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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA CURSO DE BIOMEDICINA DANIELLA PEREIRA GARCIA ISABELLE MONSUETH ISADORA AMARAL ALVES JÚLIA COELHO MASIERO LAURA GUIMARO CUNHA DE MEDEIROS MENINGITE BACTERIANA VALÉRIA REZENDE FERES GOIÂNIA 2021 1 Hipótese diagnóstica Conforme os sintomas do paciente de febre alta, cefaleia insistente com piora ao movimentar-se, vômitos em jato e pelo exame físico que indicou presença de petéquias com maior distribuição MMII, rigidez na nuca e sinais de Kernig e Brudzinski positivos, constatou- se meningite bacteriana como hipótese diagnóstica. A meningite caracteriza-se como um processo inflamatório do espaço subaracnóideo e das camadas pia-máter e aracnóide, que envolvem o encéfalo e a medula espinal. As causas da meningite envolvem diversos agentes infecciosos, como bactérias, vírus e fungos, e agentes não infecciosos, como traumatismo, câncer e uso de medicamentos (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE/MS, 2009). Segundo o Ministério da Saúde, há maior prevalência das meningites virais (45,4%) e as meningites bacterianas possuem maior gravidade, tendo como principais agentes a Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo B e Neisseria meningitidis. 2 Exames para diagnóstico laboratorial Após anamnese do paciente e suspeita de meningite, é realizada a análise física para verificação dos sinais meníngeos, sinal de Brudzinski e sinal de Kernig. Quando positivos, como é o caso do paciente, são indicativos de meningite, sendo necessário a realização de exames laboratoriais confirmatórios. No diagnóstico laboratorial, a cultura do líquido cefalorraquidiano (LCR) é considerada “padrão ouro” para o diagnóstico de meningite bacteriana, possibilitando identificar o agente causador. Assim, os principais exames laboratoriais realizados são os exames físico, citomorfológico, bioquímico e microbiológico (cultura e bacterioscopia) do LCR, aglutinação pelo látex (líquor e soro), CIEF (contra- imuneletroforese do líquor e soro), hemocultura, cultura dos raspados petequiais (TEIXEIRA, et al. 2018). Características elementos Resultados – MB Valores de Referência Cor Branco leitoso Incolor Aspecto Turvo Límpido Número de leucócitos 200 a milhares/µL 0 – 4/µL Neutrófilos >70% 0 - 2% Basófilos 0% 0% Eosinófilos 0% 0% Plasmócitos 0% 0% Monócitos 3% 3 a 5% Linfócitos <27% 95% Número de hemácias 0/µL (ausente) 0/µL (ausente) Proteínas totais Aumentadas >100mg/dL 10 - 45 mg/dL Glicose Diminuição <10mg/dl 50 - 80 mg/dL Lactato Aumentado > 35 mg/dL 10 – 24 mg/dL; Glutamina 12 mg/dL 8 – 18 mg/dL; Cloretos Diminuídos 680 - 750 Globulinas Positiva (Gama globulina) Negativo VDRL Não reagente Não reagente Tabela 1: Resultados do exame físico, citomorfológico e bioquímico do LCR. Bacterioscopia Geralmente positiva, apresentando a característica específica do agente encontrado. Negativa Meio de cultura Crescimento do agente em ágar chocolate suplementado Sem crescimento em ágar chocolate suplementado. Tabela 2: Resultados dos exames microbiológicos do LCR. Aglutinação do Látex A depender do anticorpo, são reagentes para pneumococo, S. agalactiae (do grupo B), Não Reagente Meningococo soro – grupo A, B, C, W135, E. coli, Hib, etc. CIEF Reagente Não Reagente Tabela 3: Resultados dos exames de aglutinação do látex e CIEF do líquor. A hemocultura e a cultura dos raspados petequiais também apresentam o crescimento do agente infeccioso responsável pela meningite bacteriana, sendo cada agente responsável por uma característica diferente. 3 Métodos e princípios dos exames apresentados 3.1 Exame físico Na execução do sinal de Brudzinski, o médico posiciona uma das mãos sob a cabeça do paciente e flexiona o pescoço. Quando positivo, ocorre a flexão espontânea dos quadris e joelhos bilateralmente. Na meningite, as meninges inflamadas causam o estiramento das raízes nervosas por meio da flexão passiva do pescoço, provocando dor e movimento involuntário dos membros inferiores (OLIVEIRA, 2020). Na realização do sinal de Kernig, com o paciente em posição de decúbito dorsal, o médico flexiona a coxa a 90° do quadril com o joelho esticado. Quando positivo, há dor, relutância e inaptidão de estender totalmente o joelho (OLIVEIRA, 2020). 