Trabalho COVID

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Descrição da metodologia laboratorial de diagnóstico da COVID-19 RT-PCR: aspectos da fase pré-analítica e analítica
Ana Carolina Lima Ribeiro[footnoteRef:1] [1: Faculdade de Ceilândia, Universidade de Brasília (UnB). Brasília – DF, Brasil.] 
Resumo
Ao final de 2019, um surto de pneumonia de agente etiológico desconhecido, iniciado em Wuhan, principiou o que hoje se conhece como a pandemia do novo coronavírus. Para que o patógeno fosse devidamente erradicado, fez-se necessário conhecê-lo, bem como sua natureza e a forma como ele atua. Diante disso, alguns métodos de testagem foram desenvolvidos, possibilitando a detecção dos infectados, para que fosse possível pensar nas condutas de tratamento, além de reafirmar o isolamento do enfermo. A RT-PCR em tempo real é um dos métodos usados para detecção, sendo considerado padrão ouro. A respeito dele, podem ser considerados como pontos negativos o desconforto da coleta com o swab e as necessidades de mão de obra especializada para o manejo e de maquinário desenvolvido.
Palavras-chaves:
RT-PCR, ácido ribonucleico, diagnóstico.
1. Introdução
COVID-19 (do inglês coronavirus disease 2019) é uma doença infecciosa causada pelo novo coronavírus associado à síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2). Este é um novo betacoronavírus pertencente à grande família viral dos coronaviridae, identificado pela primeira vez em um surto de casos de pneumonia na cidade de Wuhan, província de Hubei, China, em dezembro de 2019. O SARS-CoV-2 foi caracterizado como um βCoV, envelopado de RNA de fita simples, de aproximadamente 30 kb, sendo o maior genoma viral conhecido até o momento. O genoma do SARS-CoV-2 codifica 14 poliproteínas Open Reading Frames (ORF). Na extremidade 5′, a ORF1ab é o maior gene e está envolvido na codificação de 14 proteínas não estruturais. Na extremidade 3′ estão os genes das proteínas estruturais: E (envelope); M (membrana); N (nucleocapsídeo) necessário à síntese viral, S (Spike) e HE (hemaglutinina-esterase), que permite a entrada e a infecção da célula hospedeira (Figura 1A), além dos genes de proteínas acessórias (ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF8 e ORF10).
A ordem dos genes do SARS-CoV-2 é 5′-replicase ORF1ab-S-E-M-N-3′, ORF3ab, ORF6, ORF7ab, ORF8, ORF9ab e ORF10 e está demonstrada na Figura 1B como 1a, 1b, 3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8, 9a, 9b, 10.
O diagnóstico da COVID-19, sendo ainda uma doença nova, está alicerçado na clínica do paciente, nos exames de imagem e no Figura 2. Representação esquemática da partícula viral e do genoma do β-Coronavírus. A: partícula viral; B: genoma viral
diagnóstico laboratorial. Nessa revisão, é apresentado o método laboratorial da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para diagnóstico do SARS-CoV-2, discutindo suas características de desempenho e destacando as fragilidades da capacidade diagnóstica atual.
Figura 1. Detecção de SARS-CoV-2
2. Diagnóstico laboratorial 
A RT-PCR em tempo real é considerada o padrão ouro e testa a presença de RNA viral, principalmente utilizando amostras a partir de esfregaços da nasofaringe. A técnica RT-PCR consiste em extrair o RNA de uma amostra e convertê-lo em um DNA complementar pelo método de transcrição reversa, cuja sigla “RT” vem do inglês “reverse transcription”. O DNA é então amplificado pela técnica de reação em cadeia da polimerase, do inglês “polymerase chain reaction (PCR)”.
A RT-PCR fornece importantes informações nos estágios iniciais da infecção, pois pesquisa o patógeno diretamente por meio da detecção de seu ácido nucleico, quando o objetivo é prevenir a transmissibilidade e os anticorpos ainda não foram produzidos. Permite, então, a detecção precoce e a diferenciação de outras viroses respiratórias, apresentando alta sensibilidade e especificidade, respectivamente.
