 0,5 - 1,0 - 2,0 - 5,0 - 10,0 e 15,0 mL da solução estoque (100 ppm de Zn); 
 
b) Seguir o procedimento dado para o preparo do padrão de uso de cobre. 
 
 
 
2) PROCEDIMENTO 
 
 
a) Proceder às leituras das soluções padrão de uso ou das amostras do extrato nitro-perclórico diretamente por 
absorção atômica com lâmpada apropriada; 
 
b) Proceder à construção da curva padrão. 
 
 
44 
 
SOLUÇÕES PADRÃO MÚLTIPLAS DE COBRE, MANGANÊS E ZINCO 
 
1) PROCEDIMENTO 
 
a) Pipetar para balões de 100 mL, os volumes de Soluções Estoques 100 ppm de Cu, Mn e Zn, conforme indicado 
no quadro a seguir: 
 
 
 
 
Balão 100 
mL 
Volume de Solução Estoque de 100 ppm a ser pipetado (mL) 
 
 Cu Mn Zn 
 Concentrações das Soluções Padrão de Uso (ppm) 
 
 Cu Mn Zn 
A 0 0 0 0 0 0 
B 0,4 0,5 0,5 0,4 0,5 0,5 
C 0,6 1.0 1,0 0,6 1,0 1,0 
D 0,8 2,0 1,5 0,8 2,0 1,5 
E 1,0 5,0 2,0 1,0 5,0 2,0 
F 1,5 10,0 2,5 1,5 10,0 2,5 
 G 2,0 15,0 3,0 2,0 15,0 3,0 
 
 
 
 
b) Adicionar 10,0 mL de HCl04 2,5 M. 
(Obs.: Para preparar 100 mL de HCl04 2,5 M: 
medir 14,95 mL de HCl04 concentrado e completar até 100 mL com água deionizada); 
 
c) Completar o volume dos balões até 100 mL com água deionizada. 
 
 
45 
 
2 - CÁLCULOS (Cobre, Manganês, Zinco) 
 
 
Exemplo: 
 
Amostra com 0,5 ppm de Zn (concentração determinada através da curva padrão); 
 
 
0,5 ppm Zn = 0,5 g/ mL de extrato 
 
 
1 mL de extrato _______0,5 g de Zn 
 
50 mL de extrato ______ x : x = 25 g de Zn 
 
 
 
25 g de Zn ______ 0,2 g matéria seca (50 mL de extrato) 
(0,000025 g) 
 y ______ 1000 g (1 kg) .: y = 0,125 g/kg ou 125 mg/kg 
 
 
 
 
 
Obs.: Repetir o mesmo cálculo para Cobre e Manganês 
 
46 
 
DETERMINAÇÃO DE NITRATO POR arraste de vapor com Liga de Devarda 
 
1) REAGENTES: 
 
- Liga de Devarda; 
- Indicador misto com ácido bórico; 
- H2SO4 0.002 N (padronizado). 
 
2) PROCEDIMENTO: 
 
- No material em que se determinou amônio (item 3), adicionar cerca de 200 mg de Liga de Devarda para redução 
de NO3 a NH4; 
- Fazer nova destilação; 
- Recolher cerca de 35 mL do destilado em 5 mL do indicador com ácido bórico; 
- Titular com H2SO4 0.002 N padronizado. 
 
DETERMINAÇÃO DE AMÔNIO. (Método de arraste de vapor sob MgO). 
 
1) REAGENTES: 
 
- MgO (calcinado a 500oC/1 hora). 
- Indicador misto (verde de bromocresol e vermelho de metila) + ácido bórico. 
- H2SO4 0.002 N (padronizado). 
 
2) PROCEDIMENTO: 
 
- Colocar em balão de Kjeldahl: 5 mL do extrato, 15 mL de água deionizada e 200 m g de óxido de magnésio e 
levar para destilação (o peso de M gO não precisa ser exato). 
- Recolher 35 mL do destilado em erlenmeyer com 5 mL do indicador com ácido bórico. 
- Titular com H2SO4 0.002 N. 
47 
 
 
ATIVIDADE DA GLUTAMINA SINTETASE (GS). 
 
1) COLETA DE MATERIAL. 
 
- Terço médio da quarta folha (em milho) a partir do topo ou terço médio de outra folha dependendo da espécie; 
- Colocar o material em vidro com tampa; 
- Colocar os vidros em isopor com gelo; 
OBS: O tamanho do material vegetal deve ser igual ao vidro, para evitar manuseio ou injúria. 
 