3.2 Análise do Líquor A coleta do liquido cefalorraquidiano é realizada por um médico especializado, que faz a punção lombar entre os espaços de L3-L4, L4-L-5, L5-S1, suboccipital ou ventricular, em crianças, com o paciente em decúbito lateral. A recomendação é de que a amostra seja coletada e distribuída em diferentes tubos: um para a bioquímica, outro para microbiologia e testes sorológicos; um terceiro para hematologia e caso seja necessário, outros tubos para demais procedimentos (LEITE et al., 2016). O primeiro parâmetro a ser observado e descrito deve ser a aparência do LCR (cor e aspecto), que deve ser límpido, como “água de rocha”. Alterações na coloração podem ter diversas causas e significados clínicos. Em seguida, são realizados os exames laboratoriais. • Citometria – É uma técnica que com a ajuda de um laser óptico possibilita a contagem individual de células e detecção de biomarcadores em proteínas. A partir da amostra, um laser incidente mede a dispersão e a fluorescência do laser refletido, possibilitando a rápida identificação de células (BENDALL et al., 2012). É realizada a contagem de leucócitos e hemácias na câmara de Neubauer, sendo feita imediatamente após chegada ao laboratório para evitar a lise de leucócitos e das hemácias. A contagem é feita nos quatro quadrantes laterais da câmara, sendo então o número de células encontradas multiplicado pela diluição feita e dividido esse valor pela multiplicação dos quadrantes contados pelo volume total de um quadrante. O resultado é emitido em mm³ ou µL. Para valores de referência, são esperados encontrar em adultos de 0 a 4 leucócitos por µL e hemácias ausentes, podendo essas estarem normalmente presentes em casos de erro de punção. • Citologia – É realizada para contagem diferencial dos leucócitos, sendo a amostra primeiramente centrifugada e concentrada antes da preparação do esfregaço corado. São contadas 100 células. Os valores dos componentes celulares considerados normais são: Linfócitos: 95%; Monócitos: 3 – 5%; Neutrófilos: 0 – 2%; Eosinófilos: 0%; Basófilos: 0% e Plasmócitos: 0%. • Cultura LCR – É um exame de grande importância para o diagnóstico e acompanhamento das doenças neurológicas. feita a semeadura em tubo inclinado com cinco gotas do LCR em meio de ágar chocolate. A amostra semeada é incubada por 24 h a 35±2ºC em condições de 5 a 7% de CO2. Desde que não ocorra crescimento bacteriano tendo passado um dia de incubação, a amostra é incubada por mais 24h antes de liberar o resultado negativo. • Testes bioquímicos – A cultura de LCR também é utilizada para análise e teste dos seguintes parâmetros: Glicose: Essa concentração pode ser útil para distinguir entre a meningite bacteriana, sendo que mais de 50% dos pacientes apresentam diminuição da concentração de glicose, enquanto os pacientes com meningite viral geralmente apresentam níveis dentro do esperado (42 a 78 mg% em recém-nascidos e 50 a 80 mg% em adultos). Em condições normais sua concentração no LCR corresponde a cerca de dois terços da glicemia, portanto, dependente diretamente dos níveis de glicose no sangue e também de sua taxa https://pt.wikipedia.org/wiki/Meningite_viral https://pt.wikipedia.org/wiki/Meningite_viral de metabolismo no sistema nervoso central. Dessa forma, a avaliação simultânea dos níveis de glicose no soro e no LCR se faz necessária. A condição chamada de hipoglicorraquia é comum em casos de meningite, uma vez que esta baixa concentração de glicose se dá peloseu consumo pelos microrganismos presentes. Já níveis elevados não possuem significado clínico, refletindo somente o aumento dos níveis da glicemia sistêmica. Proteínas: No LCR são constituídas em grande parte de albumina e em muito menor quantidade de globulinas do tipo IgG. A dosagem de proteínas no estágio inicial da meningite se encontra elevada (>40 mg/100 mL), pois devido à inflamação das meninges podem ocorrer danos à barreira hematoencefálica e até seu rompimento. A medida que o processo inflamatório se reduz, a concentração de proteína também se reduz, em associação com a pleocitose, ou seja, o aumento do número de leucócitos. Dependendo do local da punção, há diferentes valores referência para proteínas. Lactato: Os níveis de lactato no LCR, diferentes dos níveis de glicose, não estão relacionados à concentração sanguínea, mas à sua produção no canal raquideano. Seus níveis aumentados ocorrem devido à uma destruição do tecido dentro do sistema nervoso central, causado pela privação de oxigênio. Essa elevação pode ser detectada mais cedo do que uma concentração reduzida de glicose. Por isso, para a diferenciação de meningite bacteriana e uma viral, a concentração de lactato mostra-se como um melhor indicador quando comparado à outros. Níveis superiores a 35 mg/dL são vistos como meningite bacteriana, enquanto na meningite viral o lactato permanece abaixo de 25 mg/dL. Estes permanecem altos durante o início do tratamento, mas caem rapidamente quando o tratamento for bem-sucedido, deve forma também servem como método sensível de avaliação para a eficácia da terapia antibiótica. Cloretos- Seus níveis no LCR relacionam-se com a pressão osmótica exercida pelo equilíbrio ácido-básico e o meio intracelular. Apresentam-se normais nos primeiros estágios da doença e decrescem na fase tardia, com concentração menor que 680 mg%. • Bacterioscopia – Diante dos métodos diagnósticos em bacteriologia, um deles se destaca por ser simples, rápido e de baixo custo: a coloração de Gram. Para ela, é necessário fazer, com a ajuda de uma alça de palatina, o esfregaço e sua fixação pelo calor, sendo necessário passar a lâmina pelo menos 3 vezes sob a chama. Depois, inicia-se a coloração deixando a lâmina 1 minuto coberta em cristal de violeta. Lava-se essa lâmina com água corrente e a coloca em Lugol 1% por 1 minuto. Novamente lava-se essa lâmina com água corrente. Depois, aplica-se o agente diferenciador álcool 95%, deixando a lâmina coberta de 10 a 20 segundos. Posteriormente coloca-se a lâmina nos corantes fucsina ou safranina por 30 segundos e lava-se com água corrente. Por último, observa-se o resultado em microscópio ótico, com objetiva de 100x. A parede celular de bactérias Gram-negativas possui uma camada mais fina de peptídeoglicanos, além de outra camada composta por lipídeos e proteínas. Por isso, ao fazer a metodologia, o álcool 95% consegue solubilizar essa camada e a coloração roxa (do cristal violeta) é perdida. Depois, há uma segunda coloração, com fucsina ou safranina, que cora essa bactéria com as cores rosa ou vermelho. Já a parede celular de bactérias Gram-positivas possui apenas uma camada mais espessa de peptideoglicanos, e por isso apenas se coram pela primeira vez com o cristal violeta e não perdem a coloração roxa mesmo com a adição do álcool 95%. • Aglutinação pelo látex – Este método detecta antígenos bacterianos no líquor, permitindo diagnóstico rápido de meningites. As partículas do látex são sensibilizadas com anticorpos específicos e a reação antígeno/anticorpo permite uma visualização de aglutinação positiva na presença de antígenos específicos. Resultados falso-negativos podem ocorrer, pois a concentração dos antígenos depende do número de bactérias, duração da infecção e presença ou ausência de anticorpos específicos. • Contraimunoeletroforese (CIEF): Esta é uma técnica amplamente utilizada no Brasil para o diagnóstico laboratorial indireto de meningites causadas por Neisseria meningitidis (Men) dos sorogrupos A, B e C e Haemophilus influenzae (Hi) tipo b, desde a década de 1970. Basea-se na detecção de antígenos polissacarídicos que envolvem a cápsula da bactéria presente na amostra clínica por uso de antissoros hiper imunes produzidos em cavalos ou carneiros. Ela é feita em fita de acetato de celulose empregando-se antissoros policlonais contra Men A, B, C ou Hib produzidos em cavalos ou carneiros e corrida em tampão de Tris-Acetato 0,05 M, pH 8,6. Após a corrida (10 minutos a 200 V), as fitassão lavadas com solução salina e coradas com solução de 5 Ponceau S a 0,5% (p/v). É necessário fazer uma confirmação utilizando técnicas como a aglutinação por látex ou RT-PCR. 3.3 Hemocultura A hemocultura é o exame feito quando se busca isolar e identificar microrganismos patogênicos (principalmente bactérias e fungos) no sangue de um paciente que se supõe ter uma infecção. Para a realização da hemocultura é necessário fazer uma punção venosa e inocular essa amostra em frascos de hemocultura. Após a inoculação nos frascos, incuba-se o frasco por pelo menos 7 dias, contendo anticoagulantes e um meio de cultura rico em nutrientes. Durante esse tempo de incubação, é feita uma inspeção visual diária buscando encontrar evidências de crescimento de bactérias, como a turvação do meio, presença de colônias crescendo na camada de sangue sedimentada, presença de hemólise ou produção de gás. Se alguma evidência for relatada, é necessário fazer uma cultura (em ágar sangue ou chocolate) e a partir dela, fazer todos os passos e provas bioquímicas para a identificação do agente etiológico. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANVISA. Bactérias gram-positivas. Módulo 4. Disponível em: https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4/isol_str e6.htm. Acesso em: 20 abr. 2021. BRAGA, Karla Márcia da Silva; et al. Citometria de fluxo: histórico, princípios básicos e aplicações em pesquisa. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer, v.13 n.23; p. 304. Goiânia, 2016. Disponível em: <http://www.conhecer.org.br/enciclop/2016a/agrarias/citometria.pdf>. Acesso em: 21 abr. 2021. Brasil. 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