A fase pré-analítica envolve a recepção, coleta e cadastramento da amostra. Há uma variedade de amostras, incluindo lavado broncoalveolar, biópsia pulmonar, escarro, esfregaço (swab) nasofaríngeo, esfregaço orofaríngeo, fezes, urina, sangue e até saliva. Os estudos têm relatado que o lavado broncoalveolar é a melhor amostra, no entanto, a coleta não é prática. O escarro também é uma ótima amostra para o diagnóstico laboratorial da COVID-19, seguida dos swabs nasofaríngeo e orofaríngeo. Por fim, a amostra que tem apresentado mais praticidade e precisão é a de swab da nasofaringe.Figura 3. Figura 3. Gráfico de quantificação de produtos de PCR em termociclador do tipo tempo real.
Na fase analítica o método envolve três etapas: 1. Extração do RNA que é realizada com um tampão de lise contendo reagentes. Por outro lado, alguns estudos têm demonstrado eficiência semelhante de protocolos de RT-PCR que não realizam a extração do RNA, encurtando o tempo de diagnóstico; 2. Transcrição reversa para obtenção do DNA complementar (cDNA) que consiste na síntese de uma fita de DNA utilizando-se como molde (template) uma fita de RNA numa reação catalisada por uma enzima denominada transcriptase reversa. Após esta etapa de 10-15 minutos a 45-50°C, obtém-se o cDNA, que será utilizado na PCR. Em seguida, a reação permanece por 3-10 minutos a 95°C para desnaturação da RT e do RNA, mas não do cDNA, e ativação da polimerase; 3. Reação em cadeia da polimerase em tempo real: A amplificação de trechos específicos do cDNA ocorre alternando-se a temperatura de ensaio entre: a) desnaturação das cadeias de RNA, mas não de cDNA; b) anelamento dos primers, usados para delimitar a sequência a ser amplificada; c) polimerização ou extensão; d) reinício do ciclo.
Na fase pós analítica a amostra é interpretada. Um resultado positivo para SARS-CoV-2 apresenta elevado valor preditivo positivo e confirma o diagnóstico de COVID-19, mesmo sem sintomatologia. Um resultado não detectado não exclui a possibilidade de infecção pelo SARS-CoV-2, uma vez que a coleta inadequada da amostra e a baixa carga viral podem resultar na presença de ácido nucleico viral abaixo da sensibilidade analítica.
Figura4. Etapas para realização do RT-PCR nos Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACEN).
Portanto, um único resultado não detectado na RT-PCR para SARS-CoV-2 em paciente sintomático não exclui o diagnóstico da COVID-19, possui baixo valor preditivo negativo e a retestagem pode ser considerada. Dois resultados negativos em 24 horas indicam a cura da COVID-19, no entanto, esse protocolo não é recomendado, pois não altera a conduta clínica caso ainda haja sinais e sintomas. 
3. Considerações finais
O desafio em torno do diagnóstico laboratorial vai desde a disponibilização dos diferentes tipos de testes, meios de coleta e análise laboratorial, até a interpretação e a condução clínica final quanto à manutenção ou não do isolamento, sobretudo no ambiente hospitalar, fundamental no gerenciamento de leitos de isolamento e necessidade de regulação destes.
Esta técnica é geralmente muito sensível (ou seja, capaz de detectar casos verdadeiros positivos) e específica (ou seja, capaz de evitar resultados falso-negativos).
A RT-PCR pode ser operada em larga escala e os resultados estão geralmente disponíveis dentro de algumas horas a dois dias.
Contudo, as técnicas moleculares exigem pessoal com conhecimento e treinamento técnico especializado para operar instrumentos sofisticados e de alto custo, devendo o laboratório atender aos requisitos de nível 2 ou mais de biossegurança. Além disso, o exame é mais efetivo apenas nos primeiros dias após o início dos sintomas e há um desconforto sentido pelo paciente na coleta das amostras.
Referências bibliográficas
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