2) EXTRAÇÃO. 
 
- Eliminar a nervura central. 
- Pesar 1 grama de material. 
- Cortar um pouco com a tesoura diretamente no almofariz. 
- Acrescentar um volume de N líquido dependendo do material: jovem (-), adulto: (+). 
- Macerar com pistilo (1 min.). 
- Colocar o material no triturador (politron), acrescentar 8 mL de tampão de extração (Tris ou Imidazol), triturar por 
45 segundos. 
- Passar por gaze. 
- Recolher o material em vidro dentro de gelo. 
- Colocar em tubo de centrífuga (em gelo). 
- Centrifugar por 15 min. a 0oC a 15,000 g (11,5 rpm). 
- Recolher o sobrenadante (em tubo em gelo), se não for usar em seguida deixar os tubos em gelo na geladeira. 
 
 
 
 
 
 
 
48 
 
 
3) PREPARO DOS REAGENTES: 
 
a) TAMPÃO DE EXTRAÇÃO. 
 
1) REAGENTES: 
 
a) 100 mL tampão TRIS-HCl 0.1 M pH 7.8: 
 
 6.7 mL TRIS-HCl 1 M + 3.3 mL TRIS 1 M / 100 mL H2O 
 
b) 100 mL MgSO
4
 0.1 M: 
 
 2.4648 g MgSO
4
 / 100 mL H2O 
 
2) PROCEDIMENTO: 
 
 4.0 mL tampão TRIS-HCl 0.1 M pH 7.8 
 1.6 mL MgSO
4
 0.1 M 
 2.4 mL H2O 
 40.0 µl Mercaptoetanol 14.2 M (solução comercial). 
(total 8 mL por amostra) 
 
OBS.: Para preparar 400 mL do tampão de extração: 
 2.0 x 100 = 200 mL tampão 0.1 M 
 0.8 x 100 = 80 mL MgSO4 0.1 M 
 1.2 x 100 = 120 mL H2O 
 400: 50 = 8 mL por amostra. 
(Acrescentar o Mercaptoetanol em cada amostra) 
 
 
49 
 
 
3) MEIO DE INCUBAÇÃO (REAÇÃO). 
 
- Colocar em tubos de 10 mL aproximadamente: 
- 0,2 mL de tampão 0.5 M, Imidazol ou Tris pH 7.5 
- 0,1 mL de sol. Mercaptoetanol 0.1 M ou Dithiothreitol 0.1 M. 
- 0,1 mL de sol. de MgSO
4 
0.4 M. 
- 0,1 mL Hidroxilamina 0.1 M pH 6.5* 
- 0,1 mL de ATP 0.1 M* 
- 0,1 mL de glutamato 0.5 M pH 7.5* 
- 0,3 mL de amostra. 
- 1,0 mL de água. 
* Preparar no dia do ensaio e controlar o pH. 
 
Levar em banho-maria a 30
o
 C por 30 min., retirar e acrescentar 1,5 mL de solução com FeCl3. 
 
- Leitura: 540 nm. (Formação de gama-glutamil mono-hidroxamato). 
 
OBS: O CONTROLE DEVE SER FEITO SEM O ACRÉSCIMO DE ATP. 
 
 
4) PREPARO DOS REAGENTES: 
 
 
a) TAMPÃO TRIS-HCl 0.5 M pH 7.5 PM = 121.14 V = 10 mL 
 
1.0 M ________ 121,14 g/1000 mL 
0.5 M ________ 60,57 g/1000 mL 
0.5 M ________ 0.6057 g/10 mL *Antes de completar o volume acertar pH com HCl concentrado. 
 
 
50 
 
 
b) MERCAPTOETANOL 0,1 mM PM = 70.387 V = 5 mL 
 
1.0 M _______ 70.387 mL/1000 mL 
0.1 M _______ 7.0387 mL/1000 mL 
0.1 M _______ 0.035 mL/ 5 mL 
 
b) MgSO
4
 0.4 M PM = 120.37 V = 5 mL 
 
1 M ________ 120.37 g/1000 mL 
 0.4 ________ 48.148 g/1000 mL 
 x ____ 5 mL 
 x = 0.2407 g MgSO
4
/5 mL 
 
c) HIDROXILAMINA 0,1 M pH 6.5 PM = 69.49 V = 10 mL 
 
1.0 M ________ 69.49 g/1000 mL 
0.1 M ________ 6.949 g/1000 mL 
 x ___ 10 mL 
 x = 0.06949 g Hidroxilamina/10 mL *Acertar o pH 6.5 com Tris ou KOH em pastilha 
 
d) ATP 0.1 M PM = 551.2 V = 5 mL 
 
1.0 M ________ 551.2 g/1000 mL 
0.1 M ________ 55.12 g/1000 mL 
 x ___ 5 mL 
 x = 0.2756 g ATP/5 mL ou 0.11024 g ATP/2 mL 
 
d) GLUTAMATO 0.5 M pH 7.5 PM = 147.1 V = 5 ou 10 mL 
 
1 M ________ 147.1 g/1000 mL 
0.5 M ______ 73.55 g/1000 mL 
 x ____ 5 mL 
51x= 0.3677 g/5 mL ou 0.7355 g glutamato/10 mL * Acertar pH 7.5 com Tris ou NaOH. 
52 
 
ATIVIDADE DA NITRATO REDUTASE (NRA) (Javrosky, 1973). 
 
1) MEIO DE INCUBAÇÃO: 
 
- 5 mL de solução de n-propanol 2%. 
- KNO
3
 0.02 M.* 
- Tampão fosfato 0.1 M pH 7.5 
 
* Utilizado quando a NRA for medida com NO
3
 no meio de incubação "atividade potencial". 
(se o meio de incubação não contém KNO3 0.02 M será medida a "atividade inicial". 
- Após incubação por uma hora à temperatura ambiente, o nitrito produzido é determinado colorimetricamente. 
 
2) MEIO DE REAÇÃO. 
 
- 0.4 mL da solução problema. 
- 0.3 mL de sulfanilamida 1% em HCl 3 M. 
- 0.3 mL de N-naftil-etileno di-amino 0.02%. 
Deixar em repouso por 20 min. 
- Adicionar 4 mL de água e ler a 540 nm contra curva padrão de NaNO
3
. 
- Leitura: 540 
 
* A atividade da NR pode ser determinada nas amostras com NO
3
 no meio de incubação (NRA potencial) e sem 
NO
3
 no meio de incubação (NRA inicial). 
- O resultado é expresso em µmoles NO2/ g peso fresco.hora. 
 
 
 
53 
 
MEDIDA DA QUANTIDADE DE PROTEÍNA (Bradford, 1976) 
 
1) REAGENTES 
 
- 200 mg de Coomassie Blue G-250; 
- 100 mL de Etanol 95%; 
- 200 mL de Ácido Fosfórico 85%. 
 
a) Preparo da Solução: 
 
- Dissolver 200 m g de Coomassie Blue G-250 em 100 mL de Etanol 95%. 
- Acrescentar 200 mL de solução de Ácido Fosfórico 85% e completar até 2000 mL com água destilada. 
 
 
2) PROCEDIMENTO 
 
- Em um tubo de ensaio acrescentar: 
 0.1 mL do extrato protéico. 
 5 mL de solução de Coomassie Blue. 
 
- Ler após 2 minutos à 595 nm (estabilização: máximo 1 hora) 
- Leitura: 595 nm 
 
3) PREPARO DO PADRÃO DE ALBUMINA 
 
a) REAGENTES 
 
1) 500 mL de NaCl 0,15 N 
 
- Dissolver 4,38 g de NaCl e completar o volume até 500 mL com água deionizada. 
 
54 
 
 
2) Estoque de Albumina 
 
- Dissolver lentamente 100 mg de albumina e completar até 100 mL com NaCl 0,15 N. 
 
3) Preparo do Padrão de Albumina: 
 
Concentração final do 
Padrão de Albumina (g/ 
0,1 mL) 
Volume da Solução Estoque 
a ser pipetado (mL) 
Completar até 25 mL com 
NaCl 0,15 N 
 
Ex.: 2,5 mg/25 mL 10 g/ 
0,1 mL 
0 0 
10 2,5 mL 
20 5,0 mL 
40 10,0 mL 
80 20,0 mL 
100 25,0 mL 
 
BRADFORD, M. M. Rapid and sensitive method for quantitation of micro gram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. 
Analytical Biochemistry, 72:248-254. 1976. 
 
 
 
55 
 
 
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TEDESCO, M. J. Análise de Solo, Planta e Outros Minerais.UFRGS. 1995. 174p 
 
YEMM, E.W. e COCKIN G, E.C. The determination of Aminoacid with ninhydrin. Analyst, 80:209-213. 